郭亮[1]2004年在《用于生物转化法生产茶氨酸的重组大肠杆菌的构建》文中提出茶氨酸是茶叶中含有的一种特殊的氨基酸,是茶叶的主要呈味物质。它是茶叶鲜爽味的主要成分,并且可缓冲咖啡碱的苦味和茶多酚的苦涩味,因此可作为改善食品风味的添加剂,广泛应用于各种饮料和食品中。此外,茶氨酸还具有明确的药理作用,可作为功能食品的添加剂、作为降血压和抗肿瘤的辅助药物和抵抗致病微生物的新药。本文主要内容是构建高表达γ-谷氨酰基转肽酶(GGT)的重组大肠杆菌以用于生物转化法生产茶氨酸。大肠杆菌中的γ-谷氨酰基转肽酶是一种以溶解状态存在于周质空间中的非糖基化酶,由大小两个亚基组成。这两个亚基由共同的γ-谷氨酰基转肽酶前体经过翻译后的加工形成。因此,GGT的高活性表达与转录的强弱、信号肽的强弱及翻译后的加工均密切相关。 用PCR方法从E.coli JM109染色体DNA中扩增出含启动子和信号肽序列的GGT基因,插入大肠杆菌表达载体pUC18中,构建成重组质粒pUC18-ggt(s+p+)。重组载体转化大肠杆菌JM109。在转化子中,质粒pUC18-ggt(s+p+)在理论上大量增加GGT完整基因的拷贝数,并在GGT自身启动子的作用下表达含自身信号肽的重组酶。结果质粒转化子周质中表达出的GGT活性与出发菌株相比没有明显提高,说明在自身启动子的作用下,仅提高ggt基因的拷贝数不能增加γ-谷氨酰基转肽酶的表达量。 将含启动子和信号肽序列的GGT基因,插入大肠杆菌表达载体pEtac中,构建成重组质粒pEtac-ggt(s+p+)。重组载体转化大肠杆菌JM109。在转化子中,质粒pEtac-ggt(s+p+)在理论上可略微增加GGT完整基因的拷贝数,并在强启动子tac的作用下表达含自身信号肽的重组酶。结果在强启动子tac的控制下,周质中γ-谷氨酰基转肽酶的表达量提高至出发菌株的2.3倍。将本文构建的工程菌用于生物转化法生成茶氨酸,底物转化率相应地提高至出发菌株的1.7倍。说明在强启动子的作用下,可以增加γ-谷氨酰基转肽酶的表达量。而大肠杆菌转化生成茶氨酸的能力与其γ-谷氨酰基转肽酶的表达量是成正相关的,可以通过提高GGT表达量可以得到应用于生物转化法生产茶氨酸的工程菌。为考察外源强信号肽对GGT表达活性的影响,本文采用同时具有强启动子和强信号肽序列的载体pET20b来融合表达ggt基因,以观察在强启动子和强信号肽协同作用下γ-谷氨酰基转肽酶的表达活性。用PCR方法从E.coli JM109染色体DNA中扩增出不含启动子和信号肽序列的GGT结构基因,插入大肠杆菌分泌型表达载体pET20b中,构建成重组质粒pET20b-ggt(s-p-)。重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)。在转化子中,经诱导后质粒pET20b-ggt(s+p+)在理论上可在强启动子T7启动子的作用下表达含外源信号肽的重组酶。结果重组菌BL21(DE3)(pET20b-ggt(s-p-))周质中产γ-谷氨酰基转肽酶的能力以及转化底物产茶氨酸的能力虽然与出发菌株相比有一定的提高,但是并未出现实验前预期的强启动子和强信号肽的迭加效应,其产酶能力及转化能力反而低于仅具有强启动子的重组菌E.coli JM109(pEtac-ggt(s+p+))。说明含外源信号肽的重组酶可能由于融合表达而不能有效切除外源信号肽,无法形成大量有活性的结构。用SDS-PAGE方法分析本文构建的叁种重组大肠杆菌的全细胞蛋白质,没有发现量特别大的条带,说明这叁种重组子内部并没有产生大量的无活性的GGT前体、包涵体或带有外源信号肽的融合表达产物。这表明叁种重组子GGT酶活力提高较少原因可能还是基因转录水平或蛋白质翻译水平不高。 本文初步摸索重组大肠杆菌E.coli JM109(pEtac-ggt(s+p+))产酶的诱导条件以及生物转化生产茶氨酸的转化条件。确定的最适IPTG诱导浓度为0.07 mg/mL,最佳诱导时间长度约为5小时。转化体系pH值为10时转化效率最高,最适转化温度为37℃。
