摘要：污水处理厂作为抗生素抗性细菌和抗性基因传播的重要热点，需要对其中抗生素，抗性基因和抗性细菌的命运进行系统研究，特别是在全球范围内共同努力。为了实现这一目标，科学和管理学会需要一种标准化的方法，如宏基因组方法和定量PCR分析。
关键词：污水处理厂；抗生素抗性基因；宏基因组学方法
引言：
污水处理厂（wastewater treatment plants, WWTPs）是污染治理体系中的一个重要环节，它汇集了大量人类生活生产产生的污水、医疗业污水和工业污水等，被认为是自然水环境中抗生素抗性基因（ARGs）污染的重要点源[1]，且能促进ARGs的诱导和迁移[2]。要正确评估ARGs在环境中的来源、分布、传播机制和生态风险，需要对各个环境中的ARGs进行综合分析。随着测序技术和方法不断进步发展，从基于培养的方法到测序技术的宏基因组学方法为展现真实的抗生素抗性机制通路奠定了基石。
对于ARGs分析测试的方法有很多，主要包括：基于微生物培养的方法、定量PCR方法和基于测序的宏基因组学法。现研究手段主要为分子生物学方法[3]。
图1 抗生素抗性基因的分析方法
1. 基于微生物培养的方法
对ARGs污染研究传统的研究方法是基于微生物培养的方法，普遍使用的是选择性培养基富集一种或一些特定细菌，在分离纯化后，可以通过测试该菌株以获得特定的种系信息。作为一种能够在抗生素存在的情况下仍能生长的能力，抗生素抗性可以通过细菌抗性表型来评价其抗性。抗生素抗性测试常用的方法有稀释法和本文所用的平板扩散法，机理是根据具体指标区分抗性表型和其敏感性，并且抗生素抗性模式也可通过抗生素抗性测试得到。现有微生物培养的方法都有其标准测定方法，但它们耗时且劳动强度大。除此之外，即使累积了很多微生物培养的经验和手段，但仍只占环境微生物的1%不到，大多数微生物在离开特定环境的情况下就无法生存，甚至还有一些假阳性以及假阴性。因此，基于可培养微生物的抗性表型的研究越来越少，越来越多的的研究人员通过一些分子生物学技术检测微生物的ARGs从而确定抗生素抗性。
2. 定量PCR方法
由于微生物培养法研究ARGs污染过程中大量微生物无法培养，就会低估微生物群落中抗性细菌的存在及多样性。当前所采用生物分子学手段最常见的便是定量PCR（qPCR）方法，利用荧光染料对PCR产物进行标记通过检测被激发时的荧光强度实现精确定量。PCR技术即聚合酶链式反应，是一种将目的基因扩增数万倍的分子生物学技术。具体过程是 ① 利用高温下DNA模板变性，② 模板DNA与引物退火，③ 以特定引物延伸等步骤，如此循环适当次，从体外合成出与模板DNA互补的子链DNA的过程。越来越多的实验者使用定量PCR方法来研究特定环境中ARGs种类和丰度的时间与空间的变化情况。在对污水处理厂的研究中，Rodriguez-Mozaz 等通过定量PCR研究blaTEM、qnrS 等时发现污水处理厂并不能完全去除污水中的抗生素以及ARGs污染。除此之外，科学研究还经常使用定量PCR方法来反映不同污水处理厂的处理工艺对ARGs分布的影响。虽然定量PCR方法克服了微生物培养法的问题，并且具有快速、灵敏，简便、特异的特点，但它也仍有一些不足，比如它所检测的ARGs都是一些已知的基因，因为PCR所使用的引物序列都是根据目前已知基因设计的。尽管只能检测已知目的基因的丰度，定量PCR技术还是在ARGs检测分析中得到了广泛应用。
3. 宏基因组学方法
在之前的研究中，许多研究人员将定量PCR作为研究不同环境中ARGs概况和丰度的主要工具。然而，定量PCR结果取决于许多因素，包括反应化学，PCR仪器，DNA提取物的基质效应，操作员的技能等。随着测序技术四十年的不断发展，基于测序技术的宏基因组学方法正逐渐成为一种更为广泛应用的方法，通过从样品中提取全部微生物的DNA，然后构建基因文库，最后利用宏基因组学的方法与手段来研究环境中所包含的全部微生物的的基因组，并可以探究其中微生物的群落结构和功能。与定量PCR方法相比，该方法通过避免ARGs引物的固有限制而能得到更真实的定量分析。因此，基于测序技术的宏基因组学方法越来越多地应用于研究ARGs在不同环境介质中的分布，包括污水处理厂。然而，大多数测序仪难以实现引导阻力控制措施所需的实时抗蚀剂组分析。此外，短读长和分段组装使得基于这些大规模测序平台识别ARGs的载体群体具有挑战性。
而使用Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的纳米孔测序技术进行DNA测序是快速生成长读长的另一种方法。通过水平转移获得的ARGs，由于被插入序列侧翼或散布，通常具有固有的重复性质，这将在短读取组件中留下许多间隙，而通过MinION测序产生的长读数可以解决重复区域之间的连接并促进抗性基因宿主的全基因组装配。此外，MinION测序可以提供节省时间和可移植的框架，这可以减少从样品采集到结果交付所需的时间，从而可以在电阻率监测实践中采用实时快速协议。然而MinION测序仍然存在一个悬而未决的问题即高错误率，未来专门设计的生物信息学算法可以解决纠错和纳米孔测序从头组装的基本计算难题。
4. 结语
到目前为止，我国对ARGs污染研究尚在起步阶段，对其研究手段和研究成果仍缺乏系统的认知。对于宏基因组学分析，随着宏基因组学的测序技术的快速发展，更全面和更新的数据库和开放的在线分析非常有用，而用于有效分析大量数据的工具对于数据处理极为重要。近几年，已有科研团体使用基于测序的宏基因组学方法进行ARGs调查研究，在污水处理厂中检测到的ARGs和排泄物中的ARGs来源相当。至此，污水处理厂作为ARGs热点，需要进一步综合研究，以制定抗争的综合战略。
参考文献
[1] Czekalski N, Diez E G, Burgmann H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake [J]. Isme Journal, 2014, 8 (7): 1381-1390.
[2] Rizzo L, Manaia C, Merlin C, et al. Urban wastewater treatment plants as hotspots for antibiotic resistant bacteria and genes spread into the environment: a review [J]. Science of the Total Environment, 2013, 447: 345-360.
[3] Luby E, Ibekwe A M, Zilles J, et al. Molecular Methods for Assessment of Antibiotic Resistance in Agricultural Ecosystems: Prospects and Challenges[J]. Journal of Environmental Quality, 2016, 45(2): 441.
论文作者:邓昌川
论文发表刊物:《基层建设》2019年第4期
论文发表时间:2019/5/23
标签：抗性论文; 方法论文; 宏基论文; 微生物论文; 抗生素论文; 定量论文; 基因论文; 《基层建设》2019年第4期论文;