1.大庆市油田总医院,泌尿外科 黑龙江大庆 163000;
2.哈尔滨医科大学大庆校区,医学检验与技术学院 黑龙江大庆 163319;
3.大庆市中医院 儿科 黑龙江大庆 163000;4.大庆市人民医院 检验科 黑龙江大庆 163319
摘要:目的 过量烟酸通过二磷酸腺苷核糖多聚化等作用对HepG2细胞损伤机制研究。方法 培养HepG2细胞设立对照组、烟酸低剂量、烟酸高剂量、PJ34组、烟酸低剂量加PJ34组、烟酸高剂量加PJ34组。MTT检测细胞存活率、免疫印迹法检测二磷酸腺苷核糖多聚化和流式细胞术检测线粒体膜电位水平。结果 高剂量烟酸组细胞存活率降低(P<0.05)、二磷酸腺苷核糖多聚化增多(P<0.01)、线粒体膜电位下降(P<0.01)。高剂量烟酸组加入PJ34后存活率升高(P<0.05)、二磷酸腺苷核糖多聚化减少(P<0.05)、线粒体膜电位升高(P<0.05)。结论 低剂量的烟酸促进细胞增殖,高剂量的烟酸促进二磷酸腺苷核糖多聚化和抑制细胞增殖,抑制parp活性后后二磷酸腺苷核糖多聚化减少,细胞凋亡率随之减少,过度的二磷酸腺苷核糖多聚化伴随着细胞的凋亡。
关键词:烟酸;肝细胞;二磷酸腺苷核糖多聚化;parp;线粒体膜电位
Study on Mechanism of Poly(ADP-ribosyl)ation in Excessive Niacin Damaging HepG2 Cell
【Abstract】 Objective Study on Mechanism of Excessive Niacin Damaging HepG2 Cell through Poly(ADP-ribosyl)ation
Methods HepG2 Cells were cultivated.The test included the control group,low-dose niacin group,high-dose niacin group,PJ34 group,low-dose niacin and PJ34 group,and high-dose niacin and PJ34 group.Cell survival rate was measured by MTT,Poly(ADP-ribosyl)ation was determined by the Western Blot,and Δψm was measured by flow cytometry.Results Cell of high-dose niacin group survival rate reduced(P<0.05),Poly(ADP-ribosyl)ation increased(P<0.01),and Δψm reduced(P<0.01).For the high-dose niacin and PJ34 group cell survival rate increased(P<0.05),poly(ADP-ribosyl)ation reduced(P<0.05),and Δψm increased(P<0.05).Conclusion Low-dose niacin promoted the proliferation of cells,while high-dose niacin promoted poly(ADP-ribosyl)ation and inhibited the proliferation of cells.After parp activity was inhibited,poly(ADP-ribosyl)ation reduced,apoptotic rate reduced as well,while excessive poly(ADP-ribosyl)ation increased with cell apoptosis.
