滕文君[1]2013年在《叁种激发子诱导的过敏性细胞死亡调控基因的筛选、克隆及功能研究》文中研究表明为了抵抗病原菌的侵染,植物进化出一套可以抑制病原菌扩展的防卫机制,使之能识别特定的病原菌,并作出及时、有效的防卫反应。植物具有两种层面的先天免疫系统：第一种是基于细胞表面的模式识别受体对病原物相关分子模式的识别,即病程相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMP),这种模式诱导的防卫反应称为PTI；第二种是植物细胞内的R蛋白通过对病原菌释放在寄主细胞内的效应分子的识别而触发的免疫防卫反应,称为效应分子触发的免疫反应(Effector-triggered immunity, ETI)。PAMPs是一类比较保守的微生物物质,可以启动植物体级联信号途径,最终诱发植物的抗病性。本研究采用病毒诱导基因沉默技术(Virus-induced gene silencing, VIGS)从本氏烟(Nicotiana benthamiana) cDNA文库中筛选、克隆了参与叁种激发子(Nep1、harpin和INF1)诱导的过敏性细胞死亡(Hypersensitive cell death, HCD)的基因,并对其中一个参与调控harpin诱导的过敏性细胞死亡的基因NbMADsl进行机制研究。本研究利用PVX病毒表达载体构建了本氏烟cDNA文库,通过农杆菌Gv3101接种沉默烟草,从2500颗烟草中筛选到16个参与不同激发子诱导的过敏性细胞死亡的基因和3个沉默后影响烟草生长的基因,通过在网站上比对,其中12个与已知基因有较高的同源性。其中编号为Nb2-37的基因编码烟草中的MADs-box蛋白,我们从本氏烟中克隆了该基因的全长cDNA命名为NbMADsl,该基因的沉默可以减弱harpin诱导的HR; Nb34-22和Nb34-3两个克隆分别编码依赖于ATP的蛋白酶和UDP-D-木糖合酶,两者沉默后均能使烟草矮化；克隆Nb16-5编码ADP-核糖基化因子,该基因沉默后本氏烟死亡。上述结果表明,利用烟草cDNA文库并采用VIGS技术沉默烟草并注射激发子,可筛选并克隆参与不同激发子诱导的过敏性细胞死亡的调控基因,并为揭示激发子诱导的植物防卫反应分子机制提供试验依据。从本氏烟cDNA文库中筛选到一个调控激发子诱导的过敏性细胞死亡的基因NbMADS1,通过Nep1、harpin和INF1的注射发现该基因沉默能减弱harpin诱导的HCD,但不影响Nep1和INF1诱导的HCD。NbMADsl基因沉默削弱了激发子harpin诱发的H202积累,抑制了harpin诱导的气孔关闭和保卫细胞中NO的积累,但是对激发子Nep1和INF1诱导的HR、AOS、NO及气孔关闭均没有影响,这表明不同激发子诱导气孔关闭、NO和H202积累的机制存在差异。大量研究表明,MADs-box基因家族参与了植物花器官的分化和下游基因的调控,但至今没有关于该基因家族是否参与植物防卫反应的报道。因此本研究对于探究harpin诱导的HR分子机制和MADs-box基因家族是否参与植物防卫反应具有重要意义。研究表明NbMADsl基因沉默削弱了激发子harpin诱发的H202积累,抑制了harpin诱导的气孔关闭和保卫细胞中NO的积累,但是对激发子Nep1和INF1诱导的HR、AOS和NO积累、气孔关闭均没有影响,通过外源添加H202可以诱导NbMADs1-沉默植株的气孔关闭和保卫细胞内NO的积累,并且外源添加NO提供剂SNP可以诱发NbMADs1沉默植株保卫细胞内H202的积累和气孔关闭。大量研究表明,在本氏烟中,MADs-box基因通过NbMADs1-H2O2-NO参与了harpin诱导的气孔关闭和防卫反应。
张华建[2]2009年在《叁种激发子诱导的过敏性细胞死亡和气孔关闭的分子机制研究》文中进行了进一步梳理植物病原菌产生的激发子和病程相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)是一类重要的信号分子,模仿非亲和互作中植物与病原菌的信号交流,启动不同的级联信号途径,诱发植物的抗病性,导致过敏反应(hypersensitive response,HR)和气孔关闭。