王兴强[1]2002年在《体外培养大鼠破骨细胞的生物学特性研究》文中认为牙齿萌出、乳恒牙替换是儿童口腔中的正常生理现象，其中萌出途径的形成以及乳牙根的吸收，是牙齿正常萌出和替换的先决条件，在这些过程中破骨细胞(OC)起着重要作用。因此研究破骨细胞的激活、分化等生物学特性对了解和调控乳恒牙的萌出有重要意义。 破骨细胞是骨组织中参与骨吸收的多核巨细胞，来源于骨髓及脾脏中的造血干细胞。研究发现很多细胞因子，如1,25(OH)_2D_3、IL、M-CSF、PTH、PGE_2等对破骨细胞的形成有诱导作用，但目前的各种报道表明破骨细胞的体外培养难度大，且获得细胞的纯度很低，一般不超过10％，这就给进一步研究破骨细胞的生物学特性带来困难，因此寻找一种较好的诱导方法具有重要意义。关于各种诱导因子作用强弱的比较，目前国内尚未见报道，国外在这方面的研究也不多；而复合因子对破骨细胞体外形成的影响，国内外均未见到文献报道。 近年来，人们发现在破骨细胞表面有整合素受体表达，并参与破骨细胞的迁移与分化，介导细胞与骨基质的粘附以及细胞内外的信息传递，其表达水平与破骨细胞功能有密切关系。在破骨细胞膜上鉴定出来的整合素主要有α_Vβ_3、α_Vβ_1、α_5β_1、α_2β_1等，其中α_Vβ_3在破骨细胞的表达水平最强，是破骨细胞的主要粘附分子，但对破骨细胞不同的培养时期整合素的表达水平未见报道。 乳恒牙替换过程中，恒牙萌出的压力使受压组织首先转化为肉芽组织，然 第四军医大学硕土学位论文后分化出破骨细胞，最终导致了乳牙根的吸收。但压力对破骨细胞分化的影响，是机械刺激直接引起细胞分化，还是压力作用于其它细胞，分泌细胞因子，促进破骨细胞分化，目前有关这方面的研究仅见到 McAllister（2000年）的一篇报道，他们采用流体液压方法对破骨细胞单核前体细胞施加外力，可促使其自分泌前列腺素，进而促进破骨细胞的分化。为此，本研究完成了以下4个实验： 实验1为单因子对体外培养大鼠破骨细胞的诱导作用。采用大鼠脾细胞和成骨细胞联合培养，即将上述两种细胞悬液加入培养板中共同培养。实验分6组，实验组分别加入l，25（OH）2D3、PTH、PGEZ、IL－ie、M－CSF，对照组不加诱导因子，各组用含10％胎牛血清的a－MEM培养液，于37OC、5％CO卜饱和湿度下培养。并采用倒置显微镜观察细胞形态，1’’’－x－染色及扫描电镜观察牙本质片吸收陷窝等破骨细胞鉴定方法，对5种诱导因子的作用强弱进行了比较，结果表明： 多核细胞在体外培养后第sd开始出现，第sd达到高峰，以后逐渐减少，至第 14d基本消失；5种诱导因子对破骨细胞的体外形成均有诱导作用，其中以1，25（＊H）。q的作用最强…＜0刀1人其它诱导因子间无显着性差异。 实验2为双因子对体外培养大鼠破骨细胞的诱导作用。细胞培养和鉴定方法同实验 1，实验分 6组，实验组分别加入 l，25（OH＼ZD广 M（SF、l，25（OH）2D3＋PTH、1，25（OH）2D3＋PGEZ、l，25（OH）2D3＋IL－lp，并设 1，25（OH）刃。单因子对照组和空白对照组，观察双因子对破骨细胞的诱导作用，并与单因子进行比较，结果表明： 破骨细胞的生长状况同实验卜 双因子的诱导作用强于单因子，其中1，25（ OH） 2D3十M一CSF、1，25（OH）2D3＋P＊的效果最好，尤以前者更明显，细胞纯度可达20％。 实验3为体外培养大鼠破骨细胞整合素Q小。的表达及意义。采用骨髓腔冲洗法，a－MEM培养液冲洗大鼠长股骨髓腔，将冲洗液过滤后接种于培养板 3 第四军医大学硕士学位论文中。实验分两组，实验组加入l，25（OH）2D3＋M－CSF，对照组不加药，倒置显微镜下观察细胞生长及分化情况。细胞接种后第Zd开始，采用原位杂交技术检测各组细胞中整合素ave。InRNA的表达，观察不同培养时期破骨细胞中整合素Qvp3mRNA的表达，并用TRAP染色作对照，结果表明： 在培养后第3d的破骨细胞单核前体细胞中即有整合素avP。mRNA的表达，第sd才出现多核细胞及TRAP的阳性染色，说明原位杂交检测破骨细胞整合素Qv日3的方法优于形态学观察法和TRAP染色法，故整合素Qv日3的原位杂交检测可作为鉴定破骨细胞的一种敏感性高的新检测方法；培养后第sd，整合素 Qve3InRNA的表达达到最大值，此时破骨细胞的数量也最多，说明整合素与破骨细胞的分化和骨吸收的功能密切相关。 实验4为压力对体外培养大鼠破骨细胞的影响。本试验采用可控压力加载装置对脾细胞单独培养的单核细胞施加间断性压力，实验分6组，每组一个培养板，实验组每日分别置于加压装置中2次，每次lh，加力间隔时间为sh，所力压力 A组为 50Kpa，B组为 70Kpa，C组为 100Kpa，D组为 120Kpa，E组为 150Kpa，F组不加压为对照组。细胞于培养第 Zd开始加压，培养 2周，观察其对体外培养破骨细胞分化的影响，并用形态学观察及整合素Qv日3的检测等方法了解细胞生长状况，结果表明： 大小适
