张敬霞[1]2002年在《实验性急性血栓性肺栓塞凝血和纤溶系统的分子生物学研究》文中研究表明背景和目的：急性血栓性肺栓塞是临床常见病，严重威胁着患者的健康和生命。提高本病的治愈率，改善患者的预后，是临床工作者面临的重大问题。临床研究发现，虽经积极的抗凝和溶栓治疗，部分肺栓塞患者肺动脉内的栓子仍未能完全溶解，以至发生慢性血栓栓塞性肺动脉高压，严重降低患者的生活质量乃至危及生命。因此，探讨影响肺动脉内血栓溶解的因素显得尤为重要。研究发现，深部静脉血栓和肺栓塞的栓子本身具有溶栓抵制的特性，主要是基于栓子内PAI-1水平的升高。另一方面，栓塞局部环境内凝血和纤溶因素的变化可能对栓子的溶解也起着一定作用。本研究从凝血系统的启动因素—组织因子(TF)及其抑制物(TFPI)，以及纤溶系统中主要的纤溶酶原激活物(t-PA)及其抑制物(PAI-1)着手，研究栓塞肺动脉组织内各因子mRNA的表达水平，探讨栓塞局部环境凝血和纤溶的变化及该变化对血栓转归的影响，同时研究肺栓塞对全身其它组织凝血和纤溶带来的变化，为临床治疗提供参考。 方法：建立家兔急性血栓性肺栓塞模型，按栓塞时间将其分为栓塞3小时组、8小时组和24小时组，并建立各自的实验对照组和正常对照组。取材肺栓塞家兔的栓塞肺动脉和未栓塞肺动脉(栓塞远端和／或无栓塞的肺动脉分支)，以及实验对照组和正常对照组家兔的正常肺动脉组织，同时取材各组家兔的主动脉、心脏、肝脏和脂肪组织。应用RT-PCR方法检测这些组织TF、TFPI、PAI-1 mRNA表达水平，并用免疫组化方法检测肺栓塞和 天津医科大学 博士研究主学位论文 于常家兔肺动脉、主动脉卜PA和PA－1的抗原表达水平。 实验一．实验性家兔急性血栓性肺栓塞模型建立 结果：1．建立模型成功率高达87．180（34／39），死亡5 ／q。2．每只肺栓塞 家兔肺内可发现2－5个栓子。大多位于肺动脉段和亚段水平。栓塞后3小时 和 8小时，肺动脉内栓子基本完整，未见溶解和破碎；栓塞后24小时，栓 子部分溶解，其中部分血栓被推向肺动脉远端。结论：沿颈静脉插管注入自 体血凝块制作的急性肺栓塞模型成功率较高，操作方便，简单易行，是研究 急性肺栓塞的理想动物模型。 实验二急性血栓性肺栓塞超微病理改变 结果：1．栓塞后3 小时，内皮细胞部分脱落，有极少量蛋臼质凝结；平滑 肌细胞呈合成型，胞浆蟹足状，核仁大，胞核和胞浆暗染，向内皮表面游走 移位；内皮下成片蛋白质沉着，淋巴细胞活化。2．栓塞后S小时，部分内皮 细胞脱落：内皮下水肿，液压增高，可见散在游离红细胞；内皮下淋巳细胞 浸润，可见浓集的多量蛋白质沉积；内膜成纤维细胞功能不良：平滑肌细胞 暗染，呈类凋亡（nara下 ＼ 表浅部平滑肌细胞多呈蟹足状，胞浆 呈合成型；深部平滑肌细胞相互平行，呈梭形收缩型。3．栓塞后24小时，较 严重大片内皮细胞脱落，局部血浆蛋白沉着：内膜下平滑肌细胞移位接近内 工剥脱的课面：内膜下水肿，局部液压增高；部分内膜平滑肌细胞萎缩、变 暗，显示核功能不良，呈类凋亡：内膜基质水肿显着，淋巴细胞活化；内膜 基质肥大细胞活化，在其临近有肥大细胞颗粒抛出、释放，并见个别肥大细 胞颗粒排空呈空囊，核固缩凝集。结论：急性肺栓塞后，栓塞局部肺动脉受 损，组织和结构发生改变，其中平滑肌细胞向内膜迁移，表明损伤血管重构 过程。组织损伤后一些炎性因子以及活化淋巴细胞和肥大细胞释放的部分细 胞因子，在病变的发展中也起着一定作用，推测可能对局部凝血和纤溶产生 影响。 实验叁．急性血栓性肺栓塞TF在组织中的表达 结果：1．肺栓塞后 3小时和 8 ／h时，栓塞肺动脉TF mRNA水平显着高于 7 天津医科大学 博士研究生学位论文 未栓塞肺动脉。栓塞肺动脉、未栓塞肺动脉、实验对照组肺动脉TF表达半 定量值，3小时组分别为 1j 土0．ZI，0．40土0．29，0．84土0．26（P（．01）； 8个时组分别为0．84土0．22，0＊5上0．05，0．78土0．38（P（ of）。24小时后 未栓塞肺动脉仆表达开始增强，叁组数值分别为0．72土0．55，1．15to．27， 1刀1土0．02，叁者比较没有显着性差异（P＞0．05）。2．心脏TF表达在不同栓 塞时间组有统计学差异，栓塞3小时、8小时和24小时组分别为0厂7上0．54， 0．刀士0．卜，0二3土019叩＜0．0引：栓塞8小时和N小时组心脏仆表达亦 低于各自对照组，分别为0。31土O．11，0．52上0．02（P＜0．05）和0．23土0．19， 0．54士0．08 P＜0．05）。3．肺栓塞后主