本研究采用病毒诱导基因沉默(virus inducing gene silencing, VIGS)技术研究了本氏烟(Nicotiana benthamiana)NADPH氧化酶(respiratory burst oxidase homologues, RBOH)、液泡加工酶(vacuolar processing enzyme, VPE)、异叁聚体G蛋白(简称G蛋白)及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)在不同来源的激发子(harpin、Nep1和boehmerin)诱发的过敏反应和气孔关闭中的功能,这些激发子分别是细菌(Xanthomonas oryzae)、真菌(Magnaporthe oryzae)和卵菌(Phytophthora boehmeriae)的PAMPs.试验证明(?)BOH、VPE和G蛋白参与3种激发子诱导的气孔关闭,MAPKKKa-MEK2-WIPK介导激发子Nep1诱发的HR,而Gα、Gβ2和VPEla参与harpin诱导的HR,表明不同激发子诱发的信号传导途径具有一定保守性,同时不同的激发子诱导的信号传导也存在特异性。RBOH是最重要的活性氧(active oxygen species, AOS)来源之一。NbrbohA、NbrbohB单基因沉默,以及NrbohA和NbrbohB双基因沉默显着抑制了boehmerin、INF1和harpin等3种激发子诱发的叶片中H2O2积累,但不影响激发子诱导的HR,且基因沉默对激发子诱发的PR基因的转录没有影响；而这些基因沉默却抑制激发子诱导的气孔关闭,且保卫细胞内NO积累显着减少,但不影响保卫细胞内Ca2+浓度和AOS积累。说明RBOH参与激发子诱导的气孔关闭,但不参与激发子诱导的过敏反应和PR基因的转录；植物体内其它酶催化产生的AOS及AOS/NO平衡可能参与激发子诱发的过敏性细胞死亡。VPE是植物液泡的半胱氨酸蛋白酶,具有类似动物caspases-1-like酶活性。本试验发现NbVPE1a和NbVPE1b单基因沉默,及NbVPE1a/1b双基因沉默不影响harpin、boehmerin和Nep1激发子诱发的H2O2积累,NbVPE1a和NbVPE1a/1b沉默却抑制了harpi(?)诱发的HR；而boehmerin和Nep1均可诱发这3种VPE沉默的植株产生正常的HR,表明harpir诱发的HR依赖于VPE,但是VPE不参与boehmerin和Nep1诱发的HR。单基因和双基因沉默均抑制3种激发子诱发的气孔关闭,且抑制了保卫细胞内NO的积累；3种激发子诱导处理后,单基因沉默植株叶片中保卫细胞内活性氧的积累与对照一致,但是双基因沉默植株中保卫细胞内AOS的量显着高于对照和单基因沉默植株中保卫细胞内AOS的量,表明双基因共同作用负调控保卫细胞内AOS的积累。进一步转录分析显示VPE调节了活性氧相关的基因(NbrbohB)和转录因子(WRKY2)的转录。而已证明气孔在植物免疫中具有重要功能,提示VPE参与PAMP触发的抗性(PAMP-triggered immunity,PTI).G蛋白连接着细胞表面的受体和下游的效应因子,在植物多种信号途径中具有重要的作用。本研究克隆了N.benthamiana G蛋白Gα、Gβ1和Gβ2等基因及腺苷酸环化酶基因(adenylyl cyclase,AC),Gα和Gβ2沉默抑制细菌蛋白激发子harpin诱导的过敏反应;Gα、Gβ2、AC削弱了3种激发子诱发的H2O2积累。Gα、Gβ1、Gβ2沉默抑制激发子诱发的气孔关闭,且保卫细胞中NO的积累减少。但是AC因沉默对3种激发子诱发过敏反应和气孔关闭及保卫细胞内NO的积累均没有影响。结果表明G蛋白的Gα、Gβ亚基在不同激发子激发过敏反应和气孔关闭及NO和H2O2积累中作用存在差异。MAPK信号级联途径包含叁个保守的激酶,MAPK kinase kinase(MAPKKK或MEKK)磷酸化MAPK kinase(MAPKK或MEK)又磷酸化MAPK,调节荷尔蒙和其它环境刺激或外源信号。MAPKKKα.MEK2和WIPK沉默烟草抑制了Nep1诱导的HR；MEK1、SIPK和NTF6沉默的本氏烟不影响harpin、Nep1和boehmerin诱导的HR.Nep1处理的基因沉默植株内,转录因子(WRKY2)和防卫基因(PR2b)的表达受抑制。WRKY2沉默后也抑制了Nep1诱导的HR,但不影响boehmerin和harpin诱导的HR。另外,MEK2-NTF6调节激发子诱导的H2O2积累；MEK2-WIPK调节Nep1诱导的NO积累,SIPK沉默削弱了激发子诱导的保卫细胞内NO积累。基因沉默烟草不影响激发子诱导的保卫细胞内Ca2+浓度和AOS积累。结果表明,MAPKKKα、MEK1、MEK2、WIPK、SIPK、NTF6和WRKY2参与调节激发子信号。综上,RBOH.VPE.G蛋白及MAPK调节激发子诱发的信号传递,揭示了不同激发子信号的保守性及复杂性。
