李俊平[1]2016年在《益气活血安神法通过抑制钙超载减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的实验研究》文中研究指明研究背景再灌注治疗是冠心病急性心肌梗死(AMI)治疗史上里程碑式的进展,其手段主要有三种：静脉溶栓、经皮冠状动脉腔内成形及支架植入术(PTCA+PCI).冠脉旁路移植术(CABG),随着介入器械和技术的日臻成熟,PCI已成为治疗冠心病AMI的主要手段。但是,再灌注治疗只是一种局部治疗手段,并不能终止冠心病的病理发展进程,加之治疗后出现的一系列心肌缺血再灌注损伤(MIRI),严重制约了冠心病的治疗效果。在MIRI过程中炎症反应、氧化损伤、钙超载及能量利用障碍等都发挥着重要作用,其中钙超载是造成心肌细胞损伤和死亡的共同通路,故防治钙超载是减轻MIRI的重要举措。目前针对MIRI的西医干预多限于实验研究,很多药物尚未应用于临床,只有苯磺酸氨氯地平防治其他器官(如肝脏、卵巢)再灌注治疗后钙超载的实验报道。但由于苯磺酸氨氯地平是通过作用于血管平滑肌的L型Ca通道从而抑制钙超载,存在作用靶点单一、可明显抑制心肌细胞收缩功能,副作用较大,故临床应用有一定局限性。中药也有钙拮抗作用,但其具体作用特点及机制与临床常用有效西药钙通道阻滞剂苯磺酸氨氯地平(络活喜)的异同未见报道。基于心肌缺血再灌注损伤的中医病因病机,结合多年临床经验导师创制出益气活血复方(以下简称复方),功在益气活血,凉血安神,其主要组成为黄芪、丹参、三七、银杏、酸枣仁等提取物。围绕“防治钙超载”和“保护心功能抑制心室重构”这两大目标,进行益气活血复方对心肌缺血再灌注大鼠心肌损伤保护作用及机制的研究,拟为益气活血复方防治MIRI特色和优势分析提供实验依据。目的观察益气活血复方对心肌缺血再灌注损伤大鼠心室早期重构、心脏射血分数、和心肌梗死区／缺血区比例的影响；并从1miRNA-133调控钙超载及细胞凋亡角度探讨益气活血复方的作用机制。方法225只雄性Wistar大鼠,体重为300±20g,随机分为假手术组、模型组、络活喜组、益气活血复方高、中、低剂量6组,预防性给药7天后,结扎大鼠心脏冠脉左前降支,50min后复灌,制作大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。分别于造模前、造模后及复灌48h行心脏射血分数及心室内径检测,后处死大鼠,取血,离心取血清,剪取心脏,以依文思蓝-TIC双染色评估心肌梗死区与缺血区面积百分比,据此选择益气活血复方最优剂量进行后续机制探讨。每组取6只大鼠,行HE染色及TUNEL染色,取缺血区心肌组织,比色法检测心肌钙离子含量,Western blot法检测左心室缺血区心肌组织SERCA、CasR、MAPK通路、CytC、Caspase-3及Bcl-2蛋白的表达,Real-Time PCR法检测大鼠左心室缺血区心肌组织miRNA-133的表达。结果(1)心脏EF值：①造模术后：与假手术组相比,其余5组EF值均有不同程度的降低,差异具有统计学意义(P<0.05)；余各组间无差异。②复灌48h：模型组较造模术后EF值明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),余各组均有不同程度升高,但较造模术后无差异。③复灌48h：与假手术组相比,各组心脏EF值均有显著下降,差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比,益气活血复方高、中、低剂量组均能显著提高EF值,差异具有显著统计学意义(P<0.05),但三者之间无差异；络活喜组与模型组无明显差异。(2) LVIDd及LVIDs: ①LVIDd:与假手术组相比,模型与低剂量组LVIDd明显增大,差异具有统计学意义(P<0.05)；余各组与假手术无明显差异。与模型组相比,高剂量组LVIDd显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)；余络活喜、中剂量及低剂量与模型组无差异。②LVIDs:与假手术组相比,模型组LVIDs显著增大,差异具有统计学意义(P<0.01);余各组间无明显差异。与模型组相比,高剂量及中剂量组LVIDs显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01),但二者之间无差异。(3)心肌梗死／缺血区比率(梗死区／缺血区比率大于30%小于60%)：与模型组相比,络活喜及高剂量组均能显著减小心肌梗死／缺血区比率,差异具有统计学意义(P<0.05)；但络活喜及高剂量两组间无明显差异。(4)心肌组织钙含量：与假手术组相比,模型组钙离子显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)；络活喜及高剂量组含量显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),但络活喜及高剂量二者组间无明显差异。(5)对SERCA2A及CasR表达的影响：①SERCA2A与假手术相比,模型组心肌SERCA2A表达水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)：与模型组相比,络活喜和高剂量组表达水平均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01),但络活喜和高剂量组间无明显差异。②CasR:与假手术组相比,模型、络活喜及高剂量组CasR表达水平显著升高,差异具有显著统计学意义(P<0.01)；与模型组相比,高剂量组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01);高剂量与络活喜组相比,心肌CasR表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。(6)心肌细胞凋亡检测：与假手术相比,各组心肌凋亡指数均有显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比,络活喜及高剂量均能显著降低心肌凋亡指数,差异具有统计学意义(P<0.01),但二者组间无明显差异。(7)对CytC、Caspase-3及Bcl-2表达的影响：①CytC:与假手术相比,模型及高剂量组心肌CytC表达均有明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)；络活喜与假手术之间无明显差异：与模型组相比,络活喜及高剂量组均有明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),但络活喜与高剂量组间无明显差异。②CasPase-3:与假手术相比,模型、络活喜及高剂量组CasPase-3表达均有明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比,络活喜及高剂量组均有明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01),但络活喜与高剂量组间无明显差异。③Bcl-2：与假手术相比,模型和络活喜组均有明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01),高剂量与假手术组间无差异；与模型组相比,络活喜和高剂量组均有明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)：与络活喜组相比,高剂量组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。(8)对P38、JNK、ERK1/2表达的影响：①P38：与假手术相比,模型、络活喜及高剂量组P38表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比,络活喜和高剂量组显明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01);络活喜与高剂量组间无明显差异。②.JNK：与假手术组相比,模型组表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)；余各组间无明显差异。③ERK1/2：与假手术相比,模型、络活喜及高剂量组ERK1/2表达水平均有明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比,络活喜组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)；与络活喜组相比,高剂量组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。(9)对miRNA-133表达的影响：与模型组相比,假手术、络活喜及高剂量组miRNA-133表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)；与假手术相比,络活喜及高剂量组无明显差异;络活喜与高剂量组之间无明显差异。结论(1)益气活血复方和络活喜均可减小大鼠心肌缺血再灌注损伤时心肌梗死面积；此外益气活血复方还能提高再灌注引起的心脏EF值降低、抑制LVIDd、LVIDs的增大,从而抑制MIRI早期左心室的恶性重构,改善心功能,其综合效应明显优于络活喜。(2)益气活血复方能抑制心肌缺血再灌注损伤钙超载,并减轻钙超载引起的线粒体途径的心肌细胞凋亡。(3)益气活血复方可能通过上调miRNA-133水平、调节p38MAPK通路来发挥保护受损心肌的作用。
王强[2]2012年在《迷走神经刺激后处理对大鼠在体心肌缺血—再灌注损伤的保护作用及机制的实验研究》文中指出背景研究表明,在急性心肌缺血恢复血流灌注后,由缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)所致的心肌梗死后死亡率仍然高达10%。动物实验亦发现,心肌缺血时高达50%的最终心肌梗死面积是归因于IRI。目前,已经公认缺血预处理是最为强大的内源性心肌保护干预措施。然而,由于心肌缺血事件的不可预测性,所以在临床实践中很难对其采取预先干预措施。因此,除了能够在实施心脏手术的患者选择性应用之外,缺血预处理的临床应用价值十分有限。缺血后处理则解决了临床干预时机选择的问题,而且其也已被证明具有确切的心肌保护作用。但是,诸如反复阻塞冠状动脉这样的操作有导致病变冠状动脉破裂或粥样斑块脱落等并发症的高度风险,故其临床应用价值也十分有限。相比之下,肢体远隔缺血后处理则能够避免在心脏直接进行操作,而且大量研究表明其对心肌IRI具有明确的保护作用。此外,肢体远隔缺血后处理还具有安全、实施简单和费用低廉等优点。因此,肢体远隔缺血后处理不失为临床治疗心肌IRI的一种较佳选择。现已明确,炎症反应在心肌IRI的发生和发展过程中发挥着极为重要的致病作用,并且调节炎症反应可以减轻心肌IRI。晚近研究发现,迷走神经同样具有免疫炎症调节功能,其激活后能够通过胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway)而实现对炎症反应的调控。在内毒素血症、结肠炎、风湿性关节炎和IRI等炎症性疾病时,迷走神经刺激能够通过抑制炎症细胞募集和炎症细胞因子释放而调控炎症反应,进而发挥其保护作用。虽然已经证实迷走神经刺激能够减小IRI所致的心肌梗死面积,但是目前尚无研究系统观察迷走神经刺激后处理对心肌缺血-再灌注损伤时心肌局部与全身炎症反应的影响。联合应用不同的干预措施以获得有益的强效心肌保护效果一直是心肌IRI保护研究领域的重要方向,而且迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理是两种作用机制明显不同的心肌保护干预措施。因此,我们设计了这个随机对照实验,主要目的包括：①观察迷走神经刺激后处理对心肌IRI保护的有效性、可用性和最佳干预时间；②评价将迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理这两种极具临床应用前景的简单干预措施联合应用能否获得有益的协同性心肌保护作用；③观察PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路在迷走神经刺激后处理、肢体远隔缺血后处理、联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理心肌保护作用中的地位,以探索不同心肌保护干预措施的内在作用机制。