安徽省第二人民医院 合肥 230000
【摘 要】为了探究KISS-1基因对裸鼠鼻咽癌转移的影响,本文构建了含KISS-1重组慢病毒质粒并转染该基因低表达的鼻咽癌细胞株（SUNE-1-5-8F），获得KISS-1基因高表达的稳转细胞。我们首先用Western blot检测转染前后KISS-1蛋白的表达水平，然后用荧光定量反转录-聚合酶链反应检测转染前后KISS-1mRNA的表达水平，接着将转染KISS-1的鼻咽癌细胞及未转染的鼻咽癌细胞同时接种至裸鼠腋下，观察肿瘤生长的情况，并检测两组老鼠肿瘤是否出现转移及转移的数目。 通过上述实验步骤，我们将KISS-1基因成功转入鼻咽癌细胞株（SUNE-1-5-8F），并且观察到，转基因组KISS-1 蛋白及mRNA的表达较空质粒转染组和对照组显著增加(P<0.05)，转染组裸鼠较未转染组裸鼠的转移数目少（P<0.05），而腋下种植瘤大小无统计学意义。实验结果表明，通过基因转染的方法能表达有活性的KISS-1，并能抑制种植瘤的转移。
【关键词】鼻咽癌；KISS-1； SUNE-1-5-8F细胞； 转染； 裸鼠
KISS - 1 inhibition of nasopharyngeal carcinoma (NPC) nude mice transplantation tumor metastasis
JinFengLiu Hao Jiang
The second people's hospital of anhui province,Hefei 230000, China;
Abstract:To explore the KISS- 1 gene effect of nasopharyngeal carcinoma metastasis in nude mice,in this paper, we construct recombinant lentivirus plasmid containing KISS- 1 and low transfection the gene expression of nasopharyngeal carcinoma cell line (SUNE - 1-5-8 F), to obtain high KISS- 1 gene expression of cell.First, we usewestern blot test before and after transfection KISS- 1 protein expression level, and thenuse fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction test before and after transfection KISS- 1 mRNA expression level,And transfection of nasopharyngeal carcinoma cells and did not KISS- 1 transfection of nasopharyngeal carcinoma cells inoculated into nude mice armpit, at the same time observe the tumor growth, detects whether two groups of mice tumor in the number of the transfer and transfer.Through the above steps ,KISS- 1 gene was successfully transferred to nasopharyngeal carcinoma cell line (SUNE - 1-5-8 F), and we can see that ,the KISS- 1 protein and mRNA expression of gm group significantly increased than the empty plasmid transfection group and the control group (P < 0.05);Gm group of tumor in the number of the transfer is less than the control group (P < 0.05),while the tumor size is no statistical significance. Experiment results show thatby gene transfection method it can express active KISS- 1, and inhibit plant tumor metastasis.
Key Words: nasopharyngeal carcinoma; KISS; SUNE-1-5-8F; transfection; nude mouse
【中图分类号】R7352.2【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）16-027-03
1 引言
鼻咽癌是全球发病率较低的一种肿瘤，但在东南亚发病率较高，特别在中国的南部及马来西亚发病率较高[1],据统计鼻咽癌在中国的发病率和死亡率分别为3.16/10万和 1.53/10万，广东省发病率高达20/10万[2-3]。鼻咽癌是头颈部常见的肿瘤之一，在流行病学、病理学、临床特征等方面都有独特的特点，尽管它对放疗非常敏感，但其局部复发及远处转移发生率仍很高[4]。由于组织学特征和丰富的淋巴网系统鼻咽癌比其它头颈部鳞癌更容易发生转移[5].鼻咽癌的发生及转移是一个非常复杂的过程，包括多种基因的改变，肿瘤转移抑制基因的失活和肿瘤转移相关基因的活化是导致恶性肿瘤增殖失控、侵袭和转移的基础[6]。KISS-1是 1966年克隆的一个肿瘤转移抑制基因，定位于 1q32 区，在控制细胞生长、增殖，抑制肿瘤细胞的浸润性、运动性、化学趋向性和黏附性中具有重要作用[7]。KISS-1在人类多种肿瘤中发挥抑制转移作用主要是通过其编码的蛋白质与受体结合来完成的[8]。本研究主要是探索KISS-1基因在鼻咽癌的转移中所起到的作用。