郭亮, 沈微, 王正祥, 诸葛健[2]2005年在《生物转化法生产茶氨酸的重组大肠杆菌的构建》文中提出为构建生物转化法生产茶氨酸的基因工程菌,作者分析了影响大肠杆菌高效表达γ 谷氨酰基转肽酶的几个主要因素.将大肠杆菌 JM109 的 ggt基因接入两种不同的质粒中后,转化大肠杆菌JM109,并在一定的条件下进行表达.通过对比 E coli JM109 和转化子的γ 谷氨酰基转肽酶表达活性的不同,探讨了ggt基因的拷贝数、启动子的强弱等几个因素对γ 谷氨酰基转肽酶高效表达的影响.实验表明,将含有自身信号肽和启动子的 E coli JM109 的 ggt基因接入高拷贝的质粒pUC18中,仅提高 ggt基因的拷贝数不能增加γ 谷氨酰基转肽酶的表达量.将含有自身信号肽但不含有自身启动子的E coli JM109的ggt基因接入具有 tac启动子的表达载体 pEtac中,发现在强启动子tac的控制下,γ 谷氨酰基转肽酶的表达量提高至出发菌株的 2 3 倍.将构建的工程菌用于生物转化法生成茶氨酸,底物转化率相应地提高至出发菌株的1 7倍.
贾晓鹤[3]2008年在《大肠杆菌ggt的克隆、表达以及利用重组GGT合成L-茶氨酸的研究》文中研究表明茶氨酸(Theanine)是1950年首次从绿茶中分离得到的,是茶叶中的特征氨基酸,也是茶叶的呈味物质之一,具有很好的生理功能和商业价值。其制备研究是目前茶学研究中的一个热点。由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸,成本高昂;化学合成茶氨酸工艺较复杂;组织培养合成茶氨酸产量低。开展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理论意义和实践价值。本论文针对茶氨酸的生物转化法制备技术,开展了工程菌构建工作,将生物技术运用到天然产物制备技术中。通过基因克隆技术构建了重组菌,优化了重组γ-谷氨酰转肽酶的诱导表达条件,优化了重组谷氨酰转肽酶(glutamyltranspeptidase,GGT)粗酶液催化合成茶氨酸的条件,重组菌株粗酶液酶活达到出发菌株粗酶液的35倍,茶氨酸产量达到26.9g/L。主要研究结果如下:1、以Escherichia coli K-12(E.coli K-12)全基因组DNA为模板进行PCR反应,将扩增出的r-谷氨酰转肽酶基因片断和载体pET28a相连接构建重组质粒pET28a-ggt,将重组质粒pET28a-ggt转化至E.coli BL21中,构建重组菌。2、为优化以IPTG作为诱导剂对重组菌进行诱导表达的条件,选择菌液初始诱导OD600、诱导时问和IPTG的浓度为自变量,重组GGT表达量为响应值,采用中心组合设计的方法,研究各自变量及其交互作用对重组GGT表达量的影响。利用响应面分析的方法,模拟得到二次多项式回归方程的预测模型,并确定对重组菌进行诱导表达的最佳条件为:菌液起始诱导OD_(600)为0.52,IPTG浓度为0.42mM,诱导时长为7h。在此条件下,获得的重组菌GGT粗酶液的转移酶活性达到81.8625U/ml左右,约是出发菌株粗酶液的35倍。3、对γ-谷氨酰转肽酶的大、小亚基分别进行PCR扩增、表达载体构建和转化,最终得到大亚基重组菌BL21(pET28a-ggtl)和小亚基重组菌BL21(pET28a-ggts)。诱导表达后进行酶活分析,结果表明:相比出发菌株GGT粗酶液,由重组菌BL21(pET28a-ggtl)和BL21(pET28a-ggts)得到的GGT大小亚基粗酶液转移酶活性均无明显提高。