本实验分为三个部分：第1部分：迷走神经刺激后处理对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用及其最佳干预时间的研究第1部分实验的目的是采用大鼠在体心肌IRI模型比较性观察在不同时间点应用迷走神经刺激后处理对心肌IRI及其炎症反应的影响,以确定迷走神经刺激后处理的心肌保护作用及其最佳干预时间。将140只体重290～320g的成年雄性Sprague Dawley (SD)大鼠麻醉后随机平均分为七组(每组20只)：空白对照组(S组)；对照组(C组)；缺血预处理组(IPC组)；心肌缺血15min迷走神经刺激后处理组(POESI15组)；再灌注前迷走神经刺激后处理组(POESRO组)；再灌注30min迷走神经刺激后处理组处理组(POESR30组)；再灌注60min迷走神经刺激后处理组(POESR60组)。所有大鼠开胸后采用丝线将其冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery, LAD)套扎做成活结。除S组之外,所用大鼠均接受局部心肌缺血30min(阻断LAD)和再灌注120min(开放LAD)的处理。C组不采用任何其他干预措施；IPC组在结扎LAD前进行3个循环的缺血预处理,每个循环是由5min的LAD阻断和5min的LAD开放组成,总处理时间是30min; POESI15、POESR0、POESR30和POESR60组是分别在心肌缺血15min时、心肌再灌注前即刻、心肌再灌注30min时和心肌再灌注60min时对大鼠的右侧迷走神经进行电刺激,持续时间为30min。实验过程中,连续监测心率(heart rate, HR)、平均动脉压(mean arterial pressure, MAP)和Ⅱ导联心电图(electrocardiogram, ECG),并保持大鼠直肠温度在36.5～37.5℃之间。然后,将每组大鼠进一步随机平均分为2个亚组(每亚组10只),第1亚组在再灌注30min、60min和120min时抽取血液标本,采用大鼠专用试剂盒分别测定血清心肌肌钙蛋白I (cardiac troponin-I, cTnI)、肌酸激酶心肌型同工酶(myocardial-bound creatine kinase, CK-MB)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、高迁移率组蛋白1(high mobility group box1protein, HMGB1)、细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule1, ICAM1)、白介素-1(interleukin-1, IL-1)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)和白介素-10(interleukin-10, IL-10)的浓度；在实验结束时,采用伊文思蓝和氯化三苯基四氮唑双重染色技术检测心肌梗死面积(infarct size, IS%)。在实验结束时,第2亚组用于检测缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织TNF-α、HMGB1、ICAM1、IL-1、IL-6和IL-10的含量。结果显示,各组大鼠的一般情况和心肌缺血前血流动力学参数的基础值比较差异无显著统计学意义。与S组、C组或IPC组相比,POESI15组的HR在缺血期和再灌注期间均明显降低,POESRO组、POESR30组和POESR60组的HR在再灌注期间明显降低。与S组相比,C组、IPC组、POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组在缺血期和再灌注期的MAP和心率血压乘积(rate-pressure product, RPP)均明显降低。与IPC组相比,C组、POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组缺血期发生室性心律失常的大鼠数目明显增多,而且缺血期室性心律失常评分亦明显增高。与C组相比,IPC组、POESI15组和POESRO组再灌注初期发生室性心动过速(ventricular tachycardia, VT)的大鼠数目明显减少,而且再灌注初期室性心律失常评分亦明显降低。与C组相比,IPC组、POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组的IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度均明显降低；与IPC组相比,POESI15组、POESRO组.POESR30组和POESR60组的IS%值均明显增高；与POESI15组相比,POESR60组的IS%值、血清cTnI、CK-MB浓度明显增高,POESRO组和POESR30组的IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度无显著统计学差异；与POESRO组相比,POESR60组的IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度明显增高,POESR30组的IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度无显著统计学差异；与POESR30组相比,POESR60组的IS%值、血清CK-MB浓度无显著统计学差异。与S组相比,C组再灌注30min、60min和120min时血清TNF-a浓度明显增高；C组、IPC组和POESI15组再灌注60min时血清HMGB1浓度,C组、POESRO组、POESR30组和POESR60组再灌注120min时血清HMGB1浓度明显增高；C组、POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组再灌注120min时血清ICAM1浓度明显增高；C组、IPC组、POESRO组、POESR30组和POESR60组再灌注120min时血清IL-1的浓度明显增高；C组、IPC组、POESR30组和POESR60组再灌注120mmin时血清IL-6浓度明显增高；POESI15组再灌注120min时血清IL-10浓度明显增高。与C组相比,IPC组和POESI15组再灌注30min和60min时血清TNF-a浓度明显降低；IPC组、POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组再灌注120min时血清TNF-α、HMGB1、ICAM1、IL-1、IL-6浓度明显降低。与IPC组相比,POESI15组再灌注60mmin时血清TNF-a浓度明显增高；POESR60组再灌注120min时血清TNF-a浓度明显增高；POESRO组、POESR30组和POESR60组再灌注120min时血清HMGB1和ICAM1浓度明显增高;POESI15组再灌注120mmin时血清IL-1的浓度明显降低；POESI15组和POESRO组再灌注120min时血清IL-6浓度明显降低。与POESI15组相比,POESRO组、POESR30组和POESR60组再灌注120min时血清HMGB1和ICAM1的浓度明显增高；POESR60组再灌注120min时血清IL-1、IL-6和TNF-a的浓度明显增高。与POESRO组相比,POESR60组再灌注120min时血清HMGB1、IL-6和TNF-a的浓度明显增同；POESR30组和POESR60组再灌注120min时血清ICAM1浓度明显增高。与POESR30组相比,POESR60组再灌注120min时血清HMGB1、ICAM1和TNF-α浓度明显增高。与S组相比,C组缺血区心肌组织TNF-α和HMGB1含量明显增高,IPC组缺血区心肌组织TNF-α含量明显降低；C组和POESR60组非缺血区心肌组织TNF-a含量明显增高；C组非缺血区心肌组织HMGB1含量明显增高,IPC组、POESI15组、POESRO组和POESR30组非缺血区心肌组织HMGB1含量明显降低；C组、POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组缺血区心肌组织ICAM1、IL-1和IL-6含量明显增高；C组和POESR60组非缺血区心肌组织ICAM1和IL-6含量明显增高,IPC组、POESI15组和POESRO组非缺血区心肌组织ICAM1含量明显降低；C组、IPC组、POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组非缺血区心肌组织IL-1含量、缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织IL-10含量明显增高；IPC组和POESI15组非缺血区心肌组织IL-6含量明显降低。与C组相比,IPC组、POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织TNF-α、HMGB1、IL-1和IL-6含量明显降低；POESI15组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织IL-10含量明显增高。与IPC组相比,POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组缺血区心肌组织TNF-a含量明显增高；POESI15组非缺血区心肌组织HMGB1含量明显降低,POESR60组非缺血区心肌组织HMGB1含量明显增高；POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组缺血区心肌组织ICAM1含量明显增高；POESR30组和POESR60组非缺血区心肌组织ICAM1、缺血区IL-6含量明显增高；POESRO组、POESR30组和POESR60组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织IL-1、非缺血区心肌组织IL-6含量明显增高。与POESI15组相比,POESR30组和POESR60组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织TNF-a含量、非缺血区心肌组织ICAM1含量、缺血区心肌组织IL-1含量明显增高；POESR60组缺血区心肌组织HMGB1、IL-6含量明显增高,缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织IL-10含量明显降低；POESRO组、POESR30组和POESR60组缺血区心肌组织ICAM1含量、非缺血区心肌组织HMGB1、IL-1和IL-6含量明显增高。与POESRO组相比,POESR60组缺血区心肌组织TNF-α、HMGB1、IL-1、IL-6含量、非缺血区心肌组织HMGB1、IL-1和IL-6含量明显增高；POESR30组和POESR60组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织ICAM1含量明显增高。与POESR30组相比,POESR60组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织ICAM1和IL-6含量以及非缺血区心肌组织HMGB1含量均明显增高。第2部分：联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理对心肌缺血-再灌注损伤保护作用的研究根据第1部分实验的结果,在确定迷走神经刺激后处理最佳干预时间的基础上我们设计了这部分实验,其目的是评价联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理能否获得增强的心肌保护作用。