王莲莲[3]2012年在《磷脂酶C和磷脂酶D在核黄素诱导烟草悬浮细胞防卫反应中的作用》文中认为核黄素作为植物防卫反应的激发子,可增强植物对由真菌、卵菌、细菌、病毒等病害的抗性。但是,其防卫机制并不清楚。磷脂酶C (phospholipase C, PLC)信号和磷脂酶D (phospholipase D, PLD)信号途径在动植物防卫反应中起着重要作用。PLC的水解产物二酯酰甘油(diacylglycerol, DAG)和叁磷酸肌醇(inositol1,4,5-trisphosphate,以及PLC和PLD的共同产物磷脂酸(phosphatidic acid, PA).目前对于PLC信号途径和PLD信号途径是否参与了烟草悬浮细胞中核黄素诱导的防卫反应还缺乏系统研究。本文运用药理学方法研究烟草悬浮细胞,为了确定核黄素激发的防卫反应是否依赖于PLC和PLD途径。通过采用生物化学、细胞化学、半定量RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)、荧光定量PCR (Real-time, PCR)和高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)等技术测定了一系列防卫反应。所得结果如下：1、烟草悬浮细胞受核黄素诱导后NtPLC1表达量没有明显变化,但其它PLC和PLD基因的表达量均明显增加。NtPLD (NtPLDa2, NtPLDa3, NtPLDβ1和NtPLDδ)基因的表达水平也表现出差异。2、为了阐明PLC和PLD是否参与了核黄素诱导的烟草悬浮细胞的过氧化氢(H2O2)的产生,用PLC的特异性抑制剂U73122和PLD的抑制剂1-butanol提前处理核黄素诱导的细胞,测定细胞过氧化氢被抑制情况。结果表明U73122(10μmol/L)和1-butanol (0.1%, v/v)对核黄素诱导的过氧化氢产生的抑制率分别为79.5%和62.9%。但是U73343(U73122的类似物)和tert-butanol (1-butanol的类似物)没有作用。这些结果表明PLC和PLD途径都参与了核黄素诱导的烟草悬浮细胞的过氧化氢的产生。另外,核黄素还能诱导一氧化氮(nitric oxide, NO)的生成。3、提前加入PLC抑制剂(U73122)和PLD的抑制剂(1-butanol)处理核黄素诱导的烟草悬浮细胞后,3种防卫基因PR (pathogenesis-related)-1a、PR-1b及PAL等的表达受到不同程度的抑制。4、PLC和PLD抑制对核黄素诱导的scopoletin积累有显着地抑制作用。而U73343和tert-butanol对核黄素诱导的防卫反应没有任何作用。外源施用磷脂酸能诱导烟草悬浮细胞中scopoletin积累,磷脂酸能部分地恢复细胞外抑制剂导致的scopletin累积量减少。
胡向阳[4]2003年在《激发子诱导植物防卫反应过程中的信号分子》文中指出一般将能够诱导寄主防卫反应的生物来源和非生物来源的物质统称为激发子。第六次国际植物组织培养大会规定来自于植物的激发子称为内源激发子，来自于微生物的激发子的称为真激发子。随着植物防卫机理的研究向分子水平的深入，越来越多的实验证明激发子和防卫反应可作为研究植物信号识别及胞内信息传递的良好实验体系。在本研究工作中，金瓜炭疽细胞壁激发子与脱乙酰几丁质是来源于真菌细胞壁的真激发子，人参细胞壁降解物与寡聚半乳糖醛酸是来源于植物细胞壁的内源激发子。我们也通过昆虫取食与模拟微重力生物学效应来研究植物的防卫反应。人参是我国传统中草药，具有安神补气，增加免疫的功能，人参皂苷是人参中有效药用成分。我们开始实验的目的是利用激发子提高人参皂苷的含量。经过大量筛选，先后发现金瓜炭疽激发子，脱乙酰几丁质，寡聚半乳糖醛酸都可以明显诱导人参细胞中皂苷含量的提高。为了进一步研究激发子诱导人参皂苷含量提高的机理，我们发现激发子诱导了人参细胞过氧化氢，一氧化氮与茉莉酸的产生，这叁种信号分子单独处理人参细胞都可以诱导人参皂苷的合成与防卫反应，抑制激发子诱导的这叁种信号分子的产生，可以同时抑制激发子诱导的人参皂苷的积累。这些结果表明过氧化氢，一氧化氮与茉莉酸介导了激发子诱导的人参皂苷的合成。激发子诱导人参细胞皂苷含量升高的过程中，这叁种信号分子并不是孤立的，它们之间相互联系，相互影响，共同介导人参皂苷的合成。蛋白激酶与胞内钙离子通过调节信号分子的产生而影响激发子诱导的人参皂苷产生。我们利用激发子在水稻与拟南芥上也进行了相关实验。