4、优化了重组GGT粗酶液催化L-谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸的反应条件,重组菌经37℃培养至菌液OD_(600)为0.52,加lPTG至0.42mM于20℃诱导表达7h收集菌体制得GGT粗酶液.1ml反应体系(含267mM L-谷氨酰胺、2.0M乙胺、16U粗酶液、pH10.0)于37℃反应4小时,茶氨酸的最大生成量为26.9g/L,L-GIn转化率为57.8%。Suzuki等报道的用构建的重组菌催化L-谷氨酰胺(L-GIn)和乙胺合成茶氨酸的量为20.9g/L,L-GIn转化率为60%。本实验中的L-GIn转化率稍低,但是茶氨酸产量有所提高。本实验构建的重组菌GGT粗酶液具有较好的催化L-谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸的能力,可以尝试用其进行扩大生产茶氨酸的中试实验,可以尝试将其他不同表达载体和表达宿主菌,以寻找更适合GGT大量表达的载体系统。本实验对于生物转化法工业化生产茶氨酸等方面的工作具有较好的指导作用和实际价值。
胥俊峰[4]2008年在《重组E.coli γ-ggt和gs原核表达载体的构建、蛋白诱导表达与应用和Hsp70、Hsp90及TAK1相关真核表达载体的构建及鉴定》文中指出谷胱甘肽(Glutathione)广泛存在于各种生物体中,主要用于维持胞内正常的氧化还原状态,是生物体内的自由基清除剂,具有抗氧化、解毒、保护细胞等重要的生理作用,在临床医药、食品工业、保健品等方面有着非常广泛的用途。近年来,Glutathione的生产方法主要有溶剂萃取法、发酵法、酶转化法及化学合成法。由于直接从组织中分离提取的成本比较高,化学合成法的分离提纯过程又十分困难,酶转化法合成GSH的产率高、后续的分离提取较简单而倍受关注。茶氨酸(L-Theanine)学名为N-乙基-γ-氨基-L-谷氨酰胺(N-ethyl-γ-L-glutamine),是天然茶叶中的一种特殊氨基酸,也是茶叶具有鲜爽味的主要成分,于1985年得到FDA认可,并确认合成茶氨酸为GRAS,在使用时不作限制用量的规定,茶氨酸作为一种新型的食品添加剂,不仅易溶于水,还有抑制苦味物质,改善食品风味的作用,在食品工业中得到了广泛的应用。此外,茶氨酸还具有降血压、增强抗癌药物的疗效、提高免疫力、松弛神经紧张等药理作用。但由于直接从茶叶中提取高纯度茶氨酸的成本比较高昂,茶氨酸的人工合成,特别是微生物发酵合成方法一直是人们研究的热点。γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GGT,EC 2.3.2.2)是生物体内谷胱甘肽代谢途径中的一个关键酶,广泛分布在活体组织中。在大肠杆菌中,此酶在自身信号肽的介导下被转运至周质空间中发挥其生理作用。它不仅可以催化γ-谷氨酰基化合物的水解反应生成γ-谷氨酸,还可以催化γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基团转移至氨基酸、多肽、H_2O等受体上。利用其这一特性,可以催化合成谷胱甘肽和茶氨酸。为了提高微生物中γ-谷氨酰转肽酶的产量及可溶组分,本实验从大肠杆菌k-12中克隆出γ-ggt基因片段,转入原核表达载体pET28a(+)、pET32a(+)和pGEX-4T-1中,构建了重组质粒,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,以廉价、无毒的乳糖作为诱导剂,测定目的蛋白的表达特性,并在此基础上利用该酶催化合成谷胱甘肽和茶氨酸。实验结果表明,构建的重组质粒pGEX-4T-1/γ-ggt转化大肠杆菌BL21(DE3),乳糖诱导后表达产生的γ-谷氨酰转肽酶具有更高的蛋白可溶性和酶活,在反应条件优化基础上,利用重组大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶,茶氨酸最大生成量目前可达到80～90g/L,谷胱甘肽的合成仍在进一步研究中。