孙华[2]2007年在《犬乳恒牙替换期血管内皮生长因子的表达及意义》文中认为动物牙齿及颌面部生长发育的重要阶段包括乳恒牙替换,其中有乳牙根、牙槽骨的吸收,恒牙胚的发育和恒牙萌出等一系列复杂的生理过程[1]。乳恒牙替换是儿童口腔中的正常生理现象,其中萌出通道的形成,牙槽骨的改建以及乳牙根的吸收,是牙齿正常萌出和替换的先决条件,在这些过程中破骨细胞(OC)起着重要作用,它不仅参与吸收乳牙根、牙槽骨等组织,还为恒牙胚的发育和萌出开辟道路[2]。但其机制至今不明,因此研究破骨细胞的激活、分化、成熟及表达等生物学特性对了解和调控乳恒牙的萌出有重要意义。血管内皮生长因子(VEGF)是由血小板、巨核细胞、内皮细胞和成骨细胞或肿瘤细胞合成和分泌的多功能细胞素,是一种由亚基内及亚基间二硫键交联形成的同源二聚体糖蛋白。VEGF是一类高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素,具有促进内皮细胞增殖、血管生成、增加血管通透性以及血管维持等功能。VEGF既是主要的血管形成因子,又是骨生长因子,与骨代谢关系密切。VEGF能明显提高大鼠成骨细胞活性、增强其迁移、增殖、分化并加速其骨形成[3]。VEGF可促进破骨细胞分化,维持骨髓功能,且达到类似于巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的作用。许多研究表明,VEGF在骨代谢过程中协调着骨细胞的消长、细胞外基质的改建、血管增生及骨形成、骨吸收间的关系。本研究采用细胞培养、免疫组织化学、原位杂交、图像分析等方法,观察了体外培养大鼠破骨细胞中VEGF表达情况,以及犬乳恒牙替换过程中乳牙牙根稳定期、乳牙根吸收期、恒牙列期叁个阶段的乳牙牙根、牙槽骨中的破牙细胞、破骨细胞和恒牙胚的成釉细胞、成牙本质细胞中VEGF的表达情况。初步探讨VEGF在乳恒牙替换期和体外培养破骨细胞中所起的作用。主要研究内容及结果如下:第一部分犬乳恒牙替换期VEGF表达的研究分别采用免疫组化和原位杂交方法,观察犬乳牙根稳定期、乳牙根吸收期和恒牙列期中VEGF的表达染色情况。1.犬乳牙牙根稳定期:犬乳牙牙根尚未发生生理性根吸收,乳牙根周围牙槽骨未见吸收陷窝。恒牙胚处于牙冠发育阶段,恒牙胚牙本质、牙釉质基质开始形成。此时VEGF在牙槽骨的破骨细胞、成骨细胞免疫组化及原位杂交染色阳性,提示VEGF可能参与破骨细胞的分化、成熟,参与犬乳牙牙根稳定期的骨质改建。恒牙胚的成釉细胞、成牙本质细胞VEGF免疫组化及原位杂交染色也为阳性,推测VEGF可能参与恒牙胚的发育过程。2.犬乳牙牙根吸收期:犬乳牙牙根发生生理性吸收,乳牙根面可见多数吸收陷窝,呈蚕食状,陷窝中可见多核破牙细胞。牙囊周围及接近牙胚的牙槽骨陷窝可见多核破骨细胞。恒牙胚冠部牙本质、牙釉质进一步形成和矿化。此时可见VEGF在乳牙根吸收面的破牙细胞、牙槽骨中的破骨细胞、成骨细胞、恒牙胚的成釉细胞、成牙本质细胞免疫组化染色阳性,其中破骨细胞染色为强阳性,提示此期VEGF蛋白表达增强,以促进牙槽骨和乳牙根的吸收。破骨/破牙细胞原位杂交结果为强阳性,成骨细胞、恒牙胚的成釉细胞、成牙本质细胞原位杂交结果阳性,提示此期破骨细胞分泌、合成VEGF功能增强。3.犬恒牙列期:乳牙脱落,恒牙萌出。牙槽骨破骨细胞免疫组化及原位杂交染色弱阳性,染色灰度值均显着增加,提示破骨细胞VEGF分泌量明显减少,牙槽骨处于骨质改建较弱的时期。第二部分体外培养大鼠破骨细胞VEGF表达的研究分别采用免疫组化和原位杂交方法,观察体外培养大鼠破骨细胞VEGF表达的情况。实验取大鼠长骨骨髓,采用骨髓诱导培养方法,培养体系中加入1,25(OH)2D3、IL-1β诱导破骨细胞分化,进行细胞培养,倒置显微镜观察破骨细胞形成情况。细胞培养6d后可见有多核巨细胞形成。取原代培养9d后的细胞爬片进行破骨细胞特征性染色鉴定,出现抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性的多核细胞,并且与细胞共同培养的骨片上出现吸收陷窝,即为破骨细胞样细胞。取所培养的破骨细胞样细胞进行VEGF免疫组化和原位杂交染色,结果均为阳性,证实体外培养大鼠破骨细胞中有VEGF蛋白和mRNA的表达,提示VEGF可能参与破骨细胞的分化与成熟。