结果表明一氧化氮介导了真菌激发子诱导的水稻过敏性死亡与抗性相关基因的转录。激发子诱导胞内钙离子的升高以及过氧化氢的产生，对于激发子诱导的抗性相关基因的转录是必须的。除了上述各类激发子可以诱导植物的防卫反应外，其它刺激因子，如机械伤害，昆虫取食，盐碱，高温，冷害，失重等，都可能诱导植物的防卫反应。棉铃虫取食可以诱导蕃茄小苗过氧化氢的产生，激活水杨酸与茉莉酸代谢途径，并且过氧化氢可能作用于水杨酸与茉莉酸途径的上游。失重或微重力也可以看作为一类刺激因子诱导植物发生反应，在我们的实验中，采用回转方式培养人参细胞，即模拟微重力生物学效应条件，可以诱导人参细胞皂苷含量的升高。这种培养方式也可以诱导人参细胞钙调蛋白基因的波动性表达。抑制钙调蛋白基因的转录，也可以抑制回转方式细胞培养所诱导的人参皂苷含量的升高。这些结果表明钙调蛋白可能介导了模拟微重力生物学效应条件所诱导的人参皂苷的合成。
王美芳[5]2011年在《转录因子WRKY1和WRKY2在激发子诱导的过敏反应和气孔关闭中的功能研究》文中研究指明本氏烟WRKY1与WRKY2属于WRKY蛋白质家族第一大类型：拥有2个典型的WRKY结构域(即WRKYGQK保守序列)和Cys2His2(C2H2)锌指型结构。本研究对本氏烟MAPK下游转录因子WRKY1与WRKY2在3种不同来源的激发子(harpin、boehmerin和Nep1)激发的信号途径中的作用机制进行了研究。从本氏烟(Nicotiana benthamiana)中克隆了WRKY转录因子WRKY1与WRKY2编码基因。已有研究证明WRKY1与SIPK相互作用,本文采用酵母双杂交与双分子荧光技术证明WIPK与WRKY2互作,进一步比较了WRKY1与WRKY2在来自Xanthanmonas oryzae的harpin、来自Phytophthora boehmeriae的boehmerin与来自Magnaporthe oryzae的Nep1叁种激发子诱发的过敏性细胞死亡、气孔关闭和防卫反应中的功能。以上述3种激发子分别处理WRKY1、WRKY2基因沉默的烟草植株,结果发现WRKY1和WRKY2沉默抑制Nep1诱导的过敏反应；WRKY1、WRKY2沉默削弱了3种激发子诱发的H2O2积累。WRKY1、WRKY2沉默抑制3种激发子诱导的气孔关闭,且削弱了保卫细胞中活性氧(reactive oxygen species, ROS)和一氧化氮(nitric oxide, NO)的积累。上述结果表明转录因子WRKY1和WRKY2在不同激发子诱导的过敏反应中的作用有差别,但是均参与激发子诱发的气孔关闭及ROS和NO的积累。进一步采用定量PCR检测ROS与NO产生相关基因的转录,发现WRKY1与WRKY2通过调控NbrbohA.NbrbohB的转录来介导的ROS的产生,通过调控NbNOA1、NbNR、NbNR2 (?)勺转录介导的NO产生。接种烟草疫霉进行抗病性分析,发现WRKY1与WRKY2分别沉默后,削弱了3种激发子诱发的对烟草疫霉的抗病性。进一步定量PCR分析了SA、JA和ET叁种信号分子介导的抗病途径中效应基因转录水平变化,结果发现WRKY1与WRKY2分别沉默后,抑制了3种激发子激发的水杨酸(salicylic acid, SA)和乙烯(ethylene, ET)信号分子介导的抗病途径,参与Nep1激发的茉莉酸(jasmonic acid, JA)信号分子介导的抗病途径,但是不参与boehmerin激发的茉莉酸(jasmonic acid, JA)信号分子介导的抗病途径。上述表明WRKY1与WRKY2在3种激发子诱发的过敏性细胞死亡、气孔关闭、NO与ROS的积累及抗病性中的功能有相似之处,也有不同。
刘菲[6]2009年在《核黄素激活烟草防卫反应和诱导对两种土传病害的抗性研究》文中指出核黄素(维生素B2)是一种水溶性B族维生素。核黄素的基本生物功能是以单核苷酸(FMN)或黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式作为辅酶,参与动植物和微生物的以氧化-还原反应为特征的多个生理生化过程。一些研究表明对多种植物体外使用核黄素,可以促进植物生长、提高作物产量和诱导植物对一些病害的抗性,启动抗病信号通路。目前对于核黄素激活的防卫反应和调节机制还缺乏系统研究。本研究以核黄素作为激发子,以烟草悬浮细胞和烟草幼苗为研究体系,通过生物化学、细胞化学、半定量RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)和高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)等方法测定了一系列防卫反应和对烟草两种重要土传病害的诱导作用。