1.湖南省儿童医院新生儿科 中国湖南长沙 410007；2.湖南省人民医院儿科 中国湖南长沙 410007
【摘 要】目的 比较不同浓度肺炎支原体脂质相关膜蛋白（MP-LAMPs）和脂多糖（LPS）诱导人支气管上皮细胞（HBECs）短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（SPLUNC1）基因表达的差异。探讨SPLUNC1在呼吸道不同病原菌感染中的作用。方法 ①MTT法检测不同浓度的LPS和MP-LAMPs对HBECs细胞增殖的影响，寻找MP-LAMPs与LPS对HBECs细胞增殖影响相似的浓度。②不同浓度的MP-LAMPs和LPS诱导人支气管上皮细胞SPLUNC1基因表达差异是通过实时荧光定量FQ-PCR检测。结果 MP-LAMPs刺激HBECs后SPLUNC1基因表达在24h内先升高后下降，而LPS诱导的在同时间内SPLUNC 1基因表达趋势呈持续升高。结论 24h内MP-LAMPs和LPS诱导HBECs SPLUNC1基因表达变化趋势不同。
【关键词】人支气管上皮细胞；脂多糖；肺炎支原体；脂质相关膜蛋白：SPLUNC1
粘膜分泌蛋白PLUNC家族是呼吸道的先天免疫防御物质，在保护呼吸道正常的生理功能中起重要作用，而短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（SPLUNC1）是其家族中高表达于呼吸道、参与先天免疫应答的蛋白分子。目前对SPLUNC1作用机制和功能的研究还没有一致的定论，但大多认为它参与了呼吸道抵御病原菌的先天免疫应答，且很有可能拥有抑菌、杀菌的作用。
目前临床上发现，在感染肺炎支原体后，不仅会出现气道高反应性导致喘息，还可诱发支气管哮喘的急性发作，但这种现象仅发生在少数细菌感染的患者。有研究报道SPLUNC1可减轻炎症反应，并发现在气道过敏性反应中SPLUNC1蛋白水平显著降低[1]。那么SPLUNC1基因表达在不同感染后是否存在差异，例如MP和革兰氏阴性细菌感染？
肺炎支原体粘附和侵入宿主细胞主要是由肺炎支原体脂质相关膜蛋白（MP-LAMPs）介导的，可引起宿主细胞损伤和死亡，而脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌死亡后释放的毒力产物，本研究利用MP-LAMPs和LPS刺激HBECs，比较SPLUNC1基因表达的差异，探讨SPLUNC1在呼吸道不同病原菌感染中的作用，为以后人工调控其分泌、防治呼吸道感染进行前期研究，并试图揭示MP感染后反复喘息的可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与细胞 南华大学病原微生物研究所提供肺炎支原体标准株；LPS购于sigma公司；湘雅医学院细胞中心购买人支气管上皮细胞。
1.1.2 主要试剂及仪器 Mycoplasma Broth基础培养基购自美国BD公司：OMEGA公司购买E.Z.N.A.Total RNA Kit I；RPMll640购自Gibco公司；TaKaRa公司购买PrimeScriptRT reagent Kit Perfect Real Time。
1.2 方法
1.2.1 肺炎支原体培养及其脂质相关膜蛋白（LAMPs）的提取参照文献进行[2];蛋白浓度通过BCA蛋白法测定。
1.2.2 HBECs的培养
用10% FCS的RPMI-1640培养基在5% CO2、37℃的恒温细胞培养箱中培养HBECs。
1.2.3 通过MTT法检测 MP-LAMPs和LPS对细胞增殖的影响
将生长良好的HBECs置于5% CO2培养箱中培养24小时后弃原培养液，再进行分组处理。对照组、MP-LAMPs组（浓度分别为0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL）、LPS组（浓度分别为0.01μg/mL、0.1μg/mL、1.0μg/mL、10μg/mL），各浓度设4个复孔。在培养终止前每孔加入20μL MTT溶液再继续培养4h，然后弃去上清加入150μL二甲基亚砜，放到摇床上待结晶完全溶解，通过酶标仪570nm测定吸光度值（A值）。相对生长指数（GI）=（处理组A/对照组A）×100%，GI>100%为刺激生长，GI<100%为抑制生长。
1.2.4 实验分组
将HBECs随机分成3组：MP-LAMPs组、LPS组和对照组。MP-LAMPs组：浓度分别为0.1、0.5、1.0及5.0 μg/mL；LPS组：浓度分别为0.01、0.1、1.0及10 μg/mL，在细胞培养箱中培养2、4、8、16、24小时，再提取细胞总RNA用于荧光定量PCR，以上同样实验重复3次。
1.2.5 实时荧光定量FQ-PCR
1.2.5.1 细胞总RNA提取及cDNA的合成 严格按照试剂盒操作说明提取RNA；电泳检测RNA的质量，并计算RNA含量，-20℃保存备用。
1.2.5.2 引物、探针由上海生工生物工程有限公司设计和合成。
1.2.5.3 制备标准品 逆转录所得的cDNA进行半定量PCR，由上海生工生物工程有限公司将PCR产物及扩增引物构建SPLUNC1、GAPDH基因质粒，提取RNA测OD值，并得出基因拷贝数及其相应的浓度，得到质粒的实时荧光定量标准品。
1.2.5.4 FQ-PCR反应 将逆转录所得的cDNA模板稀释10倍，将模板、引物与Mix混合，PCR反应体系和程序分别见表1-1及表1-2，获得SPLUNC1 mRNA及GAPDH mRNA的拷贝数。
1.3 统计分析 本次研究所得数据均采用SPSS 13.0进行统计分析，计量资料数据以（ ±s）表示，采用方差分析，按α=0.05的检验水准，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MTT检测MP-LAMPs和LPS刺激HBECs增殖的影响