刘应芬[3]2007年在《流体剪应力对去卵巢骨质疏松大鼠破骨细胞骨吸收功能的影响》文中指出研究背景骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是中老年人的一种常见病，是以骨量减少、骨组织微观结构退化为特征，致使骨的脆性增高而骨折危险性增加的一种全身性疾病。一般情况下，3位女性有1人易患骨质疏松症，而男性一般是12人中有1人患骨质疏松症。可见，骨质疏松症是发病率、死亡率和医疗保健消耗较大的疾病。因此，骨质疏松症的预防和治疗是很重要的。影响骨质疏松症发生发展的因素有很多，力学负荷是其重要因素之一。体外研究已证实，力学负荷在正常骨组织的发育过程中具有重要的作用。骨组织中的腔隙结构构成纵横交错的叁维网络，这些腔隙中充满了组织液。正常活动对骨组织施加的机械负荷，将引起这些腔隙体积的变化，从而形成液压促进流动，因此认为在骨组织内，这种液体的流动产生的剪应力可能在骨的生长发育过程中发挥了重要作用。然而，破骨细胞对剪应力是否敏感，破骨细胞是如何将力学刺激信号转换成生物化学信号，在骨质疏松中破骨细胞对力学刺激的敏感性是否有变化，目前仍不清楚。因此，我们假设，破骨细胞和前提破骨细胞是剪应力敏感细胞，破骨细胞表面integrinα_vβ_3参与破骨细胞中力学信号转导。本研究的目的就是：1)探讨剪应力对正常和去卵巢骨质疏松大鼠破骨细胞骨吸收功能活性的影响；2)探讨破骨细胞integrinα_vβ_3在力学信号传导中可能的分子机理。研究方法1．骨质疏松动物模型的建立选用健康6月龄雌性未生育Sprague-Dawley(SD)大鼠，采用双侧卵巢切除术，建立模拟人绝经后骨质疏松动物模型。动物实验分为2组：对照组(control)，不切除卵巢、卵巢切除组(ovx)，切除双侧卵巢。手术后3个月处死动物，检测动物体重、子宫重量；做骨组织病理学切片，观察骨组织形态学和骨细胞功能活性的变化，以确定模型建立成功。2．破骨细胞体外培养无菌分离大鼠腰椎(L_(1-5))，采用机械分离法和1，25-(OH)_2VitD_3全骨髓诱导法相结合，从大鼠椎骨骨髓细胞中获取破骨细胞，以细胞形态、TRAP染色阳性、骨吸收陷窝的形成、细胞骨架等指标观察、鉴定破骨细胞。3．羟基磷灰石涂层盖玻片的制备由于对骨片的加力装置设计较难，考虑人体内骨组织无机成分主要是羟基磷灰石。因此，我们采用羟基磷灰石涂层血盖片的方法来模拟体内骨基质吸收情况。以Ca(NO_3)_2·4H_2O和P_2O_5为原材料，采用溶胶-凝胶法制备羟基磷灰石涂层盖玻片，模拟破骨细胞在骨片上的骨吸收情况。4．剪应力对破骨细胞功能活性影响的检测1)采用本室自制的流体剪应力加载系统对所选用的破骨细胞分别施加0、5.97、11.36、16.08、20.54dyne/cm~2的剪应力，作用30min；每次剪应力作用结束后，收集灌流液10ml冻存，备用。用紫外分光光度仪检测TRAP活性；采用羟基磷灰石涂层盖玻片模拟体内骨基质吸收情况，以扫描电子显微镜和图像分析软件检测骨吸收陷窝数量和面积，观察不同剪应力强度对正常和骨质疏松大鼠破骨细胞功能活性的影响；2)再根据以上实验结果，选取对破骨细胞功能活性影响最大的剪应力强度，观察剪应力作用不同时间，正常和骨质疏松大鼠破骨细胞骨吸收功能活性的变化；5．剪应力对破骨细胞表面用integrinα_vβ_3表达影响的检测采用细胞免疫组织化学技术检测剪应力作用对破骨细胞表面integrinα_vβ_3表达的影响6．破骨细胞表面integrinα_vβ_3表达量与破骨细胞骨吸收功能关系分析用integrinβ_vβ_3单克隆抗体(sc-7312)孵育破骨细胞30min，阻断破骨细胞表面integrinα_vβ_3的表达，对破骨细胞作用相同的剪应力，同样用扫描电子显微镜技术和图像分析软件分析破骨细胞骨吸收功能的变化。