【Key words】Niacin;HEPG2;Poly(ADP-ribosyl)ation;parp;Δψm
烟酸(Nicotinic acid),又名尼克酸、维生素PP,能促进细胞新陈代谢,缓解动物应激,提高动物生长性能,是治疗血脂异常的常用药[1-2]。其常见副作用包括面色潮红,瘙痒,胃肠紊乱,恶心和呕吐,更严重的包括心房颤动和肝中毒[3]。有多个报道称,烟酸与肝损伤和功能紊乱有关,包括转氨酶升高,凝血障碍,胆汁淤积,甚至爆发性肝功能衰竭有关[4-6]。
烟酸是辅酶NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)的前体,二者在氧化还原过程中起传递氢的作用[7]。它们被还原后生成NADH和NADPH,参与体内多个氧化反应,在动物能量利用及脂肪、蛋白质和碳水化合物合成与分解方面都起着重要作用[8-9]。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)在参与 DNA的修复的同时会激活PARP羧基端的NAD+结合域,将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)分解为烟碱和ADP,然后以ADP为底物在自身或受体蛋白上合成聚腺苷二磷酸核糖基(poly(ADP-ribosyl),Par)。形成Par的过程被称为二磷酸腺苷核糖多聚化(Poly(ADP-ribosyl)ation)[10]。Rawling在大鼠的研究中发现,烟酸的量与Par有相关性,烟酸多则Par多[11]。
本研究通过研究过量烟酸引起的HepG2细胞损伤与细胞内二磷酸腺苷核糖多聚化的关系,为过量烟酸的对肝细胞损伤机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料及试剂 MTT、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测试剂盒购于碧云天生物技术公司,PARP1抗体购自于Santacruz公司,Par抗体购自于BD公司。PJ34购自于tocris公司。流式细胞仪BD Aria Ⅰ购自美国BD公司,ELx808酶标仪购自美国biotek,3111二氧化碳培养箱购自美国Thermo公司。
1.2 细胞及分组:HepG2细胞为本室保存,接种在含10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg /ml链霉素的RPMI-1640培养液中,在37℃,5%的C02环境下培养。
取对数生长期的HepG2细胞,以1×105个/ml接种于96孔板(100μl/孔),培养过夜后,加入不同浓度的烟酸和Parp1抑制剂PJ34,实验分6组:对照组(Nor,N)、烟酸低剂量(Low-dose Niacin,LN)、烟酸高剂量(High-dose Niacin,HN)、PJ34组(NP)、烟酸低剂量+ PJ34组(LNP)、烟酸高剂量+PJ34(HNP)。加药量为:对照组(0mmol/L)、烟酸低剂量(1mmol/L)、烟酸高剂量(6mmol/L)、PJ34组(1mg/L)、烟酸低剂量(1mmol/L)+ PJ34(1mg/L)组、烟酸高剂量(6mmol/L)+PJ34(1mg/L)。
1.3 MTT测定细胞的增殖活性 药物作用12小时,弃培养基,向每孔分别加入20μl的5mg/ml的MTT存储液,并于37℃孵育4小时。之后向每孔加入150μl的DMSO,酶标仪570nm波长处测定吸光度值A。按以下公式计算抑制率(IR):IR=(1-实验组平均吸光度A值/对照组平均吸光度A值)×100%。
1.4 Western blot检测Parp和Par蛋白表达 实验分组同前,于细胞瓶中取各组细胞,裂解后蛋白定量并用于Western blot检测。首先行SDS-PAGE电泳,将蛋白样品转移至硝酸纤维素膜,封闭后分别加入Parp1抗体(1:1000),PAR抗体(1:2000)室温孵育2h,再与二抗室温孵育1h,化学发光法发光曝片。
1.5 FCM检测细胞线粒体膜电位 实验分组同前,于6孔板中,PBs洗涤细胞2次,以2000r/min离心5 min,收集2×106个细胞,加入1ml JC-1染色工作液,充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。37℃孵育结束后,离心去除上清,用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次。加入2ml细胞培养液后,上流式细胞仪检测。