已有研究报道,诱生型HSP70与细胞凋亡之间存在密切的联系,凋亡信号调节激酶ASK1(Apoptosis signal regulating kinase)是细胞凋亡途径的一个关键激酶,活化的ASK1通过线粒体途径引起细胞凋亡,诱生型HSP70可以直接与之结合,有效抑制胞内ASK1的激活及由此引起的细胞凋亡。诱生型HSP70在mRNA或蛋白水平上是否也具有调控ASK1作用,因此,本实验从人宫颈癌Hela细胞中扩增并克隆诱生型HSP70基因至真核载体pcDNA3.1(-)中,体外鉴定其表达,为后续探究其在细胞凋亡通路中一些具体的调控作用及机制奠定基础。热休克蛋白在细胞应激中发挥十分重要的作用,参与多种疾病的发生和发展,热休克蛋白90(HSP90)是近年来研究较多的一类热休克蛋白。目前,国际上对HSP90蛋白参与的细胞功能的研究主要集中在保护细胞,抑制细胞凋亡方面,而对它们是否参与IL-1相关的炎症信号通路的调节的研究尚少有报道。在哺乳动物中,TAK1在天然免疫和获得性免疫等细胞信号通路中具有重要作用。我们研究结果表明HSP90能与TAK1结合并影响了IL-1引起的TAK1泛素化以及稳定性,进而影响IL-1引起的下游信号的激活。细胞内的免疫共沉淀表明,HSP90能与TAK1结合,因此本实验将在前期工作的基础上找到作用于TAK1的HSP90分子的功能区,揭示HSP90作用于TAK1的分子机理。本实验成功构建了HSP90叁段缺失突变体,分别为HSP90(1-232aa)、(233-732aa)、(402-732aa)以及TAK1两段缺失突变体,分别为TAKl(1-299aa)、(301-579aa),通过体内免疫共沉淀实验显示,HSP90蛋白中的1-401aa是形成HSP90-TAK1复合物所必需的。本实验证实了HSP90与TAK1相互作用的功能区,为研究炎症反应的信号网络和分子机理提供了实验基础。
陆文渊[5]2008年在《茶氨酸生物合成基因工程菌发酵工艺的研究》文中指出对本实验室构建并保存的具有茶氨酸生物合成能力的基因工程菌pET32a-GGT进行了小试发酵培养基和培养条件的优化;重组质粒pET-GGT稳定性的鉴定;细胞固定化生物合成茶氨酸的研究;在30L发酵罐扩大生产工艺的初步研究。主要研究结果如下:1、利用Plackett-Burman实验设计和响应面法进行了小试发酵的优化实验:优化培养基为葡萄糖10.39g/L、酵母提取物6.88g/L、K2HPO4 7.10g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、MgSO4·7H2O 1g/L;优化培养条件为初始pH 7.32、培养时间6.67h、IPTG诱导温度31.51℃、装液量50mL /250 mL、接种量1%、IPTG诱导时间4h。γ-GGT活性为4.64U/mL,茶氨酸的产量为35.18g/L,L-谷氨酰胺的转化率为57.7%。2、该基因工程菌在连续传代100代后,质粒的目的基因片断没有缺失,具有结构稳定性;但在无抗生素选择压力下,连续传代20代后开始出现质粒丢失的细胞,连续传代100代后18%的细胞含有正常质粒,表现出一定的分裂不稳定性。该基因工程菌在优化培养基和优化条件下的整个发酵过程中,始终表现出良好的结构和分裂稳定性。3、确定了海藻酸钠(20g/L)固定化后0.05%戊二醛交联的固定化方法,固定化细胞酶活回收率为79.2%。细胞经固定化后操作稳定性与贮存稳定性较游离菌显着提高。构建了固定化细胞填充床反应器,茶氨酸连续生物合成的平均产量为25.40 g/L,平均体积产率为6.35g/L/h。4、初步确立了该基因工程菌发酵罐扩大培养的相关参数和培养方法:30L发酵罐中加入12L优化培养基,5%的接种量,加消泡剂磷酸丁酯5mL,转速250r/min,37℃发酵培养,并根据溶氧变化补料添加葡萄糖,当溶氧低于40%补料100mL葡萄糖(10g/L),滴加5mol/LNaOH控制发酵pH在7.3左右,6h后用0.05mmol/LIPTG诱导,31.5℃诱导4h。30L发酵罐扩大培养后该基因工程菌的细胞密度(OD600值)可以达到19.2,但γ-GGT活性仅为1.22 U/mL,茶氨酸产量为8.06g/L,L-谷氨酰胺的转化率仅为13.22%。