所得结果如下:1.用1 mmol·L~(-1)核黄素处理烟草悬浮细胞,测定了氧化迸发和培养介质碱性化的变化。结果表明1 mmol·L~(-1)核黄素处理悬浮细胞后,产生了氧化迸发和培养介质碱性化。氧化迸发在诱导后5 min产生,1 h时达到最大值;而胞外培养基随诱导时间延长其pH值逐渐升高,当诱导80 min时pH值提高了0.57。说明核黄素可以激活烟草悬浮细胞这些常见早期反应。为了说明钙信号和蛋白磷酸化对这些早期反应的影响,用钙离子通道抑制剂LaCl3、钙离子螯合剂EGTA和一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂staurosporine处理细胞,测定了防卫反应被抑制的情况。结果显示这些早期反应可以被LaCl3、EGTA和staurosporine不同程度地抑制,说明在信号转导中钙信号和蛋白磷酸化参与了这一过程。2.为了阐明核黄素是否诱导烟草悬浮细胞防卫基因的表达,我们通过半定量RT-PCR方法测定了4种防卫基因PR( pathogenesis-related)-1a、PR-1b、PAL(phenylalanine ammonia lyase)和LPO(lignin peroxidase)的表达情况。结果显示2个PR基因在诱导后的6 h表达量即达到最大水平,PAL和LPO基因的表达启动较慢,在诱导后的6 h表达水平才有明显变化,至24 h表达量达到最高水平。为了阐明核黄素对烟草细胞苯丙氨酸解氨酶( phenylalanineammonia-lyase, PAL)、过氧化物酶(peroxidase, POD)活性以及抗病相关的酚类物质、木质素等次生代谢产物含量的影响,分别测定一系列与防卫相关的生理和生化指标。结果表明核黄素处理后PAL和POD活性明显升高,处理12 h和24 h后酶活性分别达到峰值;荧光观察细胞壁积累了更多的酚类物质,核黄素处理后的24 h和48 h,烟草悬浮细胞总酚含量分别比对照提高了1.2和1.5倍;胞内和胞外scopoletin(7-羟基-6-甲氧基香豆素)含量明显升高,在处理12 h后都达到峰值,分别是对照的3.6和3.9倍;木质素染色和含量测定表明核黄素处理后烟草悬浮细胞沉积了更多的木质素,处理24 h和48 h后,木质素含量分别为对照的1.5和1.8倍。说明核黄素提高了烟草悬浮细胞PAL、POD活性,积累了更多的与抗病有关的次生代谢产物。3.用核黄素喷雾处理烟草幼苗,测定了不同烟草品种(系)根部接种烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae)和青枯病菌(Ralstonia solanacearu)发病后的病情指数,以及青枯细菌在烟草组织内的群体数量变化。结果表明,7个烟苗品种(系)经核黄素处理后两种病害的病情指数有不同程度降低,对卵菌和细菌两种病原的诱导效果最高分别达到70.9%和52.4%,烟草叶片经处理后烟草根部细菌能明显被抑制,说明核黄素提高了烟草对两种土传病害的抗性。
王炳楠[7]2011年在《大丽轮枝菌蛋白激发子纯化、基因克隆与功能分析》文中认为激发子具有激发植物防御反应、诱导提高植物抗病性的功能。本文从大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)培养液中分离纯化出一种蛋白激发子,该激发子能引起烟草叶片过敏性反应,诱导烟草植物防卫物质的产生和积累;克隆并获得了激发子基因,成功实现了在大肠杆菌(Escherichia coli)中的表达与纯化,用RT-PCR技术探究了该基因表达产物诱导烟草抗病相关基因的表达。本研究为进一步揭示激发子诱导植物系统获得性抗性及机制研究奠定了基础。1.利用硫酸铵沉淀、?KTA explorer 10蛋白纯化仪、非变性电泳、割胶电洗脱等方法,从大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)发酵液中分离纯化出一种蛋白激发子,经SDS-PAGE电泳检测为单一条带,相对分子量为17 kD,等电点为4.34,命名为PevD1(Protein elicitor from Verticillium dahliae)。该蛋白激发子能够诱导烟草的过敏反应。2.蛋白激发子PevD1能激发烟草抗病早期信号事件的发生(叶片H_2O_2的积累,细胞的活性氧爆发,H_2O_2产生,胞外质的碱化,NO的产生和积累);引起防御性物质(胼胝质,酚类和木质素)的产生和积累。