结果1．去卵巢手术后3个月，OVX组大鼠体重明显增加(p＜0.01)；子宫明显萎缩，重量降低(p＜0.01)；骨组织病理学切片显示骨小梁分离、断裂，数量减少，骨髓腔内含有大量脂肪细胞，骨胶原中有大量新生胶原纤维形成，破骨细胞骨吸收残迹明显增加，符合骨质疏松的特点。2．以机械分离法和1，25-(OH)_2VitD_3全骨髓诱导法相结合从大鼠椎骨骨髓细胞中获取破骨细胞，在诱导培养第7天，所获破骨细胞数量最多，TRAP活性最佳。且在培养第1天骨质疏松组大鼠破骨细胞数和TRAP活性高于正常大鼠组。3．羟基磷灰石(HA)涂层盖玻片可模拟骨基质吸收情况，破骨细胞在HA盖玻片上培养可以形成骨吸收陷窝。4．在我们所选用的剪应力范围内，作用破骨细胞30min后，正常大鼠和骨质疏松大鼠破骨细胞TRAP活性、骨吸收陷窝数量和面积均较静态时增高(P＜0.01)，以16.08dyne/cm~2的剪应力作用最明显；但骨质疏松大鼠破骨细胞功能活性的增高低于正常大鼠破骨细胞(p＜0.05)。5．16.08dyne/cm~2的剪应力作用破骨细胞不同时段，随着作用时间延长，破骨细胞骨吸收陷窝数量和面积逐渐增加，至60min达峰值，之后骨吸收陷窝数量和面积无明显增长趋势。6．破骨细胞表面integrinα_vβ_3表达随剪应力作用时间延长而增强，至作用60min，达峰值，之后呈下降趋势。7．阻断破骨细胞表面integrinα_vβ_3后，作用相同剪应力破骨细胞骨吸收陷窝数量和面积的增长明显低于integrinα_vβ_3阻断前(p＜0.05)。结论1．健康6月龄雌性未生育SD大鼠去卵巢手术后3个月，可建立去卵巢后大鼠骨质疏松动物模型。2．以机械分离法和1，25-(OH)_2VitD_3全骨髓诱导法相结合，培养的破骨细胞在第7天最多，TRAP活性最强。3．羟基磷灰石涂层盖玻片，可模拟体内骨基质吸收情况；可代替骨片检测破骨细胞骨吸收功能。为体外破骨细胞骨吸收功能的检测提供了一种新的研究手段。4．一定强度剪应力作用，可促进破骨细胞骨吸收功能活性。一定时段剪应力作用可上调破骨细胞表面integrinα_vβ_3的表达，促进破骨细胞骨吸收活性增强，且这种变化具有时间依赖性。6．阻断破骨细胞表面integrinα_vβ_3后，剪应力促进破骨细胞骨吸收活性的作用明显降低，表明integrinα_vβ_3参与破骨细胞的力学信号转导，且与破骨细胞骨吸收功能密切相关。7．骨质疏松大鼠破骨细胞对剪应力作用的敏感性明显低于正常大鼠破骨细胞。
吴兴临[4]2008年在《依那西普抑制大鼠破骨细胞骨吸收功能实验研究》文中进行了进一步梳理目的假体无菌性松动是人工关节置换术后最常见的并发症之一,也是人工关节置换术远期失败的主要原因,它是一个复杂的、多步骤和多因素参与的炎性因子与破骨细胞相互作用的过程。越来越多的研究证实,无菌性松动假体周围肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα, TNF-α)明显增高,增高肿瘤坏死因子可导致破骨细胞分化活性增强,继而形成假体周围异常骨溶解导致假体无菌性松动和失败。依那西普(Etanercept)是全人源化抗肿瘤坏死因子α拮抗剂,以TNF-α为靶标的治疗药物,其机制为竞争性和TNF-α受体结合,阻断TNF-α和细胞表面TNF受体结合,降低TNF-α活性,从而达到治疗与TNF-α相关的疾病。近年研究显示,依那西普不但能使类风湿症患者状体征改善而且阻止局部骨结构破坏,这可能与依那西普能通过抑制破骨细胞活性相关。目前,抑制破骨细胞生长及功能的破骨细胞靶疗法在治疗假体周围异常骨溶解和无菌性松动等方面日益得到重视。因此,本研究以此为切入点,一方面通过体外大鼠骨髓细胞悬液诱导培养破骨细胞方法,明确体外培养的大鼠破骨细胞生物学特性即分化、成熟、活性、骨吸收特征与TNF-α的相关性。另一方面通过对不同浓度的依那西普添加后,体外TNF-α、PTH(Parathyroid hormone,PTH)诱导培养的骨片上大鼠破骨细胞骨吸收陷窝数的观察以及这些因子表达水平之间是否存在差异性,明确依那西普是否通过阻断TNF-α诱导的破骨细胞,而抑制骨片上骨吸收陷窝。通过以上研究,进一步明确依那西普拮抗TNF-α,抑制破骨细胞的形成、功能的机制;以及不同浓度条件下依那西普抑制破骨细胞能力;探讨依那西普抑制抑制TNF-α刺激培养破骨细胞分化形成和功能的机制;探寻假体周围骨溶解预防、治疗的新途径。