史成颖[6]2011年在《茶树幼根EST文库构建及茶氨酸代谢相关基因表达分析》文中提出茶氨酸系茶树中的特征性非蛋白质氨基酸，是构成茶叶品质的主要成分之一，影响茶叶的滋味品质，具有重要的保健功能和药理作用。目前与茶氨酸代谢相关的分子机理还知之甚少。因此，研究茶氨酸代谢途径上相关的基因，特别是茶氨酸合成的关键酶基因及调控因子等，将为进一步明晰茶氨酸代谢途径及利用转基因生产茶氨酸提供基础。基于茶氨酸合成于茶树根部以及推定的前体物为盐酸乙胺和谷氨酸钠，作者先在沙培的龙井43茶苗培养介质中添加茶氨酸合成的前体物激活茶氨酸代谢途径，然后选取茶氨酸合成器官——茶苗幼根作为试材，构建cDNA文库并进行ESTs测序分析；另一方面，筛选出茶氨酸含量差异的材料，通过实时荧光定量PCR初步分析茶氨酸代谢相关基因的差异表达。为今后构建基因芯片或数字化的基因表达谱来获取茶氨酸代谢相关的功能基因、调控因子以及深入了解茶氨酸合成及相关氮代谢机理提供研究基础。具体研究结果如下。1.由于采用现有的茶树RNA提取方法提取茶苗幼根中的RNA难以取得良好的效果，作者在提取茶苗幼根RNA的过程中，对几种RNA提取方法进行了比较，结果显示改良的CTAB法提取茶苗幼根等组织中的RNA完整性好、纯度高，可以满足构建cDNA文库的要求。2.以茶苗幼根为材料，采用SMART技术构建cDNA文库并对其质量进行了鉴定。结果显示该文库的重组率为92%，库容量为5.0×10~5，平均插入片段长度超过1kb，可以满足后续的大规模测序等要求。从文库中随机挑选克隆并从5’端单向测定5160个克隆，获得4860个有效的ESTs，序列长度从100至1850bp，平均长度为617bp（部分序列已登录GenBank，登录号为GE652554–FE861258）。用Phrap软件进行拼接，共获得1809个unigenes，其中，648个为contigs，1161个为singletons；与NCBI的非冗余核酸数据库进行BlastX比对以及Blast2go注释，将已知或推定的功能基因进行了分类，并通过Kegg分析其中涉及到次生代谢及氨基酸代谢相关的基因。结果显示，1041个unigenes（57.6%）相似于已知或推定功能的蛋白（E-value＜1E-5），282个（15.5%）相似于未知功能的蛋白，486个（26.9%）没有比对上任何蛋白，推定为新的表达基因。将比对上的编码已知或推定功能蛋白的基因进一步分类，蛋白质合成类别占13.06%，与防卫相关的为8.84%，转运蛋白占8.65%。与次生代谢相关的功能基因占4.52%，其中测到序列数量最多的为编码细胞色素P450的功能基因，共有7个；此外，还有编码黄酮3-O-葡糖基转移酶、类黄酮3-葡糖基转移酶、p-香豆酰辅酶A叁羟化酶、花青素5-O-葡糖基转移酶、松柏醇酰基转移酶及咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶等基因。Kegg pathway分析结果显示，与次生代谢相关的基因主要参与类黄酮、异黄酮、苯丙素、萜类化合物、二萜、花青素、黄酮和黄酮醇的生物合成代谢途径，其中最主要的是涉及黄酮代谢途径。