将120只体重290-320g的成年雄性SD大鼠麻醉后随机平均分为六组(每组20只)：空白对照组(S组)；对照组(C组)；缺血预处理组(IPC组)；迷走神经刺激后处理组(POES组)；肢体远隔缺血后处理组(LRIPOC组)；联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理组(POES-LRIPOC组)。C组和IPC组的处理同第1部分实验；POES组是根据第1部分实验获得的结果在最佳时间点进行迷走神经刺激；LRIPOC组的基本处理与C组相同,在心肌缺血20min时采用止血带结扎大鼠双侧后肢造成双后肢缺血10mmin,并在开放LAD实施心肌血流再灌注的同时开放后肢血流灌注；POES-LRIPOC组的基本处理与C组相同,迷走神经刺激后处理的实施方法同POES组,肢体远隔缺血后处理的实施方法同LRIPOC组。然后,将每组大鼠进一步随机平均分为2个亚组(每亚组10只),各组检测项目与第1部分实验相同。结果显示,各组大鼠的一般情况和心肌缺血前血流动力学参数的基础值比较差异无显著统计学意义。与S组、C组或IPC组相比,POES组和POES-LRIPOC组的HR在缺血期和再灌注期明显降低。与S组相比,C组、IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组的MAP和RPP在缺血期和再灌注期均明显降低。与IPC组相比,C组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组缺血期室性心律失常发生率和室性心律失常评分明显增高。与C组相比,IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组再灌注期室性心律失常发生率和室性心律失常评分均明显降低；与LRIPOC组相比,IPC组、POES组和POES-LRIPOC组再灌注期间室性心律失常发生率和室性心律失常评分明显降低。与C组相比,IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组的IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度均明显降低；与IPC组或POES-LRIPOC组相比,POES组和LRIPOC组的IS%值明显增高；与POES组相比,LRIPOC组的IS%值和血清cTnl浓度明显增高,LRIPOC组的血清CK-MB浓度明显降低。与LRIPOC组相比,IPC组和POES-LRIPOC组的血清cTnI和CK-MB浓度均明显降低。与S组相比,C组和LRIPOC组再灌注30min时血清TNF-a浓度明显增高；C组再灌注60min和120min时血清TNF-a浓度明显增高,IPC组和POES-LRIPOC组再灌注60min时血清TNF-a浓度明显降低；IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组再灌注120min时血清TNF-a浓度明显降低；C组、IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组再灌注60min时血清HMGB1浓度明显增高；C组和LRIPOC组再灌注120min时血清HMGB1浓度明显增高；C组、POES组和LRIPOC组再灌注120min时血清ICAM1浓度明显增高；C组、IPC组和LRIPOC组再灌注120min时血清IL-1和IL-6浓度明显增高；POES组和POES-LRIPOC组再灌注120min时血清IL-10浓度明显增高。与C组相比,IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组再灌注30min、60min和120min时血清TNF-a浓度、再灌注120min时血清HMGB1、ICAM1、IL-1、IL-6浓度明显降低；IPC组再灌注60min时血清HMGB1浓度明显降低；POES-LRIPOC组再灌注120min时血清IL-10浓度明显增高。与IPC组相比,POES组和LRIPOC组再灌注60min时血清TNF-a浓度明显增高；LRIPOC组再灌注120min时血清HMGB1和ICAM1浓度明显增高；POES组和POES-LRIPOC组再灌注120min时血清IL-1和IL-6浓度明显降低。与POES组相比,LRIPOC组再灌注60min时血清TNF-a浓度、再灌注120min时血清HMGB1、ICAM1、IL-1和IL-6浓度明显增高；POES-LRIPOC组再灌注120min时血清ICAM1浓度明显降低。与LRIPOC组相比,POES-LRIPOC组再灌注30min、60min和120min时血清TNF-a浓度、再灌注120min时血清HMGB1、ICAM1、IL-1和IL-6浓度均明显降低。与S组相比,C组缺血区心肌组织TNF-a和HMGB1含量以及非缺血区心肌组织TNF-α、HMGB1和ICAM1含量明显增高；IPC组和POES-LRIPOC组缺血区心肌组织TNF-a含量明显降低；IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组非缺血区心肌组织HMGB1含量明显降低；C组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组缺血区心肌组织ICAM1含量明显增高；IPC组、POES组和POES-LRIPOC组非缺血区心肌组织ICAM1和IL-6含量明显降低；C组、POES组和LRIPOC组缺血区心肌组织IL-1和IL-6含量明显增高；C组、IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组非缺血区心肌组织IL-1、IL-10含量、缺血区心肌组织IL-10含量明显增高；C组和LRIPOC组非缺血区心肌组织IL-6含量明显增高。与C组相比,IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织TNF-α、HMGB1、ICAM1、IL-1和IL-6含量均明显降低；POES组和POES-LRIPOC组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织IL-10含量明显增高。与IPC组相比,POES组和LRIPOC组缺血区心肌组织TNF-α、ICAM1和IL-1含量明显增高；POES-LRIPOC组缺血区心肌组织HMGB1含量明显降低,缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织IL-10含量明显增高；POES组和POES-LRIPOC组非缺血区心肌组织HMGB1含量明显降低；LRIPOC组非缺血区心肌组织ICAM1、IL-1和IL-6含量,缺血区心肌组织IL-6含量明显增高。与POES组相比,POES-LRIPOC组缺血区心肌组织TNF-α、ICAM1和IL-1含量明显降低,非缺血区心肌组织IL-10含量明显增高；LRIPOC组非缺血区心肌组织HMGB1、ICAM1、IL-1和IL-6含量以及缺血区心肌组织ICAM1、IL-1和IL-6含量明显增高,缺血区心肌组织IL-10含量明显降低。与LRIPOC组相比,POES-LRIPOC组缺血区心肌组织TNF-α、ICAM1、IL-1和IL-6含量以及非缺血区心肌组织HMGB1、ICAM1、IL-1和IL-6含量明显降低,缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织IL-10含量明显增高。第3部分:PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路在迷走神经刺激后处理以及联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理心肌保护作用机制中地位的研究本部分实验的目的是探讨PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路在单独应用迷走神经刺激后处理以及联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理心肌保护作用机制中的地位。将20只体重290-320g的成年雄性SD大鼠麻醉后随机平均分为四组(每组5只)：对照组(C组)；迷走神经刺激后处理组(POES组)；肢体远隔缺血后处理组(LRIPOC组)；联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理组(POES-LRIPOC组)。各组的处理基本同本实验第二部分,但是在开放LAD实施再灌注60min时结束实验,分别取大鼠左心室缺血区心肌标本和右心室非缺血区心肌标本。从缺血与非缺血区心肌标本中提取总蛋白和总RNA,采用实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction, RQ-PCR)技术观察Akt和STAT3基因mRNA在缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织的表达情况,并通过免疫蛋白印迹分析(Western-blotting)技术观察缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织Akt和STAT3蛋白磷酸化的情况。RQ-PCR结果显示,与C组相比,POES-LRIPOC组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织Akt基因和STAT3基因mRNA表达均明显增强；与POES组相比,POES-LRIPOC组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织Akt基因和STAT3基因mRNA表达明显增强；与LRIPOC组相比,POES-LRIPOC组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织Akt基因和STAT3基因mRNA表达明显增强。Western-blotting结果显示,与C组相比,POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组的缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织p-Akt蛋白和p-STAT3蛋白的灰度值明显增加；与POES组相比,POES-LRIPOC组的缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织p-Akt蛋白和p-STAT3蛋白的灰度值明显增加；与LRIPOC组相比,POES-LRIPOC组的缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织p-Akt蛋白和p-STAT3蛋白的灰度值明显增加。结论通过本实验,我们得出以下结论：1.心肌缺血15min时、再灌注前即刻、再灌注30mmin和再灌注60min时实施迷走神经刺激后处理均能够明显减小IRI所致的心肌梗死面积,并明显降低血清cTnI和CK-MB浓度,其中以在再灌注60min实施迷走神经刺激后处理的心肌保护效果最差,以在心肌缺血15mmin时实施迷走神经刺激后处理的心肌保护效果最强,但是迷走神经刺激后处理的心肌保护作用弱于缺血预处理。2.缺血预处理、缺血期和再灌注期不同时间点进行迷走神经刺激后处理均能明显抑制再灌注期室性心律失常的发生；缺血15min时实施迷走神经刺激后处理抑制再灌注期心律失常的作用较其他时间点进行迷走神经刺激后处理更强。3.联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理能够获得更强的心肌保护作用,并且该心肌保护作用与缺血预处理的心肌保护作用几无差异。4.缺血预处理、缺血期和再灌注期不同时间点进行迷走神经刺激后处理、肢体远隔缺血后处理、联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理均能通过抑制心肌IRI过程中的炎症反应而发挥心肌保护作用。5. PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路相关基因在转录后蛋白磷酸化水平的上调参与了迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理的心肌保护作用；而PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路相关基因mRNA水平的上调则参与了联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理的心肌保护。同时,联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理的心肌保护作用机制可能还涉及了PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路蛋白磷酸化水平的上调。