米杰[2]2011年在《急性肺血栓栓塞症继发慢性血栓栓塞性肺动脉高压的临床及基础研究》文中指出目的：1.观察急性肺血栓栓塞症(PTE)患者正规抗凝治疗后3个月慢性血栓栓塞性肺动脉高压(CTEPH)的发生率,并分析其危险因素及预后；2.观察急性PTE患者长期随访的生存情况及CTEPH发生率并分析CTEPH的危险因素；3.观察是否能够成功制备日本大耳白兔两次PTE模型并观察两次PTE后兔体内纤溶系统的变化。内容及方法：1.我们入选了104例急性PTE患者,根据临床表现,进行Wells评分及改良Geneva评分。2.测量患者的血气分析、心肌损伤标志物(CK-MB)、D-二聚体等；根据心电图计算心电图评分；心脏超声测量各房室大小,并根据叁尖瓣返流评估肺动脉收缩压(PASP)；根据CT肺血管造影(CTPA)结果,计算Qanadli栓塞指数及Mastora栓塞指数。3.根据患者病情给予溶栓+抗凝治疗或单纯抗凝治疗,定期复查心脏超声、CTPA。通过电话及门诊进行随访,评估患者的WHO心功能分级；记录死亡、再入院等主要不良事件的时间及原因。4.采用日本大耳白兔为实验对象,通过颈静脉途径,应用介入导管技术制作两次PTE模型,经4F猪尾导管测定肺动脉压力。5.通过ELISA方法测定血浆中D-二聚体、t-PA与PAI-1的浓度；HE染色了解肺动脉的变化；免疫组织化学方法显示肺动脉内t-PA与PAI-1的表达；RT-PCR测定包括栓塞肺动脉在内的肺组织中t-PA与PAI-1 mRNA的表达。结果：1.104例急性PTE患者中7例患者失访,住院期间死亡2例,出院后2个月死亡1例,共有94例患者达到3个月随访终点,19例诊断CTEPH,发生率为20.2%(19/94)。2. CTEPH患者预后较差,死亡率明显高于非CTEPH患者。62个月CTEPH患者生存率为53.5%,非CTEPH患者为97.8%,二者之间差异有统计学意义(P<0.001)。3.男性、初始PASP^再发PTE、右房大小、右室大小、CK-MB、D-二聚体以及Wells评分在CTEPH患者与非CTEPH患者中差异均有统计学意义(P<0.05)。二分类Logistic回归分析显示,再发PTE、男性和初始PASP是叁个月时CTEPH的影响因素,再发PTE可以使CTEPH发生率增加1335倍,男性使CTEPH发生率增加35倍,初始PASP每升高20mmHg, CTEPH发生率增加16倍左右。4.长期随访发现,3个月随访诊断CTEPH的部分患者PASP逐渐回落至正常范围。因此,长期随访CTEPH发生率为14.4%(14/97)。5.初始PASP、再发PTE、右房大小、右室大小以及CK-MB在长期随访的CTEPH患者与非CTEPH患者中差异有统计学意义(P<0.05)。二分类Logistic回归分析显示,初始肺动脉压力和CK-MB是CTEPH发生的危险因素(P<0.05)。初始肺动脉压力每升高20mmHg,可以使CTEPH发生率增加5.0倍；CK-MB增高使CTEPH发生率增加8.3倍左右。6.本研究中以日本大耳白兔为研究对象,成功制备了两次PTE动物模型,并通过4F猪尾导管监测了肺动脉压力的变化,为多次PTE制备兔CTEPH模型提供了可能。7.ELISA结果显示,造模后D-二聚体过性增高,但很快恢复正常。t-PA出现一过性降低后逐渐增高,PAI-1则逐步下降,但造模后1周均恢复正常；免疫组织化学显示,1次PTE组肺动脉内膜PAI-1表达下降,两次PTE组表达进一步下降。1次PTE组、两次PTE组t-PA表达较对照组增强；3组实验兔肺组织中的t-PAmRNA表达未见明显不同。