与初级代谢相关的基因为17.39%，其中氨基酸相关的基因中有涉及氮代谢和茶氨酸合成的谷氨酰胺合成酶、S腺苷甲硫氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、γ-谷氨酰转肽酶、亚硝酸还原酶及胞质氨肽谷氨酰胺氨基转移酶等，主要参与蛋氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和谷胱甘肽等氨基酸的代谢。其他涉及胞内运输、信号转导、蛋白质降解与储存、能量、转录、细胞结构与细胞生长及未知功能基因分别占1.16%、6.63%、4.23%、5.57%、9.70%、7.69%和10.56%。3.在茶愈伤组织中添加茶氨酸合成的前体物、代谢中间产物及信号分子等成分，应用高效液相色谱分析愈伤组织生长过程中茶氨酸的变化及其在对照与处理之间的差异。分析了茶苗水培中添加(NH_4)_2SO_4诱导前后的茶氨酸含量变化，同时对遮阴、遮阴与水杨酸或盐酸乙胺组合处理以及不同品种的茶苗嫩叶中茶氨酸含量差异也进行了初步地探讨。试验结果显示，培养基中添加25mM盐酸乙胺后，在茶愈伤组织生长6d和12d时，与对照相比，茶氨酸含量增加最为明显。因此选取对照和盐酸乙胺诱导的茶愈伤组织作为差异表达材料进行后续的候选茶氨酸代谢相关基因的差异表达分析。4.为了选取合适的内参基因来分析前体物诱导及对照的茶愈伤组织中茶氨酸代谢相关基因的差异表达，作者利用GenBank上登录的茶树基因序列以及通过构建文库测序所得的基因（具有完整的阅读框）共7个持家基因设计引物，在分析这些引物的扩增效率和特异性后，测定了它们在茶愈伤组织生长过程中（对照和愈伤培养基中添加外源物的情况下）的表达水平。利用geNorm和NormFinder软件分析了这些持家基因的稳定性，确定在该条件下合适的内参基因为β-actin和GAPDH。5.选取11个推定的与茶氨酸代谢相关的基因，利用Primer premier5设计引物，利用qRT-PCR定量分析它们在茶氨酸含量差异明显的茶愈伤组织中表达量的差异。试验结果显示：GS1-1、gogat、NIR和GDH2在愈伤组织培养初始3d的表达量在处理组被明显地诱导，表明它们可能在含氮化合物的起始同化中发挥着作用；TS2及GDH2的表达量在处理组愈伤组织培养的3～6d增加明显，与同期茶愈伤组织培养基中添加前体物茶氨酸含量增加相一致。而TS1的表达量在对照和处理组并没有明显的差异，这可能说明该基因与TS2在茶氨酸的合成中发挥着不同的作用。
王贤波[7]2006年在《催化合成茶氨酸的菌株筛选与重组菌的构建》文中认为茶氨酸(Theanine)是1950年首次从绿茶中分离得到的,是茶叶中的特征氨基酸,也是茶叶的呈味物质之一,具有很好的生理功能和商业价值。其制备研究是目前茶学研究中的一个热点。由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸,成本高昂;化学合成茶氨酸工艺较复杂;组织培养合成茶氨酸产量低。开展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理论意义和实践价值。本论文针对茶氨酸的微生物发酵法制备技术,开展了菌株筛选和工程菌构建两方面工作,将生物技术运用到天然产物制备技术中。本论文通过比较不同微生物催化L-谷氨酰胺(L-Gln)和盐酸乙胺合成茶氨酸的能力大小,对微生物进行了筛选,明确了9种微生物催化合成茶氨酸的能力;通过基因克隆技术构建了重组菌,优化了重组菌催化合成茶氨酸的条件,重组菌株酶活达到出发菌株的15倍,茶氨酸产量达到29.40g/L。主要研究结果如下: 1、对9种微生物催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺合成茶氨酸的能力进行了测试,发现它们催化合成茶氨酸的能力都很低。茶氨酸的最大生成量仅为7.9mg/L。 2、以培养好的Escherichia coli DH5α(E coli DH5α)菌液为模板进行PCR反应,将扩增出的γ-谷氨酰转肽酶基因片断和载体pET-32a相连接构建重组质粒pET-GGT,将重组质粒pET-GGT转化至E coli BL21中,构建重组菌。