2材料与方法
2.1材料
SUNE-1-5-8F细胞购自广州吉妮欧生物科技有限公司，KISS-1抗体购自Anbo公司，山羊抗小鼠lgG、山羊抗兔lgG、??-actin抗体、总RNA提取试剂购自Biosharp公司，逆转录试剂盒、SYBR GRE荧光定量PCR试剂盒、KISS-1基因、内参上下游引物购自上海生工生物工程有限公司。含KISS-1基因的慢病毒，购于上海吉玛公司。
2.2 实验动物
BALB/c-nu裸鼠，限龄4-6周，40只,雌性，购买于南京斯科瑞生物科技有限公司。在特殊病原体(SPF)的环境中饲养裸鼠，每小时需要换气10一12次，采用了人工照明，温度为24士20%，相对湿度为500k±200k，洁净度要高于1000级。裸鼠饲养的每个操作细节均是严格按照SPF的规范。
2.3 实验步骤
（1）慢病毒法转染SUNE-1-5-8F细胞
用含体积分数10%胎牛血清、1640培养基在37°C、体积分数为5%CO2的培养箱中传代培养。取对数生长期的细胞，接种于24孔板中，每孔接种细胞约0.5x105个，加入0.5ml的完全培养液，37°C、5% CO2过夜，第二天倒掉旧的培养液，将慢病毒介导的KISS-1基因的转染入SUNE-1-5-8F细胞，嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞株，同时以未转染细胞作为对照。
（2）western blot
按照蛋白提取试剂盒提取总蛋白，按说明书配15%分离胶和5%浓缩胶，上样后经过电泳和转膜，经封闭液封闭2h后，加入一抗4°C孵育过夜，TBST洗涤3次x10min后加入二抗室温卵育2h,洗涤后的膜放一培养皿里，加入一定量的化学发光剂，经 x 线片曝光、显影、定影。
（3）实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain rection,RT-QPCR）检测KISS-1 mRNA的表达
按照RNA提取试剂盒提取总RNA，按逆转录试剂盒反转录合成cDNA第一链，把cDNA作为模板，通过实时荧光定量PCR试剂盒(SYBR?PremixDimerEraser?)说明书步骤扩增KISS-1 mRNA.引物序列如下： KISS-1 上游引物5’- CCTCTGGACATTCACCCAGC-3’，下游引物3’- GCTGCCAAGAAACCAGTGAG-5’；，预期扩增片段大小分别为145bp和B-actin预期扩增片段大小 144bp。
（4）实验分组及动物成瘤
将40只老鼠随机分成两组，每组20只，对照组：接种SUNE-1-5-8F细胞; 转基因组：接种转染KISS-1基因的细胞。每只老鼠右前肢腋背部皮下接种细胞0.2ml(约1x106cell/只)，接种约10天左右，接种部位皮下长出黄豆大小的硬结，将裸鼠养至60天左右时解剖裸鼠肺、肝等器官并行病理检查，以明确是否有转移。
2.4 统计学处理
采用IBM SPSS Statistics 20统计软件对数据进行单因素方差分析、卡方检验、t检验及相关性分析，以P<0.05为具有统计学意义。
3 结果
3.1SUNE-1-5-8F细胞转染结果
SUNE-1-5-8F细胞转染如下图1所示，其中，图1(a)为转染后3天在显微镜下观察细胞生长情况，图1 (b)为转染后3天同一视野荧光定量显微镜下观察细胞的情况，带绿色荧光的细胞代表转染上的细胞。从图中可以看出转染率在90%以上。
4讨论
鼻咽癌是一放疗敏感的肿瘤，但由于发病早期临床特点不是很典型，且位置比较深，早期不易发现，故待患者有症状检查时疾病已较晚，很多已发生转移，故探讨鼻咽癌转移的发生发展的相关机制及治疗方法等有重要意义。本实验就是探讨新发现的一种肿瘤转移抑制基因KISS-1对鼻咽癌转移的抑制作用。有多项研究已证明 KISS-1在非小细胞肺癌、肾、黑色素瘤、子宫内膜、乳腺癌等多种肿瘤中的转移抑制作用[9-12]。特别是在乳腺癌中的转移抑制作用研究较多，有研究[13]表明KISS-1可以抑制乳腺癌的转移，KISS1的表达在淋巴结转移阳性患者高于淋巴结转移阴性者。Ulasov等［14]研究结果显示KISS1 mRNA及其蛋白在乳腺癌转移至脑组织中的表达显著低于原发灶的表达，这表明KISS1 的缺失可能有助于肿瘤细胞远处转移的形成,且乳腺癌细胞经KISSpepetin处理后，细胞侵袭力明显减弱，骨转移可被抑制。而本实验是通过慢病毒转染KISS-1呈低表达的鼻咽癌细胞，从而得到KISS-1高表达的新的细胞亚株，通过Western blot及荧光定量PCR转染验证转染是否成功，从本实验结果可以看出转染KISS-1后的细胞蛋白及mRNA的表达量是增高的，从而为今后从基因水平干预肿瘤的发生、发展及转移成为可能。另从转染前及转染后鼻咽癌细胞接种裸鼠后种植瘤及转移瘤的比较中可以看出，KISS-1基因对于原发肿瘤的大小无明显影响，但肿瘤转移总数未转染组（7）较转染组（1）多，差异有统计学意义，从此结果可以得出KISS-1可以抑制鼻咽癌细胞的转移，从而揭示出该基因在鼻咽癌转移过程中的价值和作用机理，为未来患者鼻咽癌转移能力的临床预测、可能的肿瘤转移抑制的基因干预治疗乃至个体化临床治疗提供一定实验理论基础。
参考文献
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论文作者:刘金凤,江浩
论文发表刊物:《系统医学》2016年16期
论文发表时间:2017/1/16
标签：转染论文; 鼻咽癌论文; 细胞论文; 基因论文; 肿瘤论文; 抑制论文; 鼻咽论文; 《系统医学》2016年16期论文;