但PAI-1mRNA表达一次PTE组有所降低,两次PTE组进一步降低。结论：1.急性PTE患者经过3个月正规抗凝治疗后CTEPH的发生率为20.2%。CTEPH患者预后较差,生存时间短,死亡率明显高于非CTEPH患者。2.再发PTE、男性和初始PASP升高是3个月时发生CTEPH的危险因素。3.长期随访发现,3个月随访诊断CTEPH的部分患者PASP逐渐回落至正常范围,CTEPH发生率降至14.4%(14/97)。4.初始PASP以及心肌损伤标记物升高是长期随访CTEPH发生的危险因素。5.采用介入导管手段成功制备了两次PTE的动物模型。6.两次PTE后,实验兔表现为机体纤溶系统平衡,栓塞局部纤溶活性亢进。
张进华[3]2009年在《短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的分离纯化、抗栓作用及原核表达的研究》文中提出目的血栓性疾病,如心肌梗塞、脑梗塞和深静脉血栓等,严重危害着人类的健康,溶栓治疗是血栓性疾病安全而有效的治疗手段。目前临床上常用的主要有链激酶、尿激酶和瑞替普酶(rt-PA)等,但存在半衰期短,需反复给药,费用昂贵等缺点。因此,人们又把研究的热点转向其他来源的纤溶酶原激活剂上来,如纳豆激酶(NK)、吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(bat-PA)和蛇毒纤溶酶原激活剂等。蛇毒是多种生物活性蛋白和多肽的混合物,其中许多的组分可作用于人的凝血和纤溶系统,特别是在蝮科和蝰科蛇毒中尤为突出。本研究旨在通过传统的分离纯化方法和现代的基因工程方法从江浙产短尾蝮蛇毒中获得短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂(Plasminogen activator of Gloydius brevicaudus venom, GBV-PA),并对其理化性质及抗栓作用进行初步研究,为寻找新的抗血栓药物提供实验依据。方法本研究应用亲和层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)两步法分离纯化蛇毒纤溶酶原激活剂,纤维蛋白平板法鉴定活性。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定蛋白质的纯度及分子量大小,聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳测定其等电点,发色底物法鉴定GBV-PA激活人纤溶酶原为纤溶酶的活性,GBV-PA与抑制剂的相互作用和纤维蛋白结合实验测定GBV-PA的部分理化性质。应用FeC13诱导的大鼠颈总动脉血栓、兔脑粉浸液诱发的大鼠下腔静脉血栓和犬实验性急性脑梗塞等不同的血栓模型对蛇毒纤溶酶原激活剂的抗栓作用进行研究。采用经典的Born法,测定GBV-PA对ADP和凝血酶诱导的体外血小板聚集的影响。采用ADP诱导的急性肺栓塞和大鼠颈动静脉回路血栓模型观察GBV-PA对体内血小板聚集的影响。利用基因工程技术,从江浙短尾蝮蛇毒中获得GBV-PA的cDNA序列,将该基因定向克隆到原核表达载体pET42a(+)中,在大肠杆菌中表达rGBV-PA蛋白。结果从江浙短尾蝮蛇毒中分离纯化到分子量为32kDa左右,等电点为5.2的纤溶酶原激活剂,命名为GBV-PA。发色底物法(S- 2390)法证明GBV-PA能特异的激活人纤溶酶原为纤溶酶而降解纤维蛋白,其比活性为2.87 t-PA IU·mg-1。GBV-PA为一种丝氨酸蛋白酶,与纤维蛋白无特异性的亲和力。应用叁种不同的血栓模型研究蛇毒纤溶酶原激活剂的抗栓作用,结果表明:分离纯化到的蛇毒纤溶酶原激活剂对于动静脉血栓均有良好的溶解作用,在一定范围内呈明显的量效和时效关系,且对血栓的形成有抑制作用。采用经典的Born法,测定GBV-PA对ADP和凝血酶诱导的体外血小板聚集的影响,结果显示:GBV-PA对ADP和凝血酶诱导的血小板聚集均有抑制作用,呈明显的量效关系。