王智昊[3]2015年在《25-羟基—原人参三醇对大鼠实验性心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及机制的研究》文中研究说明冠心病是危害人类健康的严重疾病，心肌梗死更是“第一危险杀手”，尽早对缺血心肌再灌注是治疗心梗的根本措施，但是心肌缺血再灌注往往造成“二次损伤”，可导致缺血区心肌损伤进行性加重。所以如何减轻心肌缺血再灌注损伤（myocardialischemia/reperfusion injury，MI/RI）已成为医学工作者研究的热点，寻找一种安全、有效的药物更是迫在眉睫。人参是我国传统的中药，具有保护缺血心肌、抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等诸多方面的作用。25-羟基-原人参三醇[25hydroxyl-Protopanaxatriol，25-OH-PPT，代号T19，下文以T19出现，化学名：20（R）-达玛烷-3β，6α，12β，20，25-五醇，分子式：C30H54O5，分子量：494]，是从人参茎叶中提取出的单体，属于原人参三醇类，是一种人参皂苷元。据文献报道，人参总皂苷及人参二醇组皂苷具有抗心肌缺血再灌注损伤的作用，但关于25-羟基-原人参三醇对于心肌缺血再灌注损伤的影响尚未见报道。那么此种人参单体能否成为保护心肌缺血再灌注损伤的安全有效的药物呢？将是本课题研究的重点。本研究首先采用在体大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型，研究T19对大鼠MI/RI的保护作用及其机制；其次应用H2O2诱导的H9c2心肌细胞模型，研究T19对H2O2诱导的H9c2心肌细胞氧化应激性损伤的保护作用及其机制。第一部分25-羟基-原人参三醇预处理对大鼠实验性心肌缺血/再灌注损伤的保护作用目的：观察25-羟基-原人参三醇预处理对Wistar大鼠心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）损伤的保护作用及与药物剂量的相关性，观察PI3K抑制剂LY294002对心肌缺血再灌注损伤的影响。方法：（1）将实验动物Wistar大鼠，雌雄各半，体重180-250g，分为7组（每组20只）：假手术Sham组，I/R组，T19a组（I/R+T19低剂量），T19b组（I/R+T19中剂量），T19c组（I/R+T19高剂量），抑制剂组（I/R+T19高剂量+LY294002），阳性药曲匹地尔Trapidil组（I/R+Trapidil）。T19低、中、高剂量分别为5、10、20mg/kg/d，灌胃7d。抑制剂组：20mg/kg/d T19灌胃7d，末次灌胃前30min腹腔注射LY2940020.3mg/kg。Trapidil剂量为：15mg/kg/d，灌胃7d。（2）大鼠麻醉后，结扎大鼠左冠状动脉前降支制成心肌缺血模型，使心肌缺血30min，再灌注24h，制备缺血再灌注损伤模型，观察缺血再灌注24h的心电图、超声心动图，取心脏用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）染色法检测心梗面积，在光镜和电镜下观察心脏左室前壁的超微结构。用TUNEL法评估心肌细胞凋亡指数（AI）。检测再灌注24h心肌酶CK-MB、LDH和AST的含量。测量再灌注24h血清中SOD的活性，MDA的含量，CAT及GSH-Px的活性。结果：（1）缺血30min再灌注24h后，与I/R组比较，T19低剂量组心电图ST段比I/R组有下移，但无统计学意义（P>0.05），中、高剂量组与I/R组相比有明显下移（P<0.01，P<0.01），下移程度与T19剂量呈正相关。（2）与I/R组比较，T19低、中、高剂量组心肌梗死面积减少，低剂量组无统计学意义（P>0.05），中、高剂量组与I/R组相比有明显减少（P<0.05，P<0.05），减少程度与剂量呈正相关。（3）缺血前30min各组大鼠基线心脏超声测量结果无显著性差异。再灌注24h后，与I/R组比较T19低剂量组有增加左室射血分数（LVEF）和减少左室舒张末期容积（LVEDV）及左室收缩末期容积（LVESV）的趋势，但无显著差异（P>0.05）。T19中、高剂量组明显增加了LVEF值（P<0.01），降低了LVEDV和LVESV（中、高剂量组均为P <0.01），改变程度与T19剂量呈正相关。（4）再灌注24h后，与I/R组比较，T19低剂量组CK-MB、LDH、AST有减少趋势，但是无显著差异（P>0.05）；T19中、高剂量组可明显减少血清中CK-MB、LDH、AST值，有显著差异（P<0.05，P<0.05，P<0.05），且改变趋势与T19剂量呈正相关。（5）T19高剂量组明显增高了SOD、CAT、GSH-Px含量（P<0.05，P<0.05，P<0.01），降低了MDA含量（P<0.05），T19低、中剂量组对SOD、CAT、MDA没有明显改变（P>0.05），但两组可明显增高GSH-Px的含量（P<0.05，P<0.01）。（6）心肌病理学改变：在光镜、电镜下观察及用TUNEL检测：与I/R组相比，T19中、高剂量组能明显减少心肌坏死细胞，减少炎症细胞浸润，减少凋亡指数（P<0.01）。减少程度与剂量呈正相关。T19低剂量组则也有上述表现，但没有统计学差异（P>0.05）。与阳性药Trapidil组相比较，T19中剂量组对缺血再灌注损伤心肌的保护作用，与Trapidil组作用相当，而PI3K通路抑制剂LY294002组对心肌的保护作用均被阻断。结论：25-羟基-原人参三醇对大鼠实验性心肌缺血再灌注损伤有保护作用，低剂量无明显保护作用，中、高剂量组有明显保护作用，且作用效果与剂量高低呈正相关。PI3K/Akt通路参与了T19对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。第二部分25-羟基-原人参三醇通过PI3K/Akt信号通路介导对大鼠实验性心肌缺血/再灌注损作用的机制研究目的：探讨PI3K/Akt信号通路在25-羟基-原人参三醇预处理对大鼠实验性心肌缺血/再灌注损作用的机制。方法：（1）选用Wistar大鼠，雌雄各半，体重180-250g，随机分为5组（每组10只）：假手术Sham组，I/R组，T19组（I/R+T19），抑制剂组（I/R+T19+LY294002），Trapidil组（I/R+Trapidil）。T19组剂量为20mg/kg/d，灌胃7d，抑制剂组：20mg/kg/d的T19灌胃7d，末次灌胃前30min腹腔注射LY2940020.3mg/kg。Trapidil组剂量为15mg/kg/d，灌胃7d。结扎大鼠左冠状动脉前降支制成心肌缺血模型，使心肌缺血30min，再灌注24h后留取心脏和血清。（2）用Western blot法及免疫组化法检测各组心肌组织中Akt、p-Akt(Ser-473)、eNOS、p-eNOS（Ser-1177）、Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表达。用硝化还原法检测各组血清中NO的含量。结果：（1）Western blot法及免疫组化法检测发现：各组心肌细胞中Akt和eNOS蛋白含量相当，没有显著差别（P>0.05）。T19组与I/R组比较明显上调磷酸化Akt及磷酸化eNOS蛋白含量（P<0.01），给予LY2940002后与T19组比较，明显下调磷酸化Akt及磷酸化eNOS蛋白含量（P<0.01）。（2）硝化还原法检测发现：T19组比I/R组NO含量明显增加（P<0.01），给予LY294002后，NO含量比T19组明显减少（P<0.01）。（3）Western blot法及免疫组化法检测发现：与Sham组比较，I/R组心肌组织中Caspase-3表达明显上调（P<0.01），Bcl-2表达明显下调（P<0.01），Bax表达明显上调（P<0.01）。与I/R组比较，T19组明显上调Bcl-2表达（P<0.01），明显下调Bax和Caspase-3表达（P<0.01，P<0.01）。抑制剂LY294002组则与I/R组相当，比T19组明显上调Bax和Caspase-3的表达（P<0.01，P<0.01），明显下调Bcl-2的表达（P<0.01）。Trapidil组比I/R组明显上调磷酸化Akt及磷酸化eNOS蛋白含量（P<0.01），明显增加NO含量（P<0.05），明显上调Bcl-2表达（P<0.01），明显下调Bax和Caspase-3表达（P<0.01，P<0.01）。结论：（1）25-羟基-原人参三醇减少大鼠心肌缺血再灌注的损伤可能与磷酸化Akt、磷酸化eNOS及NO有关。（2）25-羟基-原人参三醇抗心肌细胞凋亡可能是通过上调Bcl-2、下调Bax和Caspase-3蛋白表达实现的。（3）PI3K/Akt信号通路在缺血再灌注损伤后心肌保护中起了重要作用。其机制可能与PI3K/Akt通路介导凋亡蛋白的表达有关。（4）25-羟基-原人参三醇通过激活PI3K/Akt信号通路，保护心脏细胞内皮功能，减少凋亡，减轻心肌缺血再灌注损伤。第三部分25-羟基-原人参三醇对H2O2诱导的H9c2心肌细胞的保护作用及机制的研究目的：探讨25-羟基-原人参三醇对H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤模型的保护作用及机制。方法：（1）将H9c2心肌细胞分为七组：Control组、H2O2组、H2O2+T19低、中、高剂量组，H2O2+T19大剂量+LY294002组，阳性药Trapidil组。T19低、中、高剂量为31.25、62.5、125μg/ml，T19剂量预处理H9c2心肌细胞4h，然后即加入250μM H2O2作用6h；H2O2+T19高剂量+LY294002组的给药方法为先用25μM LY294002处理H9c2心肌细胞1h,之后再加入125μg/ml人参皂甙单体T19作用4h，最后加入250μM H2O2作用6h；阳性药Trapidil组剂量为30μg/ml。（2）用MTT法检测细胞活力，在显微镜下观察细胞形态，用Annexin-FITC/PI流式细胞仪荧光双染及Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡，评价T19对心肌细胞H2O2损伤是否具有保护作用及PI3K/Akt通路的参与作用。（3）再将H9c2心肌细胞分为五组：Control组，H2O2组，H2O2+T19组，H2O2+T19高剂量+LY294002组，阳性药Trapidil组。T19组剂量为125μg/ml，给药方法同前。（4）用Western blot法测上述五组Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表达。结果：（1）用不同浓度的T19预处理H9c2心肌细胞，可减少H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤，减少细胞凋亡，并在一定范围内与T19剂量成正比。加入PI3K/Akt抑制剂LY294002后阻断了T19的保护作用。Trapidil组结果与T19高剂量组相当。（2）T19组比H2O2组明显上调磷酸化Akt及磷酸化eNOS表达(P<0.01)，LY组比T19组明显下调磷酸化Akt及磷酸化eNOS的蛋白表达(P<0.01)，T19组比H2O2组明显上调Bcl-2表达(P<0.01)，明显下调Bax和Caspase-3表达(P<0.01, P<0.01)，LY组比T19组明显下调Bcl-2表达(P<0.01)，上调Bax和Caspase-3表达(P<0.01, P<0.01)。Trapidil组表达与T19组相当。结论：25-羟基-原人参三醇对H2O2诱导H9c2心肌细胞损伤模型有保护作用。其机制可能与激活PI3K/Akt通路来调节凋亡相关蛋白，进而减轻H9c2细胞凋亡有关。
