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摘要：本论文使用化学还原法合成银纳米颗粒（Silver nanoparticles，AgNPs），通过透射电镜鉴定了其形态大小。为了探究XPF的作用，选用XPF基因点突变的XP-F细胞和正常人体细胞L02细胞作为实验对象，测定生存率，发现AgNPs具有细胞毒性，与咖啡因共同作用能够明显增加毒性作用。咖啡因加入后，SOD2的转录在XP-F细胞中发生了降低，使得XP-F细胞缺少应对AgNPs引起的氧化压力的能力。
在咖啡因刺激下，L02细胞中p53下游基因hRRM2B、MDM2和p21的转录降低，XP-F细胞的这三种基因转录均无变化；Western Blot结果表明XP-F细胞中p53（Ser15）磷酸化水平稳定，L02细胞中p53（Ser15）磷酸化水平极低难以检测，这说明XPF基因涉及人体细胞的p53调控网络，并通过降低p53蛋白的活性从而抑制p53下游基因的转录。
关键词：银纳米颗粒；咖啡因；XPF；p53；核苷酸还原酶；ROS
AgNPs独特的抗菌及粒子特性[1]，在医药医疗、日用化妆等方面的应用日渐广泛，但多数金属纳米粒子对哺乳动物细胞都具有毒害作用[2]。而咖啡因又是多种药物、饮食中重要添加成分，有研究发现咖啡因可促进细胞受到紫外线刺激后的凋亡[3]，减少肿瘤的发生[4]。但暴露于AgNPs 的刺激下，同时摄入咖啡因，对人体细胞的影响尚属未知。有研究报道AgNPs可以与人体DNA链结合，阻碍细胞正常复制和转录[2，5]，其产生的活性氧自由基（ROS）也会直接攻击DNA及线粒体等细胞组分[6]。XPF又是DNA核苷酸切除修复方式的重要因子[7]。本论文通过使用XPF基因点突变的XP-F细胞，以人体正常细胞L02为对照，探究了XPF在人体细胞应对AgNPs与咖啡因的刺激下发挥的作用。
1.材料和方法
1.1细胞系
HeLa（人宫颈癌上皮细胞）和L02（人正常肝脏细胞）购自中国科学院细胞库；XP-F（XPF基因点突变成纤维细胞）购自美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）。所有细胞系均按照说明使用含有10%胎牛血清的培养液常规培养。
1.2AgNPs的制备与表征
将0.017g硝酸银与0.5g PVP溶于100 mL蒸馏水，加热至沸腾，加入0.1g柠檬酸钠，反应至溶液变棕绿色。使用透射电子显微镜（日本精工）拍照观察。
1.3AgNPs与咖啡因处理与集落形成能力实验
细胞胰蛋白酶消化后计数，接种至培养皿，加入咖啡因和AgNPs处理48h。培养14天左右，0.1%结晶紫染液染色计数。
1.4总RNA的提取与逆转录
TRIzol（Invitrogen）法提取RNA。根据PrimeScript RNA逆转录试剂盒（Takara）进行逆转录反应。
1.5实时荧光定量PCR
按照Roche公司FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）荧光定量PCR预混液说明书进行。引物设计如下：
3.结论
本论文为了验证XPF在人体细胞应对AgNPs与咖啡因刺激中的作用，使用AgNPs与咖啡因处理XP-F细胞L02细胞48h，结果表明L02细胞对AgNPs单独处理的毒性较XP-F细胞有抗性，XP-F细胞则对咖啡因更敏感。
XP-F细胞且不能调动SOD2来降低AgNPs所引起的ROS造成的损伤。L02细胞中p53下游的基因hRRM2B，MDM2与p21的转录被咖啡因抑制，XP-F细胞中则未出现该现象。通过Western Blot发现XP-F细胞中p53（Ser15）磷酸化水平始终处于较稳定水平，这些数据证明细胞应对AgNPs和咖啡因时，若XPF发生突变，则无法抑制p53（Ser15）磷酸化，使p53处于激活状态，促进其下游基因的转录。该论文对XP病患者、肿瘤患者，乃至正常人群的药物使用及开发和饮食保健等方面提供了重要的参考内容。
参考文献：
[1]Morones J R，Elechiguerra J L，Camacho A，et al.The bactericidal effect of silver nanoparticles..Nanotechnology，2005，16（10）：2346-2353.
[2]Wang Z，Liu S，Ma J，et al.Silver nanoparticles induced RNA polymerase-silver binding and RNA transcription inhibition in erythroid progenitor cells.ACSnano，2013，7（5）：4171-4186.
[3]Lu YP，Lou YR，Li XH，et al.Stimulatory Effect of Oral Administration of Green Tea or Caffeine on Ultraviolet Light-induced Increases in Epidermal Wild-Type p53，p21（WAF1/CIP1），and Apoptotic Sunburn Cells in SKH-1 Mice.Cancer Research，2000，60：4785–4791.
[4]Lou YR，Lu YP，Xie JG，et al.Effects of oral administration of tea，decaffeinated tea，and caffeine on the formation and growth of tumors in high-risk skh-1 mice previously treated with ultraviolet b light.Nutrition and cancer，1999，33：146–153.
[5]An H，Jin B.Prospects of nanoparticle–DNA binding and its implications in medical biotechnology.Biotechnology Advances，2012，30：：1721–1732.
[6]Bartłomiejczyk T，Lankoff A，Kruszewski M，et al.Silver nanoparticles – allies or adversaries? Annals of Agricultural and Environmental Medicine 2013，20（1）：48-54.
[7]Tsodikov OV，Enzlin JH，Schärer OD.Crystal structure and DNA binding functions of ERCC1，a subunit of the DNA structure-specific endonuclease XPF-ERCC1.Proceedings of the National Academy of Sciences，2005，102（32）：11236-11241.
论文作者:王子天
论文发表刊物:《健康世界》2015年1期
论文发表时间:2015/9/11
标签：细胞论文; 咖啡因论文; 转录论文; 基因论文; 磷酸化论文; 作用论文; 逆转录论文; 《健康世界》2015年1期论文;