ADP诱导的急性肺栓塞和大鼠颈动静脉回路血栓模型观察GBV-PA对体内血小板聚集的影响,实验结果表明GBV-PA可抑制体内血小板聚集。成功地从江浙短尾蝮蛇毒中获得GBV-PA的核苷酸序列,GBV-PA的cDNA大小为777bp,推导出的氨基酸数目为259个。GBV-PA核苷酸序列与TSV-PA和Haly-PA的同源性分别为91%,和96%。将该基因定向克隆到原核表达载体pET42a(+)中,并在大肠杆菌中得到表达,SDS-PAGE凝胶电泳显示rGBV-PA主要以包涵体形式存在,分子量约61.7kDa。rGBV-PA经His亲和层析柱纯化后,获得的rGBV-PA融合蛋白具有蝮蛇毒的抗原性。结论⑴成功地从江浙短尾蝮蛇毒中分离纯化到分子量为32kDa左右,等电点为5.2的纤溶酶原激活剂,命名为GBV-PA。⑵GBV-PA为一种丝氨酸蛋白酶,对纤维蛋白无亲和性。⑶GBV-PA对实验性动、静脉血栓均有治疗作用,GBV-PA可明显抑制血小板聚集。⑷在大肠杆菌中成功表达得到rGBV-PA蛋白,为rGBV-PA进一步的药效及药物动力学研究提供了充足的原料。
杨增敏[4]2009年在《活血通络汤对下肢深静脉血栓形成相关因素的干预性研究》文中研究表明本文运用中医传统理论,根据导师许建安教授长期治疗下肢深静脉血栓形成丰富的临床经验,应用活血通络汤进行实验研究,探索其在血栓形成方面的预防作用及其作用机制。近年来,下肢深静脉血栓形成病理机制的理论进展认为:炎症与血栓形成密切相关以及内皮功能损害在血栓形成中占有重要地位。血流缓慢、血液成分异常和血管损伤是静脉血栓形成叁大发病原因,我们将其作为相关因素进行研究,通过动物实验,设立空白对照组,以复方丹参片、阿司匹林作为对照,分成活血通络汤高、中、低剂量组,建立血瘀证大鼠模型、创伤性深静脉损伤模型、HUVECs缺氧-复氧(I/R)模型,系统地探讨了中药对血管内皮显微结构和内皮细胞功能的影响,研究了深静脉血栓形成与内皮细胞表达细胞粘附分子—CD54表达、中性粒细胞粘附关系,进行了中药对静脉血栓形成后血液流变学、凝血功能和血管壁炎性细胞干预的研究,论证了炎症与血栓形成的关系。实验结果表明:各剂量组对创伤性大鼠深静脉血管损伤均具有保护作用,含药血清中、高剂量组干预内皮细胞CD54分子表达数与缺氧组有明显区别,统计学处理有显着差异(P＜0.05),提示活血通络汤可以改善内皮细胞在缺氧条件下的细胞粘附性。活血通络汤高剂量组可见中性粒细胞与血管内皮细胞的粘附率显着降低,与缺氧组有明显区别,统计学处理有显着差异(P＜0.05),表明活血通络汤可能是通过影响两种细胞之间的粘附来发挥其抗血栓作用。活血通络汤具有显着抑制血栓形成、抑制血小板粘附、聚集,降低血液粘度的作用,降低足跖肿胀容积及肿胀率,抑制CD54表达,抑制炎性细胞的浸润,保护血管内皮细胞功能等作用。可以得出结论:活血通络汤防治深静脉血栓形成不是单一作用,而是具有多种综合调节作用,对血栓形成的每个因素都能发挥作用,从分子生物学角度分析,活血通络汤对深静脉血栓形成相关因素的干预机制主要表现在对血管内皮细胞的保护方面,对血栓形成复杂的发病机理特点具有良好的针对性和科学性,本研究对防治DVT会带来良好的社会效益和经济效益。
周为民[5]2010年在《深静脉血栓形成病因学及基因治疗的初步研究》文中研究说明研究背景深静脉血栓形成(deep vein thrombosis, DVT)是一种严重的,具有潜在危险的疾病,如未得到适当治疗易发展为血栓形成后综合征、股青肿、股白肿甚至发生肺栓塞而死亡。流行病学研究提示,深静脉血栓形成年发病率为1.60‰～1.82‰。回顾性研究资料报道,静脉血栓栓塞症患者有高达5%-23%的死亡率,即使正规服用抗凝剂的有症状患者,死亡率也有1%-2%。而深静脉血栓形成患者有叁分之一发生血栓形成后综合征,肺栓塞患者4%-5%发生肺动脉高压。此外,深静脉血栓形成的治疗效果又不确切。因此,研究深静脉血栓形成的病因、发病机制和治疗至关重要。