孙超[4]2017年在《基于自噬和PI3K-Akt-mTOR信号转导通路研究缺血预处理对糖尿病心肌缺血/再灌注损伤的保护作用》文中指出背景缺血/再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury,IRI)后心肌细胞坏死、凋亡和心室重构是急性心肌梗死溶栓治疗和手术治疗后心功能不全的最主要病理生理学基础。研究发现,急性心肌缺血发生后最终的心肌梗死面积大约50%是由IRI所致。合并糖尿病时更容易发生心肌IRI,且心脏损伤程度和病死率均进一步明显增加,严重威胁人类生命健康,但机制尚不明确。探讨可能的保护措施以达到预防或减轻心肌IRI的目的,为临床糖尿病合并缺血性心肌病患者的防治提供理论依据,具有良好的应用前景。缺血预处理(Ischemic preconditioning,IPC)是指通过多次短暂冠状动脉缺血以达到增强心肌对随后长时间缺血的耐受性,从而减轻心肌IRI。IPC强大的心肌保护作用主要表现为缩小IRI后心肌梗死面积、降低心律失常的发生率、减少心肌细胞凋亡和促进心功能恢复等。IPC在IRI中发挥的作用备受人们关注,但其调动心肌内源性保护作用的机制至今尚未被完全阐明。自噬(Autophagy)是一种细胞内防御和应激调控机制,也是参与心肌IRI的重要机制之一。作为一种重要的物质代谢方式,自噬的发生和发展均受到严格的调节和控制。自噬是由自噬相关基因(Autophagy related gene,Atg)进行调控,其中参与调节的几个关键蛋白复合物包括雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷脂酰肌醇 3 激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase,PI3K)、Atg8(LC3)和Atg6(Beclin-1)等。目前已知的自噬调节途径有多条,其中磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(Protein kinase B)-雷帕霉素靶蛋白信号转导通路(PI3K-Akt-mTOR信号转导通路)是自噬过程中唯一的抑制性通路。现有的证据表明,自噬在IRI过程中的作用存在双面性,发挥保护作用还是损伤作用目前尚存在争议。糖尿病严重威胁人类的生命健康,不仅是缺血性心脏病的独立危险因子,而且能够加重心肌IRI和使IPC等干预措施对心肌IRI的保护作用消失或减弱。研究发现,自噬及其相关的PI3K-Akt-mTOR信号转导通路在糖尿病心肌的表达发生了明显改变,而且它们在正常和糖尿病心肌IRI中所发挥的作用并不相同。由此可见糖尿病心肌IRI与自噬及其相关PI3K-Akt-mTOR信号转导通路关系密切,但具体机制和它们之间的相互作用有待进一步的阐明和研究。基于上述分析,我们设计了这个基础实验研究,旨在从离体和在体实验两个层面观察PI3K-Akt-mTOR信号转导通路在正常和糖尿病心肌IRI的表达情况,探讨PI3K-Akt-mTOR信号转导通路和自噬在糖尿病心肌IRI中的作用。同时,在糖尿病心肌IRI实施IPC时分别应用自噬激动剂和抑制剂进行干预,观察其是否影响IPC对糖尿病心肌IRI的保护作用,以进一步探讨自噬调节在糖尿病心肌IRI保护机制中的作用。本实验共分四个部分:第一部分:心肌细胞缺氧/复氧损伤模型和缺氧预处理模型的建立本部分实验的目的是构建成熟、稳定且高质量的原代心肌细胞培养方法,采用三气培养箱培养构建新生鼠离体心肌细胞缺氧/复氧(Anoxia/reoxygention,AR)损伤模型,并在此基础上通过观察心肌细胞凋亡情况,探索最佳的缺氧预处理方式。采用三气培养箱培养构建新生大鼠离体心肌细胞缺氧预处理模型。心肌细胞培养72h后,随机分为5组:①空白对照组(S组):心肌细胞正常培养不进行任何处理;②3h/6h组:心肌细胞进行缺氧3h和复氧6h处理;③30min*3h/6h组:心肌细胞进行缺氧30 min和复氧30 min的缺氧预处理,再进行缺氧3 h和复氧6 h处理;④6h/6h组:心肌细胞进行缺氧6h和复氧6h处理;⑤30min*6h/6h组:心肌细胞进行缺氧30 min和复氧30 min的缺氧预处理,再进行缺氧6 h和复氧6 h处理。采用cTnT免疫荧光法复合细胞核DAPI染色法鉴定心肌细胞的纯度,采用乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)检测试剂盒检测各组心肌细胞LDH漏出率,采用膜联蛋白 V(AnnexinV)/碘化丙啶(Propidine iodide,PI)(AnnexinV/PI)双染流式细胞术检测心肌细胞凋亡情况。结果显示,倒置相差显微镜下观察,48～72 h后心肌细胞出现同步化搏动,形成功能上的合胞体、收缩有力、活性高。cTnT免疫荧光法复合细胞核DAPI染色法鉴定的心肌细胞纯度达到(94.4±1.2)%。与S组相比,各处理组的心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比和晚期凋亡细胞百分比均明显升高,正常细胞百分比明显降低。与3h/6h组相比,6h/6h组心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比和晚期凋亡细胞百分比均明显升高,正常细胞百分比明显降低;30min*3h/6h组,心肌细胞LDH漏出率明显降低,正常细胞百分比明显升高。与6h/6h组相比,30min*6h/6h组心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比和晚期凋亡细胞百分比均明显降低,正常细胞百分比明显升高。第二部分:自噬和PI3K-Akt-mTOR信号转导通路在缺氧预处理对高糖心肌细胞缺氧/复氧损伤保护中作用的实验研究本部分实验目的是观察自噬及其相关PI3K-Akt-mTOR信号转导通路在正常和高糖培养心肌细胞缺氧预处理中的表达,旨在探讨缺氧预处理对高糖心肌细胞缺氧/复氧损伤保护作用的改变及其相关机制。心肌细胞培养72h后进行如下分组:①正常空白对照组(S组):正常培养基(糖浓度为5.5 mmol/L,下同)培养的心肌细胞,持续培养12h;②高糖空白对照组(HS组):高糖培养基培养(糖浓度为30mmol/L,下同)的心肌细胞,持续培养12 h;③正常缺氧/复氧损伤组(C组):正常心肌细胞接受缺氧6 h和复氧6 h处理;④高糖缺氧/复氧损伤组(HC组):高糖心肌细胞接受缺氧6 h和复氧6 h处理;⑤正常缺氧预处理组(HPC组):正常心肌细胞进行缺氧30 min和复氧30 min的缺氧预处理,再进行缺氧6 h和复氧6 h处理;⑥高糖缺氧预处理组(HHPC组):高糖心肌细胞进行缺氧30 min和复氧30 min的缺氧预处理,再进行缺氧6 h和复氧6 h处理。采用LDH检测试剂盒检测心肌细胞LDH漏出率,采用Annexin V/PI双染流式细胞术检测心肌细胞凋亡情况,采用Western-blotting法检测LC3-Ⅱ、Beclin-1、mTOR、PI3K 和 P-Akt/Akt 表达情况。结果显示:与C组相比,HPC组的心肌细胞LDH漏出率明显降低(P<0.01)。与HC组相比,HHPC组的心肌细胞LDH漏出率无显著统计学差异(P>0.05)。与HPC组相比,HHPC组的心肌细胞LDH漏出率明显升高(P<0.01)。与C组相比,HPC组的心肌细胞早期和晚期凋亡细胞百分比均明显降低,正常细胞百分比明显升高(P<0.05)。与HC组相比,HHPC组的心肌细胞早期凋亡细胞百分比、晚期凋亡细胞百分比和正常细胞百分比均无显著统计学差异(P>0.05)。与HPC组相比,HHPC组早期和晚期凋亡细胞百分比均明显升高(P<0.01)。与S组相比,各处理组心肌细胞LC3-Ⅱ表达明显升高(P<0.05),mTOR和PI3K表达明显降低(P<0.05);HS组、C组、HC组和HHPC组的Beclin-1表达明显升高(P<0.05),P-Akt/Akt比值明显降低(P<0.05)。与C组相比,HPC组心肌细胞LC3-Ⅱ和Beclin-1表达明显降低(P<0.05),mTOR表达明显升高(P<0.05);HC组Beclin-1表达明显升高(P<0.05),mTOR表达明显降低(P<0.05),LC3-Ⅱ表达有升高趋势但无显著统计学差异(P>0.05)。与HC组相比,HHPC组mTOR表达明显升高(P<0.05),PI3K表达明显降低(P<0.05)。与HPC组相比,HHPC组LC3-Ⅱ和Beclin-1表达明显增加(P<0.05),mTOR、PI3K表达和P-Akt/Akt比值明显降低(P<0.05)。第三部分:缺血预处理对正常和糖尿病心肌缺血/再灌注损伤的保护作用和机制本部分实验旨在观察自噬在正常和糖尿病心肌IRI后的表达水平,比较IPC对正常和糖尿病心肌IRI的影响,探讨自噬在其中的作用。将30只正常和30只糖尿病成年雄性Sprague DawLey(SD)大鼠(体重350～450g)随机分为六组:正常空白对照组(S组)、糖尿病空白对照组(DS组)、正常IRI组(C组)、糖尿病IRI组(DC组)、正常IPC组(IPC组)和糖尿病IPC组(DIPC组)。所有大鼠开胸后采用5-0丝线将冠状动脉左前降支(Left anterior descending coronary artery,LAD)套扎做成活结。S组和DS组不采取任何干预处理措施,持续观察150min。C组和DC组接受局部心肌缺血30 min(阻断LAD)和再灌注120 min(开放LAD)的处理。IPC组、DIPC组在IRI前进行3个循环的IPC,每个循环是由5 min的LAD阻断和5 min的LAD开放组成,总处理时间是30 min。整个实验过程中,连续监测Ⅱ导联心电图(ECG)、平均动脉压(Mean artery presure,MAP)和心率(Heartrate,HR),并保持大鼠肛温在36.5～37.5℃之间。在再灌注120min时抽取血标本,采用大鼠专用试剂盒分别测定血清心肌肌钙蛋白Ⅰ(Cardiac troponin-Ⅰ,cTnI)浓度和CK-MB浓度。随后采用伊文思蓝和氯化三苯基四氮唑双重染色检测心肌梗死面积(Infarct size,IS%)。采用Western-blotting法检测 LC3-Ⅱ、Beclin-1、mTOR、PI3K 和 P-Akt/Akt 表达情况。结果显示,各组大鼠的一般情况、心肌缺血前血流动力学参数基础值比较差异均无显著统计学意义。在缺血期和再灌注期,与C组相比,IPC组发生室性心律失常的大鼠数目明显减少,并且室性心律失常评分降低,DC组发生室性心律失常的大鼠数目明显增多,并且室性心律失常评分增高。与DC组相比,DIPC组发生室性心律失常的大鼠数目和室性心律失常评分无明显差异。与S组相比,C组和DC组IS%明显升高(P<0.05)。与C组相比,IPC组血清cTnI和CK-MB浓度以及IS%明显降低(P<0.05),DC组血清cTnI和CK-MB浓度以及IS%有升高趋势,但无显著统计学差异(P>0.05)。与DC组相比,DIPC组的血清cTnI和CK-MB浓度以及IS%无显著统计学差异(P>0.05)。与IPC组相比,DIPC组的血清cTnI和CK-MB浓度以及IS%明显升高(P<0.05)。与S组相比,各处理组缺血区心肌组织Beclin-1表达均明显升高(P<0.05),mTOR表达均明显降低(P<0.05)。与C组相比,DC组缺血区心肌组织的LC3-Ⅱ和Beclin-1表达明显升高(P<0.05);IPC 组的 LC3-Ⅱ和 Beclin-1 表达明显降低(P<0.05),mTOR、PI3K表达和P-Akt/Akt比值明显升高(P<0.05)。