方法预先制备4 mm×4 mm牛皮质骨骨磨片。采用出生4-6天的SD大鼠,拉颈处死,75%乙醇侵泡3 min。无菌条件下分离四肢长骨(股骨和胫骨),在冷D-Hank’s中去除骨骺及骨表面软组织,用不含血清的α-MEM培养液冲洗髓腔,收集骨髓细胞并用培养液洗涤2次,均匀处理后分别置于未处理、PTH浓度为10-8M、TNF-α浓度为10 ng/ml含15%胎牛血清的α-MEM培养液中诱导培养,细胞悬液以1.5×109/L的密度移入细胞培养板,孔内预先放置骨片。37℃、体积分数5%CO2条件下培养20 min后冲去未贴壁的细胞。每3天换一次培养液,换液时分别加入1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、1000 ng/ml的依那西普,培养10天。此外,另设对照组加入1 ug/ml IgG1抗体。培养10天后取出骨片,自然凉干。甲苯胺蓝染色5 min,蒸馏水冲洗,光镜(×40)下观察骨吸收陷窝;骨磨片行扫描电镜检查;对扫描电镜图像用image-pro plus 5.0图像分析软件分析骨吸收陷窝的面积及不同浓度依那西普抑制骨吸收陷窝形成的面积。统计学分析:每次实验中各组中剂量亚组分别设3个骨磨片,实验重复3次。数据均以均数±标准误表示,所有结果均以SPSS13.0分析。在比较骨吸收陷窝面积差异时采用Student’s t检验,以P <0.05认为差异有统计学意义。结果①PTH、TNF-α均能够直接诱导大鼠BMCs中破骨细胞前体细胞分化为具有骨吸收活性的破骨细胞。②TNF-α能促破骨细胞分化;在TNF-α组,小剂量依那西普即能抑制破骨细胞骨片吸收陷窝面积;而依那西普10 ng/ml组就近完全抑制破骨细胞骨片吸收陷窝面积。在未处理组、PTH组,依那西普呈剂量依赖性抑制破骨细胞骨片吸收陷窝面积;剂量越大,抑制越明显,但不能完全抑制;且未处理组较PTH组更为明显。③在对照组IgG1作用下破骨细胞骨吸收面积无明显变化。结论①在体外实验中通过骨片吸收陷窝面积抑制率检测,验证了依那西普能抑制破骨细胞骨吸收功能。同时发现,依那西普大剂量组(1000ng/ml)能明显减少实验各组的骨吸收面积。②在TNF-α组,依那西普10 ng/ml组就近完全抑制。在未处理组、PTH组,依那西普呈剂量依赖性抑制破骨细胞形成和功能;在IgG1对照组不能抑制破骨细胞骨吸收功能。③本实验发现在单独TNF-α刺激组骨吸收陷窝面积没有增加;而在PTH组骨吸收陷窝面积增大。这些暗示是TNF-α、PTH通过不同的途径影响破骨细胞骨吸收功能的;TNF-α单独刺激诱导破骨细胞分化或破骨细胞功能是不足的。
王兴强, 杨富生[5]2002年在《不同诱导因子对大鼠破骨细胞样细胞体外形成的影响》文中研究指明目的 研究不同诱导因子对大鼠破骨细胞样细胞体外形成的影响。方法 建立大鼠脾细胞与成骨细胞的联合培养体系 ,将细胞悬液接种于预置盖玻片或牙本质片的 2 4孔培养板内 ,实验组分别加入骨吸收因子1,2 5 (OH ) 2 D3 、PTH、PGE2 ,对照组不加药 ,每 3d换培养液并加药 1次。结果 培养 5d后实验组可见多核细胞形成 ,并逐渐增多 ,TRAP染色阳性 ,电镜下见牙本质片上有吸收陷窝形成 ,其中以 1,2 5 (OH) 2 D3 组结果最明显。结论 体外培养大鼠破骨细胞样细胞的形成需要骨吸收因子的诱导 ,1,2 5 (OH) 2 D3 的诱导作用最强
张毅[6]2013年在《阿司匹林对大鼠破骨细胞分化成熟及RANK基因表达的影响》文中进行了进一步梳理背景：骨重建的内稳态是由成骨细胞（Osteoblast，OB）的骨形成和破骨细胞（Osteoclast，OC）的骨吸收共同协调完成的，破骨细胞的异常增多常导致这种内稳态被打乱。破骨细胞的分化成熟依赖于核激活因子κB受体（Receptor Activator ofNuclear Factor-κB，RANK，又称为TNFRSF11A）的配体（Receptor Activator of NuclearFactor-κB Ligand，RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage Colony-StimulatingFactor，M-CSF）的作用。