本研究分两大部分,第一部分探讨静脉血栓形成的病因学,研究亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR) C677T和蛋氨酸合成酶还原酶(methionine synthase reductase, MTRR)A66G基因多态性与深静脉血栓形成的关系,试图发现国人静脉血栓形成的易感因子。第二部分为静脉血栓形成基因治疗的体外实验研究,以腺病毒介导的尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator,uPA)基因转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endotheliocyte, HUVEC),研究转uPA基因感染人脐静脉内皮细胞后的蛋白表达以及纤溶活性改变情况,试图探讨uPA基因治疗静脉血栓形成的可行性和可能机制。第一部分MTHFR C677T和MTRR A66G基因多态性与深静脉血栓形成的关系目的:研究亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)基因和蛋氨酸合成酶还原酶(methionine synthase reductase, MTRR)基因的多态性与深静脉血栓形成的关系,探讨深静脉血栓形成的病因学。方法:采用病例对照研究,以101例下肢深静脉血栓形成患者和同期行健康体检的正常人群120例(对照组)的血白细胞为样本,应用等位基因序列特异性引物聚合酶链反应(polymerase chain reaction-sequence specific primer ,PCR-SSP)多态性技术检测两组的MTHFR基因第677位点的多态性和MTRR基因第66位点的多态性,分别比较每两组的基因型和等位基因的分布频率。同时统计下肢深静脉血栓形成的发病部位。结果:MTHFR的677位点CC、CT和TT基因型频率在疾病组中分别为41.58%、25.74%、32.67%,在对照组中分别为58.33%、23.33%、18.33%,MTHFR的677位TT基因型频率与对照组的比较差异有显着性(χ2=7.7,P<0.05)。MTRR的66位点AA、AG和GG基因型频率在疾病组中分别为26.76%、43.66%、29.58%,在对照组中分别为43.57%、44.28%、12.14%,两组的分布频率差异无显着性(P>0.05)。左下肢深静脉血栓形成的发病率为83.2%。结论:MTHFR基因第677位点的TT基因型多态性可能与DVT的发病有关。MTRR基因A66G多态性可能不是DVT的独立遗传危险因素。下肢DVT好发于左下肢。第二部分腺病毒介导uPA基因转染人脐静脉内皮细胞的体外实验研究目的:构建含有人uPA基因的重组腺病毒载体,利用重组腺病毒载体介导人uPA基因转染人脐静脉内皮细胞,从基因、蛋白水平检测目的基因uPA的蛋白表达和纤溶活性,探索静脉血栓形成基因治疗的可行性和可能机制。方法:用PCR将合成的oligo拼接成完整的uPA基因,将合成好的目的基因序列装入pMD-18T载体,经XhoI和SalI酶切将目的基因uPA克隆到含增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的质粒载体pIRES2-EGFP中,并转化至感受态细胞DH5α。以pIRES2-EGFP质粒为模板,扩增带attB1和attB2的uPA-IRES2-EGFP片段。采用pAD/CMV/V5-DEST Gateway Vector载体系统作为载体,该系统是缺失了E1和E3早期区的AD5型腺病毒,可容纳6～8.5 kb的外源基因,外源基因插入到E1区。以Gateway两步重组技术重组腺病毒质粒:BP重组系统将目的片段重组到载体pDONR221上,LR重组系统将目的序列重组到腺病毒质粒载体pAD/CMV/V5-DEST上,测序验证重组质粒的正确性,构建含有人uPA基因的重组腺病毒载体。Pac I将重组腺病毒载体质粒线性化后用脂质体lipofectamine 2000转染293A细胞进行包装并对病毒液进行扩增、纯化和滴度测定。