蔡铭煌 林云娇 王露露 吴洁 游小芳 陈立典
（福建中医药大学康复医学院 福建 福州 350122）
【摘要】目的：探讨电针对缺血再灌注损伤大鼠神经细胞增殖相关因子表达的影响。方法：将SD大鼠随机分为3组，假手术组、模型组、电针组。电针曲池、足三里穴干预7天。采用免疫组化、免疫印记评估大鼠神经细胞增殖情况。结果：电针7天后促进缺血侧室管膜下区Ki-67阳性细胞数量增加 (P<0.05），Cyclin D1、CDK 4蛋白表达水平升高，而p16表达水平降低（P<0.05）。结论：电针促进缺血再灌注损伤室管膜下区神经细胞增殖。
【关键词】电针；缺血再灌注损伤；神经细胞增殖
【中图分类号】R246 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2016）08-0349-02
随着脑内反应性胶质细胞、神经前体细胞/祖细胞与神经干细胞、的发现与深入研究，神经细胞增殖为脑缺血损伤后神经再生修复和脑功能恢复带来新的希望。细胞周期的有序运转是通过细胞周期的“发动机”即细胞周期蛋白(Cyclins)与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDKs）复合物来实现的，而另一类蛋白因子—周期素依赖蛋白激酶抑制因子（CKIs）则抑制CDKs的活性，在细胞周期中起负调控作用，引起细胞周期休止。此外，核蛋白Ki-67作为一个细胞增殖的标记物。针刺疗法是最具代表性的“非药物”替代与补充治疗手段，被广泛运用于脑血管疾病领域。因此，本文试图探讨电针对神经细胞增殖相关因子表达的影响。
1.材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康雄性SD大鼠，体重（250～300g），由福建中医药大学动物实验中心提供。根据随机的原则，将30只大鼠随机分为3组，假手术组、模型组、电针组，每组10只大鼠。
1.2 实验试剂
TTC试剂（Sigma公司，美国)；p16（CST公司，美国）、CyclinD1（Abcam公司，英国）、CDK4（Abcam公司，英国）等。
1.3 MCAO造模
在室温22℃条件下，大鼠称重后，参考Koizumi线栓法，行左侧MCAO手术，制备急性脑梗死动物模型。假手术组只分离血管，不结扎、插线。动物苏醒后观察其体态及行为，以判断MCAO模型成功，将不合格的动物剔除。
1.4 电针干预
电针组大鼠在造模后第一天即开始电针干预。采用大鼠固定装置固定，所有电针组大鼠取患侧“曲池”、“足三里”穴，穴位定位参考《实验针灸学》。局部消毒后，用华佗牌30号0.5寸毫针，斜刺0.2～0.3cm，接G6805型电针仪，电压峰值6V，以大鼠肢体轻轻抖动为度，选用疏密波，频率2Hz，电针时间20min。电针干预7天。假手术组及模型组同时以同样的方法固定20min，但不予以电针刺激。
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1.5 行为学评分
采用Zea-longa评分[5]方法，当造模大鼠清醒后，即评定动物神经功能缺损。具体评分标准为：0分：无神经功能缺损体征；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向偏瘫侧转圈；3分：行走时向偏瘫侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。评分为1～3分纳入实验动物，0分、4分予以剔除。[1]
1.6 免疫组化和免疫印记检测
常规石蜡包埋，细胞增殖的核抗原（Ki-67）一抗孵育，滴加相应二抗，DAB显色，苏木素复染。免疫印记检测各组大鼠室管膜下区中细胞增殖相关因子的表达。
2.统计学分析
数据以均数±标准差表示，应用SPSS18.0进行统计学分析处理，计量资料行f检验或t检验。
3.实验结果
3.1 电针“曲池”、“足三里”穴对MCAO大鼠神经缺损功能评估的影响
本实验通过探讨电针“曲池”、“足三里”穴对MCAO大鼠神经缺损功能评分的改变，揭示电针“曲池”、“足三里”穴对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。实验结果显示脑缺血再灌注2h后，各组之间的行为学5分评分无显著性差异。而电针组7天后脑缺血再灌注的神经缺损评分明显降低。
3.2 电针“曲池”、“足三里”穴对大鼠缺血侧室管膜下区细胞增殖的影响
免疫组化Ki-67阳性表达呈棕色或棕褐色，定位于细胞核内，是细胞增殖的指标之一。结果显示：与假手术组（1.65±0.33%）相比，模型组缺血侧室管膜下区Ki-67阳性细胞数（7.88±2.33%）显著性增加（P<0.05）。而电针7天后，缺血侧室管膜下区Ki-67阳性细胞数量（12.56±1.73%）进一步增加 (P<0.05）。
3.3 电针曲池、足三里穴对大鼠缺血侧室管膜下区细胞增殖相关因子表达的影响
缺血再灌注损伤后模型组大鼠缺血侧室管膜下区Cyclin D1、CDK 4的表达水平较假手术组升高（P<0.05或P<0.01），而P16的表达降低（P<0.05）；电针治疗7天后缺血侧室管膜下区Cyclin D1、CDK4的蛋白表达水平较模型组进一步升高（P<0.05），而P16的表达无统计学差异（P>0.05）。
4.讨论
神经细胞周期的时相，Gl期（DNA及蛋白质合成准备期），S期（DNA合成期），G2期（有丝分裂准备期和M期（有丝分裂期）。研究已证实Ki-67在细胞增殖各个周期中均表达。本文研究发现电针曲池、足三里穴能够促进缺血侧室管膜下区ki-67阳性神经细胞增殖。已有研究表明Cyclin D1在细胞周期中首先被合成，在G1期中至晚期合成，并达到高峰，它与CDK4形成复合物Cyclin D1/CDK4，该复合物能摄取大量磷酸基团，并将它们转移到控制细胞周期“调控点”的重要分子上，促进S期基因产物的转录表达。
【参考文献】
[1] Tao J, Zheng Y, Liu W, et al. Electro-acupuncture at LI11 and ST36 acupoints exerts neuroprotective effects via reactive astrocyte proliferation after ischemia and reperfusion injury in rats. Brain Res Bull. 2015,120:14-24.
课题：电针促进脑缺血后内源性NSCs增殖分化的机制研究 国家自然科学基金（81273835）
论文作者:蔡铭煌,林云娇,王露露,吴洁,游小芳,陈立典
论文发表刊物:《医药前沿》2016年3月第8期
论文发表时间:2016/5/16
标签：电针论文; 细胞论文; 大鼠论文; 曲池论文; 侧室论文; 神经细胞论文; 周期论文; 《医药前沿》2016年3月第8期论文;