结果发现MP-LAMPs在一定浓度范围内（0.1～5μg/mL）抑制细胞生长，并呈剂量依赖性，细胞活力明显降低，见表2-1。
注：*与对照组比较P<0.01，△与前一浓度组比较P<0.01
2.2 FQ-PCR检测SPLUNC 1基因表达
FQ-PCR对不同病原诱导HBECs不同时间点上SPLUNC 1基因的表达情况检测结果结合标准曲线，我们可得到样品中SPLUNC1基因拷贝数（见图2-1）及看家基因GAPDH拷贝数（见图2-2），其中横坐标代表Ct值，纵坐标代表荧光强度。
SPLUNC1相对表达量通过SPLUNC1 /GAPDH基因拷贝数得到，其中MP-LAMPs组的相对表达量见表2-3，诱导细胞 2 小时后SPLUNC 1基因表达开始上调，并在4 小时达高峰，随时间延长反而下降，而LPS组随时间延长持续增高，见表2-4。
图2-1 SPLUNC1基因绝对定量结果扩增曲线
*与对照组比较P<0.01；Δ与前一浓度比较P<0.01；%与前一时间点比较P<0.01
通过比较24小时内不同病原刺激物诱导SPLUNC1基因表达发现，MP-LAMPs组基因表达呈先增高后下降，而LPS组呈持续增高趋势。
3 讨论
SPLUNCl蛋白可调节免疫应答和炎症反应，抑制病原菌的繁殖及呼吸道感染的发展。它的作用机制目前不是很清楚，可通过改变细菌细胞壁的渗透而起到抑菌或杀菌的作用，并可通过抑制生物膜的形成来影响细菌的中性粒细胞的变化。Sayeed S等[3]研究发现，体内外环境中的SPLUNC1均有抑制铜绿假单胞菌生长的功能；Liu Y[4]研究发现，SPLUNC1蛋白能让老鼠抵抗肺炎克雷伯菌的能力增强。Chu，HW和Gally，F[5]发现，外源性重组SPLUNC1能使MP对上皮细胞的粘附性减弱，增加MP的排除，使机体患病的几率大大减小，因此当机体肺炎支原体、革兰氏阴性菌感染时，其气道上皮细胞SPLUNC1基因表达是否有差别？
我们发现MP-LAMPs实验组，SPLUNC1基因表达下降随着浓度的增加及时间延长（4小时后），这可能是由于肺炎支原体引起上皮细胞损伤而不能使SPLUNC1表达，也可能由于SPLUNC1蛋白的表达逐渐增强有关。有研究[1，6]表明，SPLUNC1能有效减轻气道炎性反应，那肺炎支原体感染后SPLUNC1表达没有持续增高和肺炎支原体感染后易出现喘息是否有关？
本实验还发现LPS组诱导 SPLUNC1基因表达的时效关系，24小时内随着时间的延长基因呈持续高表达。支气管上皮细胞SPLUNC1基因表达在肺炎支原体和革兰氏阴性菌感染后有一定的差异，但此差异是否与不同细菌、病毒感染后喘息的发生有关，还有待研究。
综上所述，SPLUNC1蛋白能抵抗外界病原微生物的入侵，还能作为防御蛋白来保护宿主；同时可以增强慢性肺部疾病患者呼吸道对外界病毒、细菌的防御，可为 Th 2类炎症提供新的途径。
参考文献：
[1]Chu，H.W.，et al.，Function and regulation of SPLUNC1 protein in Mycoplasma infection and allergic inflammation.The Journal of Immunology，2007.179（6）： p.3995-4002.
[2]Lo，S.C.，et al.，Mycoplasma penetrans infections and seroconversion in patients with AIDS： identification of major mycoplasmal antigens targeted by host antibody response.FEMS Immunol Med Microbiol，2005.44（3）： p.277-82.
[3]Sayeed，S.，et al.，Multifunctional role of human SPLUNC1 in Pseudomonas aeruginosa infection.Infection and immunity，2013.81（1）： p.285-91.
[4]Liu，Y.，et al.，SPLUNC1/BPIFA1 Contributes to Pulmonary Host Defense against Klebsiella Pneumoniae Respiratory Infection.The American Journal of Pathology，2013.
[5]Nilsson，A.C.，et al.，Clinical severity of Mycoplasma pneumoniae（MP）infection is associated with bacterial load in oropharyngeal secretions but not with MP genotype.BMC infectious diseases，2010.10（1）： p.39.
[6]Thaikoottathil，J.V.，et al.，SPLUNC1 Deficiency Enhances Airway Eosinophilic Inflammation in Mice.American journal of respiratory cell and molecular biology，2012.
作者简介：
第一作者肖丁良（1983.11），性别（汉），籍贯（湖南），职称：医师。
通讯作者：肖丁良，医师，邮寄地址：湖南长沙市梓园路86号 湖南省儿童医院。
论文作者:肖丁良 钟礼立,高喜容
论文发表刊物:《航空军医》2016年第19期
论文发表时间:2016/10/21
标签：基因论文; 支原体论文; 浓度论文; 肺炎论文; 蛋白论文; 细胞论文; 诱导论文; 《航空军医》2016年第19期论文;