HUVEC细胞培养后实验分3组:ad.uPA转染组,ad.neg空载体对照组和空白对照组(n=3)。分别以重组腺病毒载体介导的人uPA基因、空载体对照和空白对照转染HUVEC细胞,观察转uPA基因对HUVEC细胞的影响,测定最佳感染复数((multiplicity of infection, MOI);采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction , FQ-PCR)、免疫印迹(Western Blot)和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测转uPA基因在HUVEC的蛋白表达;比色法检测转uPA基因在HUVEC细胞上清中的的纤溶活性变化。结果:成功克隆了人uPA基因,并将携带EGFP的目的基因uPA克隆至质粒载体pIRES2-EGFP,成功构建了uPA cDNA的质粒载体puPA-IRES2-EGFP,测序结果与Genebank公布的人uPA基因cDNA序列完全一致,同源性为100%,该基因编码的蛋白为人uPA。成功构建了人uPA基因重组腺病毒载体pAD-ZWM-PLAU,重组腺病毒载体pAD-ZWM-PLAU经PacI酶切后用Lipofectamine 2000能有效转染293A细胞,包装成功,获得了人uPA基因重组腺病毒ad.uPA。经大量扩增、纯化后病毒滴度为5.74×1010ifu/ml。本研究制备的人uPA基因重组腺病毒ad.uPA感染HUVEC细胞后最佳MOI=800。以MOI=800感染HUVEC细胞后,FQ-PCR检测ad.uPA组、ad.neg组和control组叁组目的基因2 -⊿⊿ CT分别为15.2422、4.5631和1,显示阳性感染病毒细胞中目的基因表达量有明显提高(P<0.01)。Western Blot检测结果示ad.uPA侵染病毒的细胞目的蛋白表达量明显提高,而侵染阴性腺病毒对照组和空白对照组的HUVEC细胞中几乎没有检测到目的蛋白的表达。目的蛋白大小为55 kDa。ELISA检测转基因HUVEC培养上清uPA含量结果ad.uPA转基因组,ad.neg空载体组和空白对照组分别为379.4043±2.46 ng/L,240.0099±1.16 ng/L和256.1024±3.04 ng/L,ad.uPA转基因组uPA蛋白含量明显高于空载体组和空白对照组(P<0.01)。比色法检测转基因HUVEC细胞uPA活性结果ad.uPA转基因组,空载体组和空白对照组分别为68.3062±0.64 IU/106cells/24h,5.1845±0.19 IU/106cells/24h和5.0299±0.12 IU/106cells/24h,ad.uPA转基因组uPA活性明显高于各对照组(P<0.01)。结论:成功构建了EGFP和uPA双表达重组腺病毒载体pAD-ZWM-PLAU,并于HUVEC成功表达,为静脉血栓形成的基因治疗奠定了基础。转uPA基因感染HUVEC细胞后从基因、蛋白水平均可检测到明显的目的基因表达和纤溶活性增高。外源性基因表达的蛋白在在体情况下有否生物学作用,还有待于动物实验来证实。本研究为静脉血栓形成的基因治疗方案的制定进行了有益的探索。
詹华奎[6]2005年在《通心络治疗慢性肾小球肾炎临床研究》文中研究说明本文观察了通心络胶囊治疗慢性肾小球肾炎的临床疗效,并与血管紧张素转换酶抑制剂进行了比较研究。结果表明,通心络胶囊治疗后,慢性肾炎患者中医主要症状如水肿、神疲乏力、腰脊酸痛、面色晦暗减轻或消失;尿蛋白、尿红细胞减少;全血粘度、血浆粘度、红细胞变形指数、纤维蛋白原、血小板数量降低;活化部分凝血活酶时间、血浆凝血酶原时间延长;血、尿纤维蛋白(原)降解产物阳性转阴;总胆固醇、甘油叁酯、低密度脂蛋白、载脂蛋白B、脂蛋白(a)降低;血肌酐、尿素氮降低;免疫球蛋白IgG上升。提示通心络胶囊有提高机体免疫功能,改善症状,改善血液高凝状态,降低血脂,减少蛋白尿,保护肾功能的作用;临床综合有效率83.3%,与血管紧张素转换酶抑制剂比较,差异无显着性意义(P>0.05)。文章最后对通心络胶囊治疗慢性肾炎的可能疗效机制进行了探讨。