重组菌株经0.05mM IPTG在32℃诱导后,SDS-PAGE结果显示出明显的特征蛋白质条带。经酶活性检测,重组菌株每克湿茵体的酶活达到2.0U/ml左右,约是出发菌株E coli DH5α的15倍。 3、本实验优化了重组菌催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺合成茶氨酸的反应条件,重组菌经37℃培养2h左右,然后再加IPTG至0.05mM于32℃诱导表达4h收集菌体。1ml反应体系(含0.35ML—谷氨酰胺、2.0M盐酸乙胺、70mg/ml菌体、pH9.5)于30℃培养4小时,茶氨酸的最大生成量为29.40g/L,即每克湿菌体可催化合成茶氨酸的量为420g/L。L-Gln转化率为48.22%。Suzuki等报道的用构建的重组菌催化谷氨酰胺(Gln)和乙胺合成茶氨酸的量为20.90g/L,Gln转化率为6096。本实验中的L-Gln转化率稍低,但是茶氨酸产量有所提高。 本实验构建的重组菌具有较好的催化L—谷氨酰胺和盐酸乙胺合成茶氨酸的能力,可以尝试用其进行发酵生产茶氨酸小试实验,可以尝试将本实验构建的重组质粒转化到不同表达载体系统中,以寻找更适合γ-谷氨酰转肽酶大量表达的载体系统。本实验对于微生物发酵法工业化生产茶氨酸等方面的工作具有较好的指导作用和实际价值。
王贤波, 王丽鸳, 成浩, 周健[8]2006年在《茶氨酸生物合成工程菌的构建》文中指出以Escherichia coli DH5a菌液为模版进行PCR扩增,产物经纯化后用Kpn I和 Xho I双酶切,回收γ-谷氨酰转肽酶基因目的片断,并与经相同双酶切的表达载体 pET-32a连接,得到重组质粒pET-GGT。将重组质粒转化到Ecoli BL21中,获得重组菌。重组菌株经IPTG诱导后,SDS-PAGE结果显示出明显的特征蛋白质条带,每克湿菌体的酶活达到2．0U／ml,大约是出发菌株Ecoli DH5a的15倍。重组菌催化L- 谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的产量达到29．40g／L,L-Gln的转化率为48．22％, 其催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的能力比出发菌株E.coli DH5a提高了 100多倍。
刘冬英[9]2009年在《茶氨酸产生菌的选育》文中认为茶氨酸是茶叶中特有的氨基酸,它除了在生物体内发挥重要的生理、生化功能外,对人和动物还具有很好的保健功能和药理作用,因此不仅可以作为食品和保健品中的添加剂,而且在医药行业有潜在的应用前景。对茶氨酸工业化生产技术的研究相对薄弱,已经成为限制茶氨酸进一步推广应用的最重要因素。微生物转化法生产茶氨酸被认为是最适合茶氨酸工业化生产的方法,微生物转化方法主要采用了两种酶(γ-谷氨酰转肽酶、谷氨酰胺合成酶)来生产茶氨酸。以γ-谷氨酰转肽酶生产茶氨酸的方法较为成熟。目前在茶氨酸商业生产国日本,采用的γ-谷氨酰转肽酶主要来自经基因工程改造后的大肠杆菌,国内对γ-谷氨酰转肽酶生产茶氨酸的研究集中在采用大肠杆菌基因工程菌进行表达。采用γ-谷氨酰转肽酶工业生产菌株-地衣芽孢杆菌生产茶氨酸,目前尚未见公开报道。本研究的主要目的是筛选得到产γ-谷氨酰转肽酶的可合成茶氨酸的微生物菌株,对其进行诱变育种,选育出一株高产茶氨酸的菌株,并对其产酶条件进行优化,以期为今后利用微生物转化方法工业化生产茶氨酸提供依据。主要研究结果如下:1.对国家标准的茚叁酮比色法和纸层析法两种常用的测定方法进行了研究。国家标准GB/T8314法不能排除样品中其他氨基酸对测定的干扰;纸层析法能把茶氨酸和其它氨基酸分离出来,并且纸层析斑点较规整、清晰,分离效果也比较好。