诱导破骨细胞形成的关键是由多种细胞因子介导的OPG/RANKL/RANK系统和RANK信号通路。代谢性、退行性和肿瘤性骨疾病或骨溶解都涉及到了OPG/RANKL/RANK系统，OPG/RANKL/RANK系统在破骨细胞形成中的核心作用使得RANK成为潜在治疗骨质疏松症（Osteoporosis，OP）的核心靶点。本课题组前期研究发现小剂量的阿司匹林可以有效的使去势雌性大鼠骨质疏松模型的骨密度增加，提高骨的力学强度，改善骨小梁的叁维结构和促进骨小梁的重建~([1,2])。且在人骨髓间质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSC）体外培养中发现低中浓度阿司匹林作用于骨髓基质干细胞可促进其骨向分化和成骨细胞特性表达，表明阿司匹林有促进骨代谢合成的作用[3]，然而其防治绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis, PMOP）发病的分子机制尚不明了，文献报道可能与绝经后失去雌激素的保护、破骨细胞激活而进入骨的高代谢状态有关[4]，阿司匹林是否通过该途径而发挥抗绝经后骨质疏松作用？这正是本研究希望阐明的问题。目的：研究不同浓度阿司匹林对体外培养大鼠破骨细胞的分化成熟及RANK基因表达水平的影响，以探讨阿司匹林防治绝经后骨质疏松症可能的分子机制，从而为阿司匹林创新应用于防治绝经后骨质疏松症提供全新的理论依据。方法：（1）建立由可溶性核激活因子κB受体的配体（soluble ReceptorActivatorof Nuclear Factor-κB Ligand, sRANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（MacrophageColony-Stimulating Factor, M-CSF）共同作用的大鼠破骨细胞原代诱导培养体系。（2）实验分为6组：A组正常对照组；B组雌激素组（17β-雌二醇10-6mmol/L）；不同浓度的阿司匹林组（C组0.25mmol/L、D组0.5mmol/L、E组1.0mmol/L、F组1.5mmol/L）。（3）诱导培养后于不同时间点对各组破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-Resistant Acid Phosphatase，TRAP）染色，观察细胞形态，并计数破骨细胞数量。（4）将各组破骨细胞接种于骨磨片上，建立破骨细胞-骨磨片活性分析模型，于不同时间点对骨磨片进行光镜和扫描电镜观察，分析计算骨吸收陷窝面积比例。（5）RT-PCR技术检测破骨细胞RANK基因mRNA的表达。（6）ELISA法检测破骨细胞RANK蛋白分泌表达情况。结果：（1）与正常对照组相比，雌激素组和各阿司匹林实验组的破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积均低于正常对照组，差异有显着统计学意义（P＜0.05）；且随着阿司匹林浓度的增加，阿司匹林组TRAP阳性多核破骨细胞数量、骨吸收陷窝面积逐渐减少直至消失，组间差异亦有显着差异（P＜0.05）。低浓度阿司匹林组（0.25mmol/L）与雌激素组相比没有明显差异；但中、高浓度阿司匹林实验组（0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L）破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积减少，与雌激素组有显着统计学差异（P＜0.05）。（2）RT-PCR结果显示，与正常对照组相比，雌激素组和阿司匹林各组均可抑制破骨细胞RANK基因表达，且阿司匹林的抑制作用具有剂量依赖性（P＜0.05）。（3）ELISA结果显示，与正常对照组相比，雌激素组和阿司匹林各组均可抑制破骨细胞RANK蛋白表达水平，且阿司匹林的抑制作用具有剂量依赖性（P＜0.05）。结论：阿司匹林具有体外抑制大鼠破骨细胞RANK基因和蛋白表达的作用，也可以抑制破骨细胞的分化成熟及骨吸收功能，且具有剂量依赖性，这可能是阿司匹林通过抑制破骨细胞而具有抗骨质疏松作用的关键分子机制。该研究结果为阿司匹林这一老药创新应用于绝经后骨质疏松的治疗提供了理论依据。