王少华[7]2011年在《日本刺沙蚕蛋白酶的纯化、鉴定及日本刺沙蚕纤溶酶的部分药效学研究》文中研究表明血栓性疾病(thrombotic disease, TD)包括血栓形成(thrombosis)和血栓栓塞(thromboembolism)。血栓性疾病已经成为严重危害人类生命健康的“头号杀手”,不仅发病率高居各种疾病之首,而且致残率、致死率和复发率也很高。目前,临床上常用的抗栓治疗方法主要是溶栓治疗。过去十年中,国内外临床常用的溶栓剂有尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤溶酶原激活剂、蛇毒降纤酶类(东菱迪芙)及蚓激酶等。但是所有这些溶栓剂都有不可避免的副作用,包括需要加大剂量治疗、有限的纤维蛋白特异性、再阻塞和出血倾向等。所以,从各种天然生物资源中寻找和研发溶解纤维蛋白特异性高、出血副作用小及相对较便宜的溶栓剂一直是研究的热点。日本刺沙蚕是一种海洋无脊椎动物,广泛分布于我国的渤海、黄海沿岸及长江口等地区,此外还有日本太平洋沿岸。目前日本刺沙蚕主要被用作鱼虾的优质饵料,同时也是海洋垂钓的优质钓饵。本实验室前期已经从日本刺沙蚕体内发现了一种新的名为日本刺沙蚕纤溶酶(NJF)的丝氨酸蛋白酶,该实验过程中还发现有另外一种特殊纤溶活性及性质的蛋白酶—日本刺沙蚕蛋白酶(NJP),有可能开发成新的溶栓剂,更好的实现其经济和社会价值。本论文主要包括两个部分的研究,第一部分包括前叁章,是关于日本刺沙蚕蛋白酶(NJP)的分离纯化工艺的建立,分子特征及酶学性质的检测；第二部分包括第四章,是关于NJF的体内部分药效学实验。现将主要研究结果分述如下：1.通过酶的粗提、硫酸铵分级盐析、苯柱疏水层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析等方法,最终得到单一成分的、纯度较高的酶制剂,命名为日本刺沙蚕蛋白酶(N.japonica protease, NJP),最终纯化了1556倍,回收率为13%；以S-2238为特异性底物时,生色底物法测得NJP的特异性酶活力为10113.9 U/mg。2.通过MALDI-TOF MS和SDS-PAGE电泳检测NJP是一个相对分子量为28.6～33.5kDa的单链蛋白质；2-DE检测其等电点为9.2。3.通过串联质谱MALDI-TOF/TOF MS测序并进行De Novo分析,获得3段共28个氨基酸序列,分别是：V-T-V-V-Q-Y-R; S-T-N-A-S-S-G-Y-L-N-L-R和V-Y-L-L-D-T-G-L-R.将此序列在NCBI的non-redundant protein sequences (nr)和Swiss-Prot数据库利用protein-protein BLAST (blastp)软件进行比对,发现NJP是一种新发现的蛋白酶；将此序列登陆UniProt knowledgebase数据库中,获得登录号P86834, EC 3.4.21.-。4. Azocasein水解法测定NJP的最适温度为40℃,且在30℃-60℃比较稳定；其最适pH为9.0,且在pH7.0-pH11.0时能保持最大活性的80%以上,表明NJP是-种碱性蛋白酶。5. Azocasein水解法测定的结果表明Hg2+几乎能完全抑制NJP的酶活性,Co2+和Mg2+也能部分抑制其酶活性,其它金属离子对酶活性的抑制和活化作用都不明显。6. Azocasein水解法测定的结果表明NJP的酶活性可以完全被典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF抑制,其他蛋白酶抑制剂的抑制作用均不明显,表明NJP属于典型的丝氨酸蛋白酶类。7.纤维蛋白平板法表明,NJP可以直接降解纤维蛋白,基本上无激酶作用,不是纤溶酶原激活剂；NJP具有很强的纤溶活性,以UK标准品为对照,NJP的纤溶活力为12000U/mg；8.