诱导烟草叶片的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性提高,PAL活性144 h时达到最大,是对照的3.3倍;在处理120 h时,PPO的含量最高,增幅达到236.8%;POD活性在诱导120 h出现活性高峰,较对照增加204.6.%;同时该激发子诱导烟草过敏性反应过程中,烟草细胞膜通透性增加,细胞发生程序性死亡,细胞发生DNA片段化,并且过敏性反应标记基因hrs203J, hin1被诱导表达。3.质谱ESI-MS/MS检测并进行de novo从头测序,获得该激发子蛋白3个可靠的肽段序列,在NCBI中肽段比对后发现,该蛋白激发子PevD1是黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)一个假设蛋白,其功能未知。设计特异性引物扩增出pevD1全编码基因序列468 bp,编码155个氨基酸并且含有一个18氨基酸残基的信号肽,理论分子量为16.23 kD。将pevD1构建在pET-28a-c (+)载体上,转入大肠杆菌获得了重组表达蛋白。4. PevD1可以诱导烟草获得系统获得性抗性(SAR),提高烟草对烟草花叶病毒(TMV)抗性,激发子诱导烟草植株后6天,枯斑抑制率达到53.85%;枯斑大小抑制率达到32.06%。半定量RT-PCR结果显示,激发子诱导烟草叶片抗病相关基因-PR1-a、PR1-b、PDF1.2、NPR1、MAPK上调表达,并表现一定的时序性,说明PevD1诱导烟草抗病相关基因转录水平上调是其诱导系统获得性抗性的重要机制之一。
刘界文[8]2013年在《本氏烟中ALY916、Gβ互作蛋白的筛选及其功能的研究》文中研究表明植物病原菌产生的激发子和病程相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)是一类重要的信号分子,模仿非亲和互作中植物与病原菌的信号交流,启动不同的级联信号途径,诱发植物的抗病性,导致过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death, HCD)和气孔关闭。NbALY916是一个调控过敏性细胞死亡的基因,研究发现该基因沉默能抑制Nep1诱导的HR,减缓harpin诱导的HR,且参与MAPKKKa和WRKY2的调控；异叁聚体G蛋白连接着细胞表面的受体和下游的效应因子,其中Gp亚基沉默抑制细菌蛋白激发子harpin诱导的过敏反应,Gp亚基包括Gβ1和Gβ2,研究发现它们参与的细胞防卫反应调节途径有所差异。通过对ALY916及Gβ亚基的互作蛋白的筛选,找寻到下游或者上游的调控基因,对完善激发子诱导的防卫反应信号通路途径提供重要依据,可以为有效的病害防控策略提供新的研究思路。本文利用酵母双杂交技术,以ALY916为诱饵蛋白,在烟草cDNA文库中进行靶标筛选,得到一些涉及植物抗逆机制和重要新陈代谢的基因。克隆Nbl-2编码蛋白属于糖原合成酶激酶(GSK)家族蛋白；克隆Nb2-13编码一种过氧化物酶体膜相关蛋白;克隆Nb4-2编码一种醛脱氢酶；克隆Nb7-33编码一类GTP结合蛋白；克隆Nb25-8编码核酮糖二磷酸羧化酶的激活酶前体；克隆Nb12-33编码一个RNA解旋酶；克隆Nb16-3编码一个磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase),还有九个克隆比对到的基因功能并未有人进行研究,有待我们探索。分别以G蛋白Gβ1和Gβ2为诱饵蛋白,在烟草cDNA文库筛选其互作蛋白,得到Gβ1和Gβ2的互作蛋白后,选取转化得到重复率较高的基因为对象,构建PVX病毒表达载体,采用病毒诱导基因沉默(virus inducing gene silencing, VIGS)技术筛选能调控受激发子(Nep1、harpin和INF1)诱导的过敏性细胞死亡的基因,筛选到能与Gβ1和Gβ2都互作的二磷酸核酮糖羧化酶小亚基(ribulose bisphosphate carboxylase small subunit, Rbcs)基因,该基因沉默后,能抑制harpin诱导的HR, Rbcs沉默后能抑制Nep1、harpin诱导的气孔关闭,harpin诱导的NO积累也受到抑制,该发现对Gp参与的过敏性细胞死亡信号调控途径提供了很好的解释依据。