与DC组相比,DIPC组缺血区心肌组织LC3-Ⅱ、Beclin-1、mTOR、PI3K和Akt表达均无显著统计学差异(P>0.05)。与IPC组相比,DIPC组缺血区心肌组织LC3-Ⅱ表达明显升高(P<0.05),mTOR表达和P-Akt/Akt比值明显降低(P<0.05)。第四部分:自噬和PI3K-Akt-mTOR信号转导通路在缺血预处理对糖尿病心肌缺血/再灌注损伤保护中作用的实验研究根据第三部分的研究结果,IPC对正常心肌IRI具有保护作用,而对糖尿病心肌IRI无明显保护性作用,因此设计了这部分实验,在IPC中分别采用自噬激动剂(雷帕霉素)和抑制剂(渥曼青霉素)进行干预,观察PI3K-Akt-mTOR信号转导通路和自噬的改变,旨在评价在自噬干预情况下IPC能否对糖尿病心肌IRI产生保护作用。将60只成年雄性糖尿病SD大鼠(体重350～450 g)随机分为六组:①糖尿病空白对照组(DS组):建模30 min前腹腔注射生理盐水1.5 ml,在LAD下方穿5-0缝合线但不结扎,持续150 min。②糖尿病IRI对照组(DC组):建模30 min前腹腔注射生理盐水1.5 ml,成功建立在体心肌缺血/再灌注损伤模型后稳定10 min,结扎LAD 30 min,然后开放LAD实施再灌注120 min。③雷帕霉素+糖尿病IRI组(Ra+DIPC组):建模前30 min腹腔注射雷帕霉素0.25 mg/kg(溶液总体积1.5 ml),成功建立在体心肌缺血/再灌注损伤模型后稳定10 min,结扎LAD 30 min,然后开放LAD实施再灌注120 min。④渥曼青霉素+糖尿病IRI组(Wo+DIRI组):建模前30 min腹腔注射渥曼青霉素0.6 mg/kg(溶液总体积1.5 ml),余操作同Ra+DIRI组。⑤雷帕霉素+糖尿病IPC组(Ra+DIPC组):糖尿病大鼠建模前30 min腹腔注射雷帕霉素0.25 mg/kg(溶液总体积1.5 ml),成功建立心肌IRI模型后稳定10min,结扎LAD前进行3个循环IPC,每个循环是由5 min的LAD阻断和5 min的LAD开放组成,总处理时间是30 min;然后,结扎LAD 30 min,再开放LAD实施再灌注120 min;⑥渥曼青霉素+糖尿病IPC组(Wo+DIPC组):建模前30 min腹腔注射渥曼青霉素0.6 mg/kg(溶液总体积1.5 ml),余操作同Ra+DIPC组。检测方法同第三部分。结果显示,各组大鼠的一般情况、心肌缺血前血流动力学参数的基础值比较差异均无显著统计学意义。与DS组相比,各处理组IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度均明显升高(P<0.05)。与DC组相比,Wo+DIPC组IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度均明显降低(P<0.05);Wo+DIRI组IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度均有降低趋势,但无统计学意义(P>0.05);Ra+DIRI组和Ra+DIPC组IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度均无显著差异(P>0.05)。与 Ra+DIRI 组相比,Wo+DIRI 组和 Ra+DIPC 组 IS%值、血清 cTnI 和 CK-MB浓度均无显著差异(P>0.05);但在Wo+DIPC组中明显降低(P<0.05)。与Wo+DIRI组相比,Wo+DIPC组IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度均明显降低(P<0.05)。与Ra+DIPC组相比,Wo+DIPC组IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度均明显降低(P<0.05)。与DS组相比,DC组和Ra+DIRI组缺血区心肌组织LC3-Ⅱ和Beclin-1表达明显升高(P<0.05),mTOR和PI3K表达和P-Akt/Akt比值明显降低(P<0.05);Wo+DIRI组LC3-Ⅱ表达明显升高,P-Akt/Akt比值明显降低(P<0.05)。与DC组相比,Ra+DIRI组LC3-Ⅱ表达明显升高(P<0.05),PI3K表达明显降低(P<0.05);Wo+DIRI 组 PI3K 表达和 P-Akt/Akt 比值明显升高(P<0.05)。与DC组相比,Ra+DIPC组LC3-Ⅱ表达明显升高(PP<0.05);而Wo+DIPC组Beclin-1表达明显降低(P<0.05),mTOR、PI3K表达和P-Akt/Akt比值明显升高(P<0.05)。与 Ra+DIPC 组相比,Wo+DIPC 组 LC3-Ⅱ和 Beclin-1 表达明显降低(P<0.05),mTOR、PI3K表达和P-Akt/Akt比值明显升高(P<0.05)。结论1.通过缺氧6 h/复氧6 h能够成功构建离体心肌细胞缺氧/复氧损伤模型;缺氧30 min/复氧30 min后再进行缺氧6 h/复氧6 h能够成功构建离体心肌细胞缺氧预处理模型。2.高糖培养和缺氧/复氧损伤均可导致心肌细胞自噬抑制性通路PI3K-Akt-mTOR信号转导通路表达减弱和自噬相关激动蛋白表达增强。3.缺氧30 min/复氧30 min的缺氧预处理可对正常培养心肌细胞的缺氧/复氧损伤产生保护作用,且使PI3K-Akt-mTOR信号转导通路表达明显增强;但缺氧预处理对高糖培养心肌细胞缺氧/复氧损伤无明显保护作用,且不影响PI3K-Akt-mTOR信号转导通路表达。4.心肌IRI和糖尿病均可抑制自噬抑制性通路(PI3K-Akt-mTOR信号转导通路),增强心肌细胞自噬表达水平。5.IPC对正常心肌IRI具有保护作用,但对糖尿病心肌IRI无明显保护作用,这可能是与糖尿病心肌组织自噬表达增强有关。6.渥曼青霉素干预可改善IPC对糖尿病心肌IRI的保护作用,这与渥曼青霉素激活PI3K-Akt-mTOR信号转导通路和降低自噬表达水平有关。
熊军[5]2011年在《α7nAChR激动剂后处理对大鼠在体心肌缺血—再灌注损伤的保护作用及机制的实验研究》文中研究表明背景众多动物实验表明,在急性心肌缺血所致的最终心肌梗死面积中,大约50%是由缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury)所引起。虽然缺血预处理(ischemic precondition)是目前已知的最强大的心肌保护干预措施,但是由于其需要在心肌缺血发生前实施干预,显然这在急性心肌梗死的情况下是不可能的,所以其临床应用受到了极大的限制。虽然缺血后处理(ischemic postconditioning)成功地解决了缺血预处理所存在的干预时机选择问题,但是由于其与缺血预处理一样仍然依赖于有创操作,所以其仅可应用于接受冠状动脉介入治疗的患者或针对急性心肌缺血而实施的某些心脏手术中。另外,缺血后处理这一有创性操作本身也并非适用于所有的患者,并有导致病变冠状动脉破裂或粥样硬化斑块脱落等其他并发症的高风险。鉴于缺血预处理和缺血后处理的局限性,就临床应用而言,在心肌缺血发生后进行药物治疗以获得有效的心肌保护作用,即“药物后处理”(pharmacological postconditioning)则具有更大的临床实际意义。目前,药物预处理和药物后处理均已成为缺血预处理或缺血后处理的有效替代途径。药物后处理的主要优点是临床应用不受心肌缺血时间的限制、方法简便、不需要有创操作和费用低廉等。心肌缺血-再灌注损伤实际上是一种炎症反应,主要表现为炎症细胞局部侵润和炎症细胞因子大量产生和释放。晚近研究发现,胆碱能抗炎通路通过迷走神经作用于α7烟碱型乙酰胆碱受体(a7 nicotinic acetylcholiner receptor, a7nAChR)能够抑制炎症细胞因子的产生和释放,恢复炎症反应平衡,并保护机体。研究证实,迷走神经刺激可降低炎症反应时肿瘤坏死因子-α(tumor necrosisi factorα, TNF-α)、白介素6(interleukin 6, IL-6)和高迁移率组蛋白1 (high mobility group box 1, HMGB1)等炎症细胞因子的组织和循环血液水平,而且迷走神经刺激亦可保护缺血-再灌注所致的心肌损伤。由于应用a7nAChR激动剂能够产生与迷走神经刺激相同的效应,所以作为无创、操作简单的一种药物后处理,a7nAChR激动剂可能具有潜在的临床应用前景。虽然目前已有研究证实a7nAChR激动剂对肾脏缺血-再灌注损伤具有保护作用,但是a7nAChR激动剂对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用尚未得到充分研究。联合不同干预措施以获得更好的心肌保护效果一直是心肌缺血-再灌注损伤领域重要的研究方向之一,而缺血后处理和a7nAChR激动剂后处理这两种具有临床应用价值的心肌保护干预措施的触发机制明显不同。有鉴于此,我们设计了这个随机对照实验,旨在观察缺血后处理和α7nAChR激动剂后处理的心肌保护效果,并试图证实联合应用两者是否能够获得协同性心肌保护作用。另外,本实验还试图确定α7nAChR激动剂后处理的最佳干预时间,并研究PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路在联合应用缺血后处理和α7nAChR激动剂后处理心肌保护作用中的地位,以探讨其相互作用的内在机制。本实验共分为三部分：第1部分：PNU282987后处理和缺血后处理对在体大鼠心肌缺血-再灌注损伤及其炎症反应影响的实验研究第1部分实验的目的是采用大鼠在体心肌缺血-再灌注损伤模型比较性观察PNU282987后处理和缺血后处理的心肌保护效应,并验证两种干预措施在降低心肌梗死面积方面是否存在有协同性作用。将60只成年雄性Sprague Dawley (SD)大鼠(体重290-320g)麻醉后随机分为六组：空白对照组(S组,n=10)；对照组(C组,n=10)；缺血预处理组(IPC组,n=10)；缺血后处理组(IPOC组,n=10); PNU282987后处理组(P组,n=10)和联合应用PNU282987后处理和缺血后处理组(PPOC组,n=10)。所有大鼠开胸后采用丝线将其冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery, LAD)套扎做成活结。除S组之外,所用大鼠均接受局部心肌缺血30 min(阻断LAD)和再灌注180 min(开放LAD)的处理。C组不采用任何干预措施；IPC组在结扎LAD前进行3个循环的缺血预处理,每个循环是由5 min的LAD阻断和5 min的LAD开放组成,总处理时间是30min; IPOC组在再灌注前进行3个循环的缺血后处理,每个循环是由10s的LAD开放和10s的LAD阻断组成,总处理的时间是1min; S组、C组、IPC组和IPOC组大鼠均在30 min缺血后腹腔注射生理盐水1.5ml。P组于再灌注前腹腔注射PNU282987 2.4mg/kg; PPOC组的处理同IPOC组,并于再灌注前腹腔注射PNU282987 2.4mg/kg。实验过程中,连续监测心率(heart rate, HR).平均动脉压(mean arterial presure, MAP)和Ⅱ导联心电图(ECG),并保持大鼠直肠温度在36.5-37.5℃之间。在再灌注30 min和180 mmin时抽取血标本,采用大鼠专用试剂盒分别测定血清心肌肌钙蛋白Ⅰ(Cardiac Troponin-Ⅰ, cTnⅠ)、TNF-α、IL-6和HMGB1浓度。随后采用伊文思蓝和氯化三苯基四氮唑双重染色检测心肌梗死面积(infarctsize, IS%)。结果显示,各组大鼠的一般情况、心肌缺血前血流动力学参数的基础值和心肌缺血后15min的血流动力学参数比较差异均无显著统计学意义。再灌注期间S组的心率血压乘积(rate-pressure product, RPP)显著高于C组。C组的MAP显著低于S组、IPC组、IPOC组、P组和PPOC组。与IPC组相比,C组、IPOC组、P组和PPOC组缺血期发生室性心律失常的大鼠数目显著增多,并且缺血期室性心律失常评分显著增高。与C组相比,IPOC组和PPOC组再灌注初期发生室性心律失常的大鼠数目显著减少,并且再灌注初期室性心律失常评分也显著降低。