1.6 统计学方法 所有实验结果均是以3次独立实验数据分析所得。采用SPSS13.0统计学软件进行t检验及方差分析。
2 结 果
2.1 细胞增殖活性 图1可见,低剂量烟酸组增殖活性高于对照组(P<0.01),增加烟酸剂量后抑制细胞增殖(P<0.05)。加入Pj34后细胞增殖被抑制(P<0.05),同样抑制了低剂量烟酸的促增殖活性(P<0.05)。而高剂量的烟酸同时加入PJ34会减少高剂量烟酸的抑制增殖活性(P<0.05)。说明,低剂量的烟酸促进细胞增殖,高剂量的烟酸抑制细胞增殖,使用PJ34后par减少 细胞凋亡率随之减少,过度的二磷酸腺苷核糖多聚化伴随着细胞的凋亡。
图1 HepG2细胞存活率
**P<0.01,*P<0.05相对于对照组(N);△△P<0.01,△P<0.05相对于低剂量烟酸组(LN);▲▲ P < 0.01,▲ P < 0.05相对于高剂量烟酸组(HN)。
2.2 Parp和Par蛋白表达 由图2可见,高剂量烟酸组 Par相对于正常组(<0.01)和低剂量烟酸组(<0.05)表达更多;分别加入PJ34后,高剂量烟酸组PAR减少(<0.01)。图3可见,低剂量烟酸组Parp89kDa表达与对照组相比无显著性差异,高剂量烟酸组Parp89kDa表达增加(P<0.05);加入PJ34后,高剂量烟酸组Parp89kDa表达下降(P<0.01)。
2.3 线粒体膜电位变化 由图3可知,低剂量烟酸组相对对照组线粒体膜电位高(P < 0.01),起到保护作用。高剂量烟酸线粒体膜电位相对对照组低(P < 0.01),即损伤线粒体。单纯加入PJ34后,对细胞线粒体有损伤作用,线粒体膜电位相对对照组降低(P < 0.05),高剂量烟酸加PJ34后相对高剂量烟酸组线粒体膜电位相对升高(P<0.05)。
图2(A)Par表达
**P<0.01,*P<0.05相对于对照组(N);△△P<0.01,△P<0.05相对于低剂量烟酸组(LN);▲▲ P < 0.01,▲ P < 0.05相对于高剂量烟酸组(HN)。
图2(B)Parp 89kDa表达
**P<0.01,*P<0.05相对于对照组(Nr);△△P<0.01,△P<0.05相对于低剂量烟酸组(LN);▲▲ P < 0.01,▲ P < 0.05相对于高剂量烟酸组(HN)。
图3 线粒体膜电位结果
3 讨论
适量的烟酸作为NAD和NADP的前体,辅助PARP的对DNA的修复,从而增强细胞的活性,起到促增殖作用,但过量烟酸细胞存活率降低,使用PARP抑制剂PJ34后,相对于单纯使用高剂量烟酸细胞组存活率升高(如图1),证明PARP在细胞活性中起到了重要作用。作为翻译后修饰形式,已经发现有50多种核蛋白和线粒体蛋白发生二磷酸腺苷核糖多聚化,包括拓扑异构酶,组蛋白、多种转录因子和PARP本身,蛋白二磷酸腺苷核糖多聚化后会影响其活性使其激活或被失去活性[12-14]。细胞的二磷酸腺苷核糖多聚化趋势与细胞的活性基本一致(如图2),即细胞细胞存活率越低,细胞的二磷酸腺苷核糖多聚化程度越高,如果抑制Parp活性,则降低。过量烟酸可能促进了Parp过度活化也可以导致无谓的NAD+转化和ATP消耗,最终导致细胞衰竭。
最近的研究显示,线粒体内的二磷酸腺苷核糖多聚化也同样扮演了从氧化应激到细胞死亡过程中的关键角色[15]。PARP-1和其他PARP同样在线粒体内大量存在,有多种线粒体蛋白已经确认发生了二磷酸腺苷核糖多聚化,涉及三羧酸循环、尿素循环、和电子传递链。如果抑制线粒体内的聚腺苷二磷酸核糖基化,可以保护线粒体膜电位(Δψm),阻止释放凋亡诱导因子,减缓DNA的损伤,减少由于氧化应激而引起的细胞损伤或死亡[16]。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件,由图3可知,线粒体膜电位下降的程度与Par形成基本一致,即过量烟酸导致过度二磷酸腺苷核糖多聚化,同时降低线粒体膜电位。
Niacin一直以来治疗血脂异常和心血管疾病,但伴随肝损伤等多种副作用。本实验证实了过量烟酸对HepG2细胞具有损伤作用。其机制为大量的Parp被激活而导致了过量的二磷酸腺苷核糖多聚化使细胞失去活性,线粒体膜电位下降,最终导致细胞凋亡。其与DNA损伤的关系还需要进步一研究。
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论文作者:张婷婷1,陈英利2(通讯作者)崔,艳3,王立秋4,陈
论文发表刊物:《健康世界》2016年第20期
论文发表时间:2016/11/15
标签:烟酸论文; 细胞论文; 线粒体论文; 腺苷论文; 核糖论文; 剂量论文; 磷酸论文; 《健康世界》2016年第20期论文;