袁涛[7]2012年在《蛇床子素骨靶向药物的合成及体外调节OPG/RANKL系统抗骨质疏松的实验研究》文中研究指明目的应用水溶性壳聚糖衍生物(NSC)为骨靶向载体,合成蛇床子素骨靶向新型化合物(NSC-OST);观察NSC-OST对大鼠体外培养成骨细胞(Osteoblast,OB)的增殖及骨保护素(OPG)、核因子κB受体活化因子配基(RANKL)表达的影响,观察NSC-OST对破骨细胞(Ostcoclast, OC)数量及骨吸收功能的影响,初步探讨其作用机制。方法①通过物理包埋、综合透析等方法,制备蛇床子素骨靶向药物。②取新生大鼠颅盖骨进行OB分离培养。培养7d后采用碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定OB,培养14d后采用茜素红染色法鉴定OB；随机将OB分为5组,即空白对照组及终浓度为10-7mmol/L、10-6mmol/L、10-5mmol/L、10-4mmol/L NSC-OST组,分别加入不同浓度的NSC-OST作用不同时间,用MTT法检测成骨细胞增殖情况。不同浓度的NSC-OST作用成骨细胞7d,采用ELISA法检测药物成骨细胞OPG、RANKL的表达。③取新生乳大鼠股骨分离OC分离培养。分组及干预方法同前,培养7d后采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定破骨细胞并进行阳性细胞计数；利用甲苯胺蓝对骨吸收陷窝染色并在图像分析仪上测定骨吸收陷窝的面积。结果①本研究成功合成了具有壳聚糖衍生物结构的N-辛基-O-磺酰基壳聚糖(NOSC),并成功制备了NSC-OST.②体外分离培养的细胞具有典型成骨细胞形态学及生物学活性,碱性磷酸酶、茜素红染色均呈阳性结果；作用24h、48h、72h终浓度为10-5mmol/LNSC-OST可促进OB增殖(P<0.05),作用72h,终浓度为10-6mmol/L可促进OB增殖(P<0.05)；终浓度为10-mmol/L NSC-OST具有明显抑制OB增殖的作用(P<0.01)。终浓度为10-6mmol/L和10-5mmol/L组促进成骨细胞OPG的表达、抑制RANKL的表达；终浓度为10-6mmol/L、10-5mmol/L组可显着上调OPG/RANKL的比值(P<0.01)。③分离培养的细胞与OC相似,TRAP染色可见胞浆呈酒红色；加药培养48h,10-5mmol/L、10-4mmol/L组破骨细胞数量低于空白组(P<0.05),10-6mmol/L、10-5mmol/L、10-mmol/L组骨吸收陷窝面积低于空白组(P<0.05)；96h时,不同浓度的NSC-OST组破骨细胞和骨陷窝面积均低于空白对照组(P<0.05, P<0.01),10-6mmol/L、10-5mmol/L、10-4mmol/L组组间骨吸收陷窝面积差异无统计学意义(P>0.05)。结论①本研究以水溶性壳聚糖衍生物(NSC)为骨靶向载体,成功制备并表征了蛇床子素壳聚糖衍生物胶束,其具有较好的水溶性,有利于顺利达到药物的有效治疗浓度及治疗部位；②适当浓度的NSC-OST可以促进成骨细胞的增殖及OPG的表达,抑制RANKL的分泌,同时能降低破骨细胞的数量,减少骨吸收陷窝的面积,从而达到抗骨质疏松的目的,可为研发靶向选择性高、局部作用强的新型抗骨质疏松药提供有益参考。
陈德才, 魏松全[8]2001年在《体外培养SD大鼠破骨细胞凋亡及其规律探讨》文中认为目的证实体外培养SD大鼠破骨细胞存在凋亡现象，并探讨其凋亡的规律。方法体外培养SD大鼠破骨细胞，采用高倍显微镜下形态学观察法和DNA 3－OH末端缺口原位标记法(TUNEL法)标记凋亡细胞，并推测其凋亡的规律。结果体外培养的破骨细胞存在凋亡现象，凋亡破骨细胞的数目和比例随着培养时间的延长而逐渐增加，在培养的第3、4、5、6天其凋亡率分别为10％、14％、34％、50％。结论体外培养的破骨细胞存在凋亡现象，随着培养时间的延长凋亡率逐渐增加。