与C组相比,IPC组、IPOC组、P组和PPOC组的IS%和血清cTnI浓度均显著降低；与IPC组相比,PPOC组的IS%无显著统计学差异,虽然IPOC组和P组的IS%显著增高,但P和PPOC组的TnI血清浓度显著降低；与IPOC组相比,P组的IS%无显著统计学差异,但PPOC组的IS%显著降低,并且P组和PPOC组的TnI显著降低。析因分析结果显示,PNU282987后处理和缺血后处理在降低IS%方面无交互作用。与S组相比,C组再灌注30 min时血清TNF-a和IL-6浓度显著增高,再灌注180min时血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度也显著增高。与C组相比,IPC组、IPOC组、P组和PPOC组再灌注180 min时血清TNF-a和HMGB1浓度均显著降低；除IPOC组再灌注30 min时血清TNF-a和IL-6浓度显著增高之外,IPC组、P组和PPOC组再灌注30 min时血清TNF-a和IL-6浓度均显著降低；并且P组和PPOC组再灌注180 min时的血清IL-6浓度也显著降低,而IPOC组再灌注180 min时血清IL-6浓度显著增高。与IPC组相比,IPOC组再灌注30 min时血清TNF-a和IL-6浓度显著增高,再灌注180 min时血清TNF-a, IL-6和HMGB1浓度显著增高；P组再灌注30 min时血清TNF-a浓度以及再灌注180 min时血清TNF-a, IL-6和HMGB1浓度显著降低,但是再灌注30 min时IL-6血清浓度显著增高；PPOC组再灌注30 min时血清TNF-a和IL-6浓度以及再灌注180 min时血清IL-6和HMGB1浓度显著降低。与IPOC组相比,P组和IPOC组再灌注30 min时血清TNF-α和IL-6浓度以及再灌注180 min时的血清TNF-α, IL-6和HMGB1浓度也显著降低。第2部分：PNU282987后处理减轻大鼠在体心肌缺血-再灌注损伤最佳干预时间的实验研究根据第1部分的研究结果,我们设计了这部分实验,其目的是探讨在心肌缺血再灌注过程中何时实施PNU282987后处理能够获得最佳的心肌保护效应,以确定PNU282987后处理的最佳干预时间。将70只成年雄性SD大鼠(体重290-320g)麻醉后随机分为七组：空白对照组(S组,n=10)；对照组(C组,n=10)；缺血预处理组(IPC组,n=10)；PNU282987后处理组(P组,n=10)；再灌注30 min时PNU282987后处理组(P30组,n=10)；再灌注60min时PNU282987后处理组(P60组,n=10)和再灌注90 min时PNU282987后处理组(P90组,n=10)。C组、IPC组和P组的处理同第1部分实验,P30组、P60组和P90组的基本处理与C组相同,但分别在再灌注30 min、60 min和90 min时腹腔注射PNU282987 2.4mg/kg实施药物后处理。各项检测项目同实验第一部分。但仅在再灌注180 min时采血检测血清炎症细胞因子浓度。结果显示,各组大鼠的一般情况、心肌缺血前血流动力学参数的基础值和心肌缺血后15min的血流动力学参数比较差异均无显著统计学意义。再灌注期,C组的MAP显著低于S组、IPC组、P组、P30组和P60组。心肌缺血期,IPC组发生室性心律失常的大鼠数目较C组、P组、P30组、P60组和P90组显著减少,并且室性心律失常评分显著降低。与IPC组相比,C组、P30组、P60组和P90组再灌注初期室性心律失常评分显著增高。与C组相比,IPC组、P组、P30组、P60组和P90组再灌注180 min时的血清cTnI浓度和IS%值均显著降低。与IPC组相比,P组、P30组、P60组和P90组再灌注180 min时的血清cTnI浓度均显著降低,但是P组、P30组、P60组和P90组的IS%值显著增高。与P30组相比,P90组的IS%值显著增高。与S组相比,再灌注180 min时血清TNF-α、IL-6和HMGB1浓度在C组显著增高。与C组相比,再灌注180 min时血清TNF-a和HMGB1浓度在IPC组、P组、P30组、P60组和P90组显著降低,并且再灌注180 min时血清IL-6浓度在P组、P30组、P60组和P90组显著降低。与IPC组相比,再灌注180 min时血清IL-6和HMGB1浓度在P组、P30组、P60组和P90组显著降低,再灌注180 min时血清TNF-α浓度在P组显著降低,但再灌注180 min时血清TNF-α浓度在P30和P60组显著增高。与P组相比,P30组、P60组和P90组再灌注180 min时血清TNF-α和HMGB1浓度显著增高,但再灌注180 min时血清IL-6浓度显著降低。与P30组相比,P60组和P90组再灌注180 min时血清TNF-a和HMGB1浓度显著降低,但再灌注180 min时血清IL-6浓度显著增高。第3部分PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路在联合应用PNU282987后处理和缺血后处理心肌保护作用机制中地位的研究本部分实验的目的是探讨PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路在联合应用PNU282987后处理和缺血后处理心肌保护作用机制中的地位。25只成年雄性SD大鼠(体重290-320g)麻醉后随机分为五组：对照组(C组,n=5)；缺血预处理组(IPC组,n=5)；缺血后处理组(IPOC组,n=5); PNU282987后处理组(P组,n=5)、联合应用PNU282987后处理和缺血后处理组(PPOC组,n=5)。在开放LAD实施再灌注60min时结束实验,取大鼠左心室缺血区心肌标本。由心肌标本中提取总蛋白和总RNA,采用实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction, RQ-PCR)技术观察Akt和STAT3基因在心肌组织的表达情况,并通过免疫蛋白印迹分析(Western-blotting)技术观察心肌组织Akt和STAT3蛋白磷酸化情况。Western-blotting结果显示,与C组相比,IPC组的p-Akt显著增强,同时IPOC组的p-Akt和P-STAT3显著增强。与IPC组相比,P组的p-Akt和P-STAT3显著减弱,同时PPOC组的P-STAT3也显著减弱。与IPOC组相比,P组的p-Akt和P-STAT3显著减弱,PPOC组的P-STAT3也显著减弱。RQ-PCR结果显示,IPC组STAT3基因表达较C组和P组显著增强,而且IPOC组的Akt基因表达较PPOC组显著增强。结论通过本实验,我们得出以下结论：1.PNU282987后处理和缺血后处理对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用不尽相同。在减小心肌梗死面积方面两者的作用基本相同,但缺血后处理可显著抑制再灌注初期室性心律失常的发生,而PNU282987后处理对再灌注初期室性心律失常则无明显抑制作用。2.联合应用PNU282987后处理和缺血后处理能够获得增强的心肌保护作用,并且联合应用两种干预措施亦可弥补PNU282987后处理不能抑制再灌注初期室性心律失常的缺点。3.缺血预处理、PNU282987后处理、缺血后处理以及联合应用PNU282987后处理和缺血后处理均可明显抑制心肌缺血-再灌注过程中的炎症反应,并且是以联合应用PNU282987后处理和缺血后处理时的炎症反应抑制作用最强。但是,缺血预处理、PNU282987后处理和缺血后处理的炎症抑制作用在方式和强度方面存在有一定的差异。4.再灌注30 min时实施PNU282987后处理的心肌保护效果最佳。5.缺血预处理和缺血后处理的心肌保护作用涉及PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路激活,并且这两个信号转导通路也参与PNU282987后处理以及联合应用PNU282987后处理和缺血后处理的心肌保护作用,但不是主要机制。PNU282987的心肌保护作用机制可能与缺血预处理和缺血后处理不同。
唐路[6]2017年在《Dexpramipexole通过PINK1/Parkin通路调节线粒体自噬减轻心肌缺血再灌注损伤及其机制》文中研究说明研究背景急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)是由急性冠脉阻塞引起的一种高致残致死率的急性心肌缺血性坏死。尽早恢复冠脉血流是减少心梗面积改善心功能降低死亡率的最主要方法。但是再灌注本身诱发的心肌损伤,即心肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion,I/R)却成为制约冠心病疗效的瓶颈。心肌缺血再灌注损伤是一复杂现象,多种引起不同后果的因素参与其中。目前认为自噬(autophagy)与之相关,调控自噬可能成为新的治疗方法。线粒体自噬是在线粒体进行的一种特异性自噬,选择性清除受损线粒体以避免细胞死亡。PINK1/Parkin通路是哺乳动物细胞的特有线粒体自噬通路。PINK1/Parkin招募到膜电位受损线粒体上通过自噬体清除之。对维持由缺氧引起细胞稳态失衡是十分有益的。Dexpramipexole(DPX)是一种氨基噻唑衍生物。容易进入线粒体,可促进氧自由基和氮自由基失活,稳定线粒体膜。提高线粒体的产能效率,改善线粒体功能。因此,我们推论:心肌缺血再灌注过程中,通过DPX适度上调线粒体自噬,可能具有心肌保护作用。目的本课题拟通过构建小鼠心肌缺血再灌注(I/R)损伤模型及新生乳鼠原代心肌细胞缺氧复氧(H/R)模型研究DPX对缺血再灌注后心肌的保护作用及其作用机制,详细认知DPX的治疗作用,为心肌缺血再灌注损伤的治疗提供新的治疗方法。方法与结果采用新生1-2天SD乳鼠分离培养原代心肌细胞,通过细胞在充满N2的缺氧盒及缺氧液中缺氧培养3小时,后复氧3小时来构建心肌细胞H/R模型。研究示:DPX没有心肌细胞毒性;心肌细胞H/R过程中PINK1水平下降:DPX预处理上调PINK1 水平,MTT示DPX预处理改善心肌细胞H/R损伤后的存活率;LDH、TUNEL、Caspase-3示DPX预处理减轻H/R导致的细胞损伤。采用野生型雄性C57BL/6小鼠(体重20-25g),通过结扎心脏冠状动脉左前降支45分钟后松解结扎线24小时,构建小鼠心肌I/R损伤模型。研究结果示:DPX预处理减少I/R损伤后心肌梗死面积,改善心脏功能,减少心肌坏死,降低血清CK、LDH、cTnI的水平。进一步研究DPX的作用机制发现:DPX预处理改善H/R后心肌细胞线粒体功能,上调I/R自噬,上调H/R线粒体自噬,PINK1参与了 DPX对H/R损伤心肌的保护,DPX激活Parkin转运至受损线粒体,DPX激活H/R心肌PIINK1和 Parkin,但这一效果可被 PINK1 knockdow 和 Parkin knockdow 反转。结论1.DPX预处理缓解心肌细胞H/R损伤;2.DPX预处理减轻心肌I/R损伤;3.DPX减轻心肌缺血再灌注损伤可能是通过PINK1/Parkin通路上调线粒体自噬机制实现的。
杨珮宁[7]2017年在《羟考酮后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响》文中研究表明目的:探讨羟考酮后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。方法:成年健康雄性SD大鼠50只,体重200~300 g,采用随机数字表法分为5组(n=10):假手术组(S组)、缺血再灌注组(I组)、羟考酮后处理组(O组)、κ受体阻断剂nor-binaltorphimine(Nor-BNI)组(N组)和PKC选择性抑制剂白屈菜红碱(chelerythrine)组(CH组)。采用结扎冠状动脉前降支30min、开放120min的方法建立心肌缺血再灌注模型。S组只穿线,不结扎左冠状动脉前降支;N组与CH组分别于造模前给予Nor-BNI 2mg/kg和白屈菜红碱5mg/kg,给予后立即结扎;O组、N组与CH组于再灌注前2min经颈静脉注入羟考酮0.5mg/kg。于再灌注120 min时采集动脉血样,测定血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的浓度。快速处死大鼠后,取心脏,检测心肌梗死程度(TTC染色法)。结果:与S组比较,I组、O组、N组和CH组血清cTnI和CK-MB的浓度升高,心肌梗死体积明显增大(P<0.05);与I组比较,O组、N组和CH组血清cTnI和CK-MB的浓度降低,心肌梗死体积减小(P<0.05);与O组比较,N组和CH组血清cTnl和CK-MB的浓度升高,心肌梗死体积增大(P<0.05)。结论:羟考酮后处理可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,其作用机制可能与激活κ受体,进而激活PKC通道有关。