纪睿[9]2005年在《疫霉菌激发子PB90诱导烟草细胞凋亡及其分子机制研究》文中指出激发子PB90是疫霉菌(Phytophthora boehmeriae)分泌的一种分子量为90kD的胞外蛋白激发子,该激发子可以诱发非寄主植物烟草的过敏反应和系统获得抗性。本文在阐明该激发子诱发的烟草细胞过敏性死亡是一种细胞凋亡的基础上进一步就其分子机制进行了研究。 BY-2烟草悬浮细胞经激发子PB90处理后,Trypan blue染色观察到细胞死亡,这种死亡可被蛋白质合成抑制剂Cycloheximide抑制,表明这种细胞死亡是主动死亡过程。提取PB90处理的悬浮细胞的DNA进行琼脂糖凝胶电泳观察到DNAladder现象,表明核小体间的DNA发生了断裂;对经PB90分别处理4、12h的烟草悬浮细胞进行TUNEL染色,观察到较强的阳性信号,进一步表明其细胞核内发生了DNA末端断裂;同时结合DAPI染色观察到经PB90处理后的细胞染色质凝集、细胞核解体形成凋亡小体等细胞凋亡的形态学特征。上述结果表明激发子PB90可以诱导BY-2烟草悬浮细胞发生细胞凋亡,提示该激发子诱导的过敏反应是一个细胞凋亡过程。 烟草悬浮细胞经1nmol/L PB90处理后,烟草胞内发生了NO的进发,激发子PB90处理8h内,出现两个峰值,第一个峰出现在处理后0.5h,第二个峰出现在处理后6h,且第二个峰值大于第一个峰值;PB90处理后,烟草悬浮细胞胞外培养液pH值明显升高;胞内Redox平衡状态(ASC/DHA,GSH/GSSG)发生改变。烟草细胞经PB90处理12h后,检测到细胞色素c(Cytc)从线粒体中释放到胞质,表明激发子诱导的烟草细胞凋亡可能与动物细胞凋亡具有相类似的机制。此外,PB90还诱导了烟草Bax inhibitor(TBI)基因及防卫基因PRla、PRlb、PRlC基因的表达,表明PB90诱导烟草细胞凋亡的过程中伴随着防卫反应的激活。进一步利用抑制剂法进行研究,结果显示Ca~(2+)整合剂EGIA(5mmol/L)、Ca~(2+)通道抑制剂LaCl_3(0.1mmol/L)、NO合酶(NOS)抑制剂L-NAME(0.2mmol/L)、NADPH氧化酶抑制剂DPI(10μmol/L)和蛋白质合成抑制剂Cycloheximide(CHX,0.4mmol/L)可不同程度地抑制PB90诱导的烟草胞内RedoX平衡状态的改变,TBI基因及PR1a、PR1b、PR1C基因的表达,也可不同程度地抑制PB90诱导的烟草细胞凋亡,且随着处理时间的延长,抑制剂对PB90诱导烟草细胞凋亡的抑制率呈增加的趋势(DPI除外),表明信号分子Ca~(2+)、NO、H_2O_2参与了激发子PB90诱导的烟草细胞凋亡,也参与了PB90诱导的烟草防卫反应,提示激发子PB90诱导烟草细胞凋亡的信号通路与防卫反应的信号通路有部分重迭。
赵娟[10]2012年在《梨果实愈伤组织对致腐真菌侵染的生理响应机制研究》文中提出寄主植物受病原菌侵染后，自身也有其相应的适应机制，会产生一系列的防卫反应来抵御病原菌的侵染。这些反应包括寄主植物组织和细胞结构的变化、生理生化反应的变化、病程相关蛋白的诱导产生和细胞的坏死等。研究寄主对病原菌侵染的抗性防卫机制对提高植物的抗病性极为重要，目前开展的相关研究己经取得了许多有意义的结果，但大多数都集中在农作物和林木上，关于病原菌侵染后果实自身防卫机制的相关研究开展的还不多。本研究以易感褐腐病而抗轮纹病的成熟晋蜜梨果实诱导产生的愈伤组织为试验材料，在建立相关离体研究模式系统的基础上，应用细胞生物学、植物生理学、生物化学、分子生物学、植物病理学等多学科交叉，比较研究了梨果实愈伤组织被轮纹病菌和褐腐病菌2种病原真菌侵染后细胞的生理生化特性的变化（包括保护酶活性及同工酶、防御酶系的活性、植物内源激素和可溶性蛋白的变化，细胞的死亡形式等）及防卫相关差异基因表达，为揭示晋蜜梨果实愈伤组织感褐腐病而抗轮纹病的抗感病机制提供基础理论依据，并为进一步在果实上开展相关研究提供新的研究系统和思路。本研究技术路线可行，研究对象遗传背景清楚、选材独特，主要取得如下研究结果：1．以成熟晋蜜梨果实为外植体，诱导其产生愈伤组织。通过继代培养筛选出色黄、均质、半致密、生长旺盛、增殖速度适中的愈伤组织作为试验材料。比较轮纹病菌和褐腐病菌对愈伤组织和果实的侵染情况，结果表明愈伤组织对这2种病原菌的感抗性与果实一致，即晋蜜梨果实愈伤组织也感褐腐病而抗轮纹病，以此系统来开展寄主对病原菌侵染生理防卫机制的研究在理论和技术上是可行的。2．轮纹病菌和褐腐病菌侵染后，梨愈伤组织MDA含量和细胞相对电导率随侵染时间延长明显增加，且均以褐腐病菌侵染的组织上升速度和幅度显着大于轮纹病菌侵染的组织（P﹤0.05），说明褐腐病菌侵染的组织出现了更为严重的膜脂过氧化。