采用SDS-PAGE电泳法分析NJP水解纤维蛋白原的活性,结果表明NJP水解纤维蛋白原的先后顺序是：Aα链>Bp链>γ链。9.生色底物法表明,NJP对凝血酶特异性底物S-2238特异性较高,其特异性水解活性为10.11±2.7 mmol/min/mg;以上结果表明NJP是一种新的碱性凝血酶样丝氨酸蛋白酶。10.采用纤维蛋白平板法,以UK为对照,本实验所用的NJF酶制剂的纤溶活力为30000U/mg,我们将NJF的纤溶活性定为10BU/mg。。11.本实验采用管腔内线栓法成功建立了大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。12.通过神经功能损害评分和TTC染色,结果表明静脉输注NJF可以显着降低神经功能损害评分并剂量依赖性的降低缺血再灌注引起的脑梗死。13.静脉输注NJF可以剂量依赖性的降低缺血再灌注引起的脑水肿。14.静脉输注NJF可以显着降低MDA水平,提高SOD的活性,对抗脂质过氧化,提高内源性的抗氧化功能。15.静脉输注5BU/kg的NJF和临床等效剂量的15000U/kg的UK在减少脑梗死和降低脑水肿,以及对抗脂质过氧化和增强抗氧化活性等方面有几乎相等的功效；NJF对缺血再灌注大鼠大脑引起的局灶性脑缺血有潜在的神经保护功能；NJF具有神经保护功能的机制可能是：抑制脂质过氧化和增强内源性的抗氧化酶类。综上所述,本论文从日本刺沙蚕体内分离纯化并鉴定出一种明显不同于NJF和其他纤溶酶的新蛋白酶(NJP)。NJP是一种具有很高纤溶活性的碱性凝血酶样丝氨酸蛋白酶,可以直接降解纤维蛋白而不同于纤溶酶原激活剂。以上结果表明NJP具有成为防治血栓的新的溶栓剂的潜能；同时,本论文首次证明NJF对大鼠大脑中动脉阻断再灌注引起的局灶性脑缺血有很强的神经保护作用,此结果为NJF的进一步药效学和临床实验研究奠定了坚实的基础。
庄舜玖[8]2005年在《炎症因子在深静脉血栓形成机制中的作用研究》文中提出目的:研究白细胞介素家族中的有关炎症反应因子和C-反应蛋白在深静脉血栓病人中作用及其发病机理,探讨深静脉血栓病人早期诊断标志物和预防治疗方法。方法:选30例下肢深静脉血栓病人,按发病日期分为急性期和亚急性期2组,按病理类型分为周围型、中央型和混合型3组。在住院2小时治疗前和住院后第1、3、7、14天,分别检测IL-2、sIL-2R、IL-4、IL-6、IL-8和CRP。结果:在深静脉血栓病人中sIL-2R、IL-6、IL-8和CRP在发病初期普遍升高,急性期>亚急性期;中央型>混合型>周围型。在病情缓解后逐渐下降。IL-4血清值变化不大,无统计学意义。结论:在急性深静脉血栓病人中sIL-2R、IL-6、IL-8和CRP显着升高,与正常值相比各组炎症因子P值<0.01,特别CRP、sIL-2R可作为血液中早期炎症标志物的测定和反映和病情转归的炎症标志物测定。
参考文献：
[1]. 实验性急性血栓性肺栓塞凝血和纤溶系统的分子生物学研究[D]. 张敬霞. 天津医科大学. 2002
[2]. 急性肺血栓栓塞症继发慢性血栓栓塞性肺动脉高压的临床及基础研究[D]. 米杰. 天津医科大学. 2011
[3]. 短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的分离纯化、抗栓作用及原核表达的研究[D]. 张进华. 福建医科大学. 2009
[4]. 活血通络汤对下肢深静脉血栓形成相关因素的干预性研究[D]. 杨增敏. 南京中医药大学. 2009
[5]. 深静脉血栓形成病因学及基因治疗的初步研究[D]. 周为民. 苏州大学. 2010
[6]. 通心络治疗慢性肾小球肾炎临床研究[D]. 詹华奎. 成都中医药大学. 2005
[7]. 日本刺沙蚕蛋白酶的纯化、鉴定及日本刺沙蚕纤溶酶的部分药效学研究[D]. 王少华. 吉林大学. 2011
[8]. 炎症因子在深静脉血栓形成机制中的作用研究[D]. 庄舜玖. 第二军医大学. 2005
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