吕东岭[8]2016年在《黄蜀葵花总黄酮对缺血性损伤的保护机制研究》文中研究表明黄蜀葵花为锦葵科秋葵属植物黄蜀葵的干燥花,最先记录在《嘉佑本草》,分布广泛、资源丰富。《本草纲目》记载：其花气味甘、寒、滑、无毒,主治小便淋及催生,治诸恶疮脓水久不瘥者,作末敷之即愈,为疮家要药,消疽肿,浸油涂汤火伤等。现代研究证实黄蜀葵花提取物黄酮类成分不仅对疮疡有明显的治疗作用,对缺血导致心、脑、组织等损伤也具有明显的保护作用。本论文通过黄蜀葵花总黄酮在体外对内皮祖细胞抑制凋亡作用及对整体水平缺血性损伤的保护作用进行系统的探讨,研究内容分为以下几个部分：第一部分：综述当组织因各种原因导致的缺血发生后,组织的无氧代谢替换了有氧代谢,产生大量的糖酵解产物,导致组织水肿、炎症浸润及组织纤维坏死,组织损伤发生。对于缺血性损伤疾病的发病机制,目前公认的作用机制涉及能量代谢、钙超载、氧自由基、炎症细胞活化和各种促炎性细胞因子释放等因素,但其发病的具体分子机制尚未完全阐明,抑制组织损伤的药物也正处于研究阶段,目前临床尚无针对发生缺血后抑制组织损伤的保护、治疗性药物。各种治疗方向最终均作用于内皮细胞,促进内皮细胞向血管上皮细胞转化,促进血管新生达到组织修复、器官功能恢复的最终目的。传统医学在治疗缺血性疾病方面历史悠久,效果显著。其中黄蜀葵花在难治性疮疡治疗中体现出良好疗效,现代医学研究已经证实一定剂量的黄蜀葵花总黄酮对内皮细胞的迁移和分化具有明显的促进作用。内皮细胞来源于内皮祖细胞,而内皮祖细胞在体内数量极少,提高内皮祖细胞在缺血缺氧状态下抗氧化、抑制凋亡及抑制炎症能力并促进其转化为成熟的内皮细胞也是治疗缺血性疾病的关键。黄蜀葵花总黄酮作为传统中药的提取物,具有多组份优势,在复杂的缺血性损伤中起到保护并治疗的多靶点作用值得探讨。第二部分：实验研究通过黄蜀葵花总黄酮干预后肢缺血大鼠动物模型,观察TFA对炎症的抑制作用。经过后肢缺血大鼠实验模型的构建,给予黄蜀葵花总黄酮干预四周后处死大鼠,通过流式细胞技术检测血液中调节性T细胞亚群在模型及给药前后的变化水平,确定黄蜀葵花总黄酮具有抑制炎症,促进损伤部位愈合的作用；RT-PCR进一步验证了损伤部位肿瘤坏死因子α的表达水平,黄蜀葵花总黄酮可以显著抑制肿瘤坏死因子α的基因表达水平,抑制炎症反应在损伤部位的级联反应,通过促血管生成进而达到对缺血性损伤的保护。该部分的研究结果与后续药效学数据一致,也从另一个角度验证了黄蜀葵花总黄酮对缺血组织的保护作用,同时首次证实了黄蜀葵花总黄酮具有调控调节性T细胞细胞亚群的作用。通过黄蜀葵花总黄酮干预不同状态下的内皮祖细胞,观察TFA的抗凋亡作用。在体外条件下进行药理学实验研究,确定黄蜀葵花总黄酮在体外条件下可以保护内皮祖细胞的免受ROS引起的氧化损伤,对内皮祖细胞的增殖分化具有保护作用。内皮祖细胞经过H202处理后,发生明显的细胞凋亡,但是经过黄蜀葵花总黄酮的药物干预后,RT-qPCR检测发现凋亡相关基因Bak, caspase-3, caspase-9基因表达量明显降低,显示出黄蜀葵花总黄酮具有明显的抗凋亡作用。由此推测在整体水平,黄蜀葵花总黄酮具有相同的作用效果,可以保护缺血损伤部位内皮祖细胞的凋亡,进而发挥对缺血组织的保护作用。通过后肢缺血实验大鼠模型的构建,给药TFA治疗四周后处死大鼠,通过分子生物学实验进一步验证黄蜀葵花总黄酮的干预效果。黄蜀葵花总黄酮可以明显改善缺血大鼠后肢的炎症损伤水平,实验发现大鼠血清中的总自由基水平明显降低,caspase-3磷酸化水平降低,凋亡抑制蛋白Bcl-2的蛋白表达量明显升高,证实了黄蜀葵花总黄酮的对后肢缺血组织的保护作用。通过黄蜀葵花总黄酮干预心肌缺血再灌注损伤动物模型,观察TFA的心肌缺血再灌注损伤保护作用。实验发现黄蜀葵花总黄酮能显著改善心脏缺血再灌注损伤,显著改善心脏缺血再灌注氧化应激水平,抑制心脏缺血再灌注炎症水平,可以显著抑制心脏缺血再灌注状态下的炎症小体的激活。本课题研究表明：1、黄蜀葵花总黄酮在整体水平也可以降低损伤组织的炎症水平,下调肿瘤坏死因子α的表达,可以提高调节性T细胞亚群的比例来发挥抑制炎症,保护受损组织的作用。2、黄蜀葵花总黄酮在体外可以保护内皮祖细胞免受氧化应激导致的凋亡。3、黄蜀葵花总黄酮在整体水平可以有效的保护后肢缺血大鼠的损伤水平,促进血管新生,并抑制损伤部位的细胞凋亡。4、黄蜀葵花总黄酮在心肌缺血再灌注模型中可以降低再灌注部位的氧化应激水平,抑制缺血再灌注状态下的炎症小体NLRP3的激活进而发挥保护作用。
周绍昉[9]2008年在《心不停跳异位心脏移植供心缺血再灌注损伤的实验研究》文中研究表明第一部分同种大鼠不停跳与停跳心脏异位移植模型的建立与比较目的活体大鼠替代体外循环机辅助下不停跳大鼠异位心脏移植模型和改良Heron法大鼠异位心脏移植模型的建立并进行比较。方法取健康、清洁级、雄性Wistar大鼠422只,供受体各105只,体质量250～300g;另有53只用于替代体外循环机,159只用于采血,体质量280～300g。建立活体大鼠替代体外循环机辅助下大鼠同种异位不停跳心脏移植模型53例,以改良Heron法建立大鼠同种异位心脏移植模型52例。结果连续完成心不停跳心脏移植模型正式实验53例,心停跳心脏移植模型正式实验52例,建模成功率分别为94.3%和96.8%。结论该不停跳心脏移植模型是一种无缺血再灌注损伤、经济可靠和易于复制的器官移植研究动物模型。有利于进行不停跳心脏移植的基础研究。第二部分同种大鼠不停跳与停跳心脏异位移植供心心肌缺血再灌注损伤的研究目的通过建立同种大鼠异位不停跳与停跳心脏移植两种模型,并从供心保存后供心心肌水肿程度、外周血心肌酶含量、过氧化产物等角度分析对比,比较不停跳心脏移植与传统停跳移植在避免或减轻供心缺血再灌注损伤方面的差异性。方法建立活体大鼠替代体外循环机辅助下同种大鼠心不停跳异位心脏移植模型53例,以改良Heron法建立同种大鼠异位心脏移植模型52例。移植术后3天,每组随机取30例受体,麻醉开胸、开腹,采血并切取供心心肌组织测定观测指标。结果心脏移植3天后,检测心肌含水量,心肌酶谱(cTnI、CK-MB、LDH),受体血清丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(T-SOD)活性。A组(不停跳移植组)与B组(停跳移植组)组间差异均有统计学意义(P＜0.01)。结论心不停跳心脏移植模型,在整个移植过程中,冠脉循环不中断,心肌得到持续的氧合血灌注,心脏保持节律性跳动,为心肌提供了最接近于生理状态的有氧代谢、酸碱和电解质代谢环境,可有效避免IRI等心脏停跳所导致的种种缺点的发生,产生理想的心肌保护效果。
黄健男[10]2017年在《Hexarelin对缺血再灌注心肌的保护作用及机制研究》文中研究表明心肌缺血再灌注损伤是指缺血心肌组织在供血供氧恢复后心肌损伤反而加重的现象,主要表现为:1)氧化应激损伤;2)钙超载;3)炎症反应加重;4)心肌细胞凋亡;5)血管内皮功能障碍;6)无复流现象;7)心电活动不稳定等。Hexarelin是一种合成的生长激素释放肽,在心肌细胞缺血再灌注、心肌梗死、心肌纤维化和动脉粥样硬化等实验研究中被证实具有明确的心脏保护作用。Hexarelin的心血管效应是通过结合生长激素促分泌素受体1a(growth hormone secretagogue receptor 1a,GHSR 1a)及心脏特异性CD36受体实现的。目前hexarelin对动物在体的心肌缺血再灌注损伤的影响尚不十分明确,并且其作用机制也未阐明。本论文的研究目的是:1)通过建立大鼠心肌缺血再灌注模型,研究hexarelin对缺血再灌注心肌的保护作用;2)研究hexarelin对心肌缺血再灌注损伤的影响与IL-1信号通路之间的联系;3)明确hexarelin对IL-1信号通路的影响是否与心脏特异性GHSR 1a受体激活有关。我们选用6周龄雄性SD大鼠,通过结扎冠状动脉左前降支造成心肌缺血,30分钟后解除结扎形成再灌注,以此建立大鼠心肌缺血再灌注模型。建模后根据实验分组分别给予hexarelin、ghrelin或生理盐水共7天,然后通过超声心动图检查评估心脏收缩功能,丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测评估氧化应激损伤,组织切片分析评估存活心肌数量,以此综合评价hexarelin对心肌缺血再灌注损伤的影响,并与ghrelin作对比。接着我们通过免疫组化染色、RT-PCR和Western blot检测各实验组大鼠心肌组织中IL-1信号通路的表达变化,以评估hexarelin对缺血再灌注心肌组织IL-1信号通路的影响;并进一步利用GHSR 1a受体拮抗剂阻断GHSR 1a受体的激活后,通过Western blot观察对IL-1信号通路的影响,以探索心脏特异性GHSR 1a受体在此过程中的作用。我们的研究发现,hexarelin能够改善心肌缺血再灌注损伤后心脏收缩功能障碍,降低氧自由基的生成并增加存活心肌数量,并且其作用优于同剂量的ghrelin,尤其是在抑制氧自由基产生和改善射血分数方面。我们同时发现,hexarelin能引起缺血再灌注心肌组织中IL-1信号通路的表达变化,并且hexarelin对IL-1信号通路的影响能被GHSR 1a受体拮抗剂部分中和。基于上述实验结果,我们得出以下结论:1)hexarelin能够有效改善心肌缺血再灌注损伤,表现为抑制氧自由基的产生、增加存活心肌数量以及改善心脏收缩功能;2)hexarelin对缺血再灌注心肌的保护作用是通过抑制IL-1信号通路的激活来实现的;3)hexarelin对IL-1信号通路的影响是hexarelin激活心脏特异性GHSR1a受体的结果。本论文阐述了 hexarelin对缺血再灌注心肌的保护作用并对其作用机制进行了初步探讨,这为心肌缺血再灌注损伤的治疗提供了新的方向和思路。
参考文献：
[1]. 益气活血安神法通过抑制钙超载减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的实验研究[D]. 李俊平. 中国中医科学院. 2016
[2]. 迷走神经刺激后处理对大鼠在体心肌缺血—再灌注损伤的保护作用及机制的实验研究[D]. 王强. 北京协和医学院. 2012
[3]. 25-羟基—原人参三醇对大鼠实验性心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及机制的研究[D]. 王智昊. 吉林大学. 2015
[4]. 基于自噬和PI3K-Akt-mTOR信号转导通路研究缺血预处理对糖尿病心肌缺血/再灌注损伤的保护作用[D]. 孙超. 北京协和医学院. 2017
[5]. α7nAChR激动剂后处理对大鼠在体心肌缺血—再灌注损伤的保护作用及机制的实验研究[D]. 熊军. 北京协和医学院. 2011
[6]. Dexpramipexole通过PINK1/Parkin通路调节线粒体自噬减轻心肌缺血再灌注损伤及其机制[D]. 唐路. 南方医科大学. 2017
[7]. 羟考酮后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响[D]. 杨珮宁. 兰州大学. 2017
[8]. 黄蜀葵花总黄酮对缺血性损伤的保护机制研究[D]. 吕东岭. 南京中医药大学. 2016
[9]. 心不停跳异位心脏移植供心缺血再灌注损伤的实验研究[D]. 周绍昉. 广西医科大学. 2008
[10]. Hexarelin对缺血再灌注心肌的保护作用及机制研究[D]. 黄健男. 山东大学. 2017
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