将纸层析的茶氨酸斑点萃取后定量测定,茶氨酸浓度在0.0016～0.0040mg/ml范围内与光密度OD值呈线性关系,线性回归方程为y =59.125x+0.0032,R2=0.9936。经茶氨酸Rf值鉴定,说明这种方法是稳定可靠的。从而确立纸层析法为大规模菌株筛选的茶氨酸检测方法。2.从地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、放射形土壤杆菌、根癌土壤杆菌、野油菜黄单孢菌、产氨短杆菌这七种γ-谷氨酰转肽酶产生菌,通过比较发酵液的酶活力和转化液的茶氨酸产量,筛选地衣芽孢杆菌为合成茶氨酸的菌株。3.采用致死率为99.0%,即照射时间为60s的诱变剂量对地衣芽孢杆菌进行诱变,从稀释分离后培养的平板上挑选200株单菌落进行初筛,然后挑取50株进行复筛,再筛选10株,通过遗传稳定性考察再复筛,得到1株茶氨酸产量为18.57g/L的菌株Bacillus licheniformis C12,较出发菌株提高了66.19%。4.通过对突变株Bacillus licheniformis C12产酶条件优化研究:18 h的种龄,装液量为30ml,摇床转速为180r/min,接种量为10%,初始pH值为7.2,培养温度为30℃,产酶发酵培养基添加0.4%的茶氨酸、0.04%磷酸吡哆醛、0.8%吐温-80有利于产酶发酵。
王贤波, 王丽鸳, 成浩, 周健, 林智[10]2007年在《茶氨酸生物合成工程菌构建》文中进行了进一步梳理通过PCR扩增E.coliDH5α的γ-ggt基因,产物经纯化后用KpnI和XhoI双酶切,回收γ-谷氨酰转肽酶基因目的片断,并与经相同双酶切的表达载体pET-32a连接,得到重组质粒pET-GGT。将重组质粒转化到E.coliBL21中,获得工程菌。工程菌株经0.05mol/LIPTG,32℃诱导表达,湿菌体的酶活达到2.0U/g,大约是出发菌株E.coliDH5α的15倍。工程菌催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的产量达到29.40g/L,L-Gln的转化率为48.22%,其催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的能力比出发菌株E.coliDH5α提高了100多倍。
参考文献：
[1]. 用于生物转化法生产茶氨酸的重组大肠杆菌的构建[D]. 郭亮. 江南大学. 2004
[2]. 生物转化法生产茶氨酸的重组大肠杆菌的构建[J]. 郭亮, 沈微, 王正祥, 诸葛健. 食品与生物技术学报. 2005
[3]. 大肠杆菌ggt的克隆、表达以及利用重组GGT合成L-茶氨酸的研究[D]. 贾晓鹤. 南京师范大学. 2008
[4]. 重组E.coli γ-ggt和gs原核表达载体的构建、蛋白诱导表达与应用和Hsp70、Hsp90及TAK1相关真核表达载体的构建及鉴定[D]. 胥俊峰. 南京师范大学. 2008
[5]. 茶氨酸生物合成基因工程菌发酵工艺的研究[D]. 陆文渊. 中国农业科学院. 2008
[6]. 茶树幼根EST文库构建及茶氨酸代谢相关基因表达分析[D]. 史成颖. 安徽农业大学. 2011
[7]. 催化合成茶氨酸的菌株筛选与重组菌的构建[D]. 王贤波. 中国农业科学院. 2006
[8]. 茶氨酸生物合成工程菌的构建[C]. 王贤波, 王丽鸳, 成浩, 周健. 第四届海峡两岸茶业学术研讨会论文集. 2006
[9]. 茶氨酸产生菌的选育[D]. 刘冬英. 广东药学院. 2009
[10]. 茶氨酸生物合成工程菌构建[J]. 王贤波, 王丽鸳, 成浩, 周健, 林智. 茶叶科学. 2007
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