董强, 夏茜, 马洪, 王永[9]2012年在《维生素D_3联合地塞米松诱导大鼠破骨细胞的体外培养》文中进行了进一步梳理目的:观察VitD3联合地塞米松对大鼠骨髓体外培养破骨细胞的影响,探索提高破骨细胞体外培养效果的有效途径。方法:实验分为两组,以维生素D3骨髓诱导法为对照组,以维生素D3联合地塞米松诱导SD大鼠骨髓细胞为实验组,通过Trap染色、甲苯胺蓝染色和扫描电镜观察鉴定破骨细胞,并对计数结果进行统计学分析。结果:实验组与对照组均获得Trap染色阳性及在体外有噬骨能力的破骨细胞,实验组破骨细胞计数(培养第7天)多于对照组,有统计学差异(P<0.05)。结论:与维生素D3单独诱导相比,维生素D3联合地塞米松体外诱导大鼠破骨细胞的效率更高。
尚可, 王燕, 李玉坤[10]2007年在《正常和链脲佐菌素诱导糖尿病模型大鼠体外破骨细胞样细胞的培养方法》文中指出目的:建立成年正常大鼠和链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠骨髓体外破骨细胞样细胞培养的方法。方法:实验于2003-05/2004-03在河北医科大学第叁医院中心实验室完成。①雌性Wistar大鼠,2.5～3.0个月龄,用链脲佐菌素溶液,按60mg/kg单剂量进行腹腔注射,注射48h后检测血糖,血糖≥16.7mmol/L视为诱导糖尿病模型成功。随机选择链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠及成年正常大鼠各1只,麻醉下处死,无菌条件下取股骨,收集骨髓。②用α-MEM冲洗骨髓细胞,并稀释骨髓细胞至1.5×109L-1的浓度,将细胞悬液置于24孔培养板内,培养液为无酚红α-MEM,其中含体积分数为0.1的胎牛血清、30μg/L细胞核因子κB受体活化因子配基、10μg/L巨噬细胞集落刺激因子。培养板置于体积分数为0.05的CO2和37℃培养箱内培养,用倒置相差显微镜观察破骨细胞样细胞形态变化。③细胞培养7d后,进行细胞固定和抗酒石酸酸性磷酸酶染色,抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性且细胞核≥3个的细胞认定为破骨细胞样细胞。④在倒置显微镜下,计数破骨细胞样细胞数。结果:①倒置显微镜下动态观察细胞,发现细胞的形态逐渐由圆形变为椭圆形、长梭形和不规则形状。在培养的第3天始,单核细胞融合为多核细胞,破骨细胞样细胞形成。在第5,6天破骨细胞样细胞形成明显增多。②破骨细胞样细胞酶学检查,可见有大量多核且抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性的细胞。③破骨细胞样细胞计数:实验获得的破骨细胞样细胞的数量能够满足细胞计数的需要,与成年正常大鼠相比,链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠破骨细胞样细胞数量增加(92.50±10.87,107.00±13.72个/孔)。结论:正常成年大鼠和链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠骨髓体外破骨细胞样细胞的培养方法建立,分离培养的破骨细胞样细胞有多核、抗酒石酸酸性磷酸酶阳性的特性。
参考文献：
[1]. 体外培养大鼠破骨细胞的生物学特性研究[D]. 王兴强. 第四军医大学. 2002
[2]. 犬乳恒牙替换期血管内皮生长因子的表达及意义[D]. 孙华. 第四军医大学. 2007
[3]. 流体剪应力对去卵巢骨质疏松大鼠破骨细胞骨吸收功能的影响[D]. 刘应芬. 四川大学. 2007
[4]. 依那西普抑制大鼠破骨细胞骨吸收功能实验研究[D]. 吴兴临. 宁夏医学院. 2008
[5]. 不同诱导因子对大鼠破骨细胞样细胞体外形成的影响[J]. 王兴强, 杨富生. 临床口腔医学杂志. 2002
[6]. 阿司匹林对大鼠破骨细胞分化成熟及RANK基因表达的影响[D]. 张毅. 第四军医大学. 2013
[7]. 蛇床子素骨靶向药物的合成及体外调节OPG/RANKL系统抗骨质疏松的实验研究[D]. 袁涛. 南京中医药大学. 2012
[8]. 体外培养SD大鼠破骨细胞凋亡及其规律探讨[J]. 陈德才, 魏松全. 现代康复. 2001
[9]. 维生素D_3联合地塞米松诱导大鼠破骨细胞的体外培养[J]. 董强, 夏茜, 马洪, 王永. 贵阳医学院学报. 2012
[10]. 正常和链脲佐菌素诱导糖尿病模型大鼠体外破骨细胞样细胞的培养方法[J]. 尚可, 王燕, 李玉坤. 中国组织工程研究与临床康复. 2007