轮纹病菌侵染后组织细胞保护酶SOD、POD和CAT活性比褐腐病菌侵染的组织升高幅度大，持续时间长，这与其膜脂过氧化程度轻相一致。轮纹病菌侵染还诱导3种保护酶产生更多新的同工酶并大量表达。这些结果均表明细胞保护酶活性及同工酶变化与组织对2种致腐真菌的感抗性密切相关，是组织对病原菌侵染生理防卫的重要组成部分。3．轮纹病菌和褐腐病菌侵染后，梨果实愈伤组织防御酶PPO、PAL、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性均呈先升高后降低的趋势，但各个酶活性高峰峰值和出现的时间不同。轮纹病菌侵染的愈伤组织内酶活性升高速度快、上升幅度大,高活性维持的时间长，这与组织抗轮纹病表现相一致，说明防御酶系活性被诱导和加强应该是晋蜜梨愈伤组织易感褐腐病而抗轮纹病的防卫机理之一。4．轮纹病菌和褐腐病菌侵染后，梨愈伤组织内IAA、GA3、ZR和ABA的含量出现了不同的变化，总体变化趋势为IAA和CTK含量升高，GA和ABA含量下降，这些变化在2种病原菌之间又有差异。轮纹病菌侵染早期组织IAA含量升高，尤其是在侵染36h时，与GA3含量同时达到一个含量高峰，ZR含量也高于对照，仅ABA含量降低；褐腐病菌侵染早期，IAA和ZR含量高于对照。至2种病原菌侵染后期，IAA和GA3变化都不明显，但ZR和ABA含量显着变化且在2种病原菌之间存在明显差异，轮纹病菌侵染的组织，ZR含量显着高于对照，ABA含量显着低于对照，褐腐病菌侵染的组织则正好相反。上述试验结果表明植物激素含量的变化与愈伤组织对2种病原菌的感抗性有密切关系，且各激素之间相互作用和影响，也许才是调控组织对病原菌侵染防卫过程的关键所在。5．轮纹病菌和褐腐病菌侵染后，梨愈伤组织的可溶性蛋白含量变化趋势相似，均在侵染前期出现了一个上升高峰，后期则含量持续降低，以轮纹病菌侵染的组织可溶性蛋白含量始终高于接种褐腐病菌的组织。蛋白质SDS-PAGE电泳结果显示，在轮纹病菌侵染中后期诱导产生了一条新的蛋白条带，并且其表达量随侵染时间逐渐增加，推测这个特异的蛋白可能是组织防卫基因表达产生的病程相关蛋白，在组织对轮纹病菌的抗病防卫中起重要作用。6．对接菌后不同侵染时间的梨愈伤组织进行普通细胞学观察发现，组织内部侵染进程与表观变化相一致。进行DAPI特异性染色后观察发现，轮纹病菌侵染初期组织细胞核出现染色质的不均一，核质浓缩并有部分细胞核DNA发生断裂的现象。提取愈伤组织的DNA进行琼脂糖凝胶电泳后发现，轮纹病菌侵染24h～48h时出现了较为明显的DNA Ladder现象，褐腐病菌侵染的组织均未发现上述现象。推测组织在防卫轮纹病菌侵染的过程中发生了细胞过敏性反应。7．基于cDNA-SRAP技术，分析了褐腐病菌侵染过程中梨果实愈伤组织差异基因的表达。结果表明：由30个SRAP引物组合共扩增出457条带，其中差异回收条带数为16，最终获得5条差异基因表达条带。核酸序列同源性分析结果表明，有1条差异基因片段未搜索到任何同源蛋白；2条差异基因片段经序列比对，与苹果属的肉桂醇乙酰脱氢酶(CAD)同源性为96%；另2条差异基因片段分别与DNA结合蛋白(DBP)和寡肽转运蛋白(OPT)基因序列同源，其同源性为85%和78%，暂将这3个基因命名为PbCAD、PbDBP和PbOPT。荧光定量PCR结果表明，PbCAD基因在褐腐病菌侵染愈伤组织12和24h时相对表达量最高，为对照的2.94和2.66倍；PbOPT基因在褐腐病菌侵染愈伤组织12～36h时相对表达量明显升高，为对照的2.17～2.46倍，而其他时期表达量均与对照接近；PbDBP基因表达量在整个侵染时期均与对照接近。因此推测PbCAD和PbOPT基因可能是愈伤组织响应褐腐病菌侵染的相关防卫基因。
参考文献：
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[4]. 激发子诱导植物防卫反应过程中的信号分子[D]. 胡向阳. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）. 2003
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[8]. 本氏烟中ALY916、Gβ互作蛋白的筛选及其功能的研究[D]. 刘界文. 南京农业大学. 2013
[9]. 疫霉菌激发子PB90诱导烟草细胞凋亡及其分子机制研究[D]. 纪睿. 南京农业大学. 2005
[10]. 梨果实愈伤组织对致腐真菌侵染的生理响应机制研究[D]. 赵娟. 西北农林科技大学. 2012