赵惠萍, 卢光秀, 王绮如[1]2003年在《骨髓内皮细胞条件培养液诱导胚胎干细胞向造血细胞分化》文中认为目前,诱导胚胎干细胞(ES细胞)向造血细胞分化主要应用小鼠成纤维细胞系与ES细胞共培养的方法。本课题探讨利用骨髓内皮细胞条件培养液(mBMEC-CM)诱导小鼠E5细胞向造血细胞分化,以消除外源性细胞污染,为诱导人ES细胞生成造血细胞提供实验基础。本课题采用先将小鼠胚胎干细胞形成4天拟胚体(day 4 embryoid bodies, 4dEBs),再用mBMEC-CM诱导4天拟胚体细胞生成造血干/祖细胞。实验根据造血集落的形成、造血干/祖细胞特异抗原和造血相关基因表达等方面检测诱导生成的细胞是否含造血干/祖细胞以及生成造血干/祖细胞的数量,并且检测诱导生成细胞的造血重建功能。实验还探讨了细胞因子或胎肝基质细胞条件培养液(mFLSC-CM)能否加强mBMEC-CM的诱导效果。主要结果如下:
赵惠萍[2]2003年在《骨髓内皮细胞条件培养液诱导胚胎干细胞向造血细胞分化》文中提出胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES cell)系是从早期胚胎细胞分离培养而建立的高度未分化的具有全能性的细胞系。在体外，ES细胞可自发分化为含有内胚层、中胚层、外胚层来源的多种组织和细胞的拟胚体。如何促进ES细胞向造血细胞定向分化是血液界学者关注的热点。目前，诱导ES细胞向造血细胞分化主要应用小鼠成纤维细胞系(如OP9、MS-5、RPO．10、ST2、NIH-3T3、PA6等)与ES细胞共培养的方法。本课题探讨利用骨髓内皮细胞条件培养液(mBMEC-CM)诱导小鼠ES细胞向造血细胞分化，以消除外源性细胞污染，为诱导人ES细胞生成造血细胞提供实验基础。在诱导小鼠ES细胞向造血细胞分化的实验中，我们采用先将小鼠胚胎干细胞形成4天拟胚体(day 4 embryoid bodies，4dEBs)，再用骨髓内皮细胞条件培养液诱导4天拟胚体细胞生成造血干／祖细胞。实验根据造血集落的形成、造血干／祖细胞特异抗原和造血相关基因表达等方面检测诱导生成的细胞是否含造血干／祖细胞以及生成造血干／祖细胞的数量，并且检测诱导生成细胞的造血重建功能。实验还探讨了骨髓内皮细胞条件培养液联用细胞因子或胎肝基质细胞条件培养液能否加强其诱导效果。主要结果如下： 一、胚胎干细胞鉴定以及形成拟胚体的影响因素 实验前对ES-D3细胞的生物学特性进行鉴定，包括对生长和未分化状态、体内外分化潜能、嵌合能力、染色体核型等特性进行检测。结果显示：ESo3细胞在小鼠胚胎成纤维细胞上和／或含白血病抑制因于亿F）的ES细胞培养液中形成典型的胚胎干细胞克隆，碱性磷酸酶染色结果为强阳性，具有正常二倍体核型以及具有在体内外分化为叁个胚层来源的组织细胞的潜能，而且具有形成种系嵌合动物的能力。以上实验说明拟采用的ESo3细胞株保持未分化状态，具有全能性。 以 5 X 10’加 的 ESo3细胞种入含 20％胎牛血清和 ZInM谷氨酚胺的高糖DMEM中，观察进口胎牛血清和国产胎牛血清、饲养层、培养器皿以及卜硫基乙醇对ES士3细胞形成的4dEBs数量的影响。结果表明：ESo3细胞在含有LIF的培养液中脱离饲养层培养3代以上才能形成EBs。在含进口 Hyclone胎牛血清或国产四季青胎牛血清的培养液中培养，ES－D3细胞形成的 4dEBs数量分另为 44．83if．22个／ml （n＝6）和 43．17士1．05个／。1（n＝6），差异无统计学意义（NO．05）。在不含p－颈基乙醇（P仇E“）或含p－ME的培养液中培养，ESo3细胞形成的4d朋s数量分另为49．33if．76个／ml（n书）和273．50士4．06个／ml（n二6），H者比较差异有统计学意义（HO．001）。在铺有粘附物质的细胞培养皿中培养，ES干3细胞不形成 EBS；在玻璃培养瓶中培养，ES－D3细胞形成的 4dEBs数量为 47．33士 1．48个／＊1（n＝6）；在Petri细菌培养M中培养，ES刁3细胞形成的4dEBs数量为310．83士 2．92个加1＊乃人叁者两两比较差异均有统计学意义u值均为HO．00人说明 ES03细胞脱离饲养层培养叁代后，在含国产四季青胎牛血清的培养液中加入 p仇E，置于 Pe t r i细菌培养皿中培养拟胚体，能提高拟胚体的形成数量。二、InBMEC－CM诱导小鼠ES细胞生成造血干／祖细胞 将获得的4dEBS制成单细胞悬液，加入InBMEC－CM诱导4dEBS的单细胞生成造血干／祖细胞。实验根据造血集落的形成、造血干／祖细胞特异抗原和造血相关基因表达等方面检测诱导生成的细胞是否含造血干／祖细胞以及生成造血于／祖细胞的数量。实验还探讨了骨髓内皮细胞条件培养液联用细胞因子或胎肝基质细胞条件培养液能否加强其诱导效果。 造血集落形成能力的检测结果显示：InBMEC六M诱导4dEBS的单细胞生成的细胞能形成mP六FC和 BFU士两种造血集落，具备小鼠骨髓细胞形成的这两种造血集落特征。诱导生成的细胞在HPP｛FC培养体系中形成的集落细胞，瑞氏－吉姆萨染色的结果中可观察到环状核的中幼粒细胞、杆状核和分叶核的粒细胞以及肾形核的单核细胞。同时免疫细胞化学染色结果显示，该集落大部分细胞表达CDI fo抗原．H鼠巨噬细胞、粒细胞、激活的淋巴细胞和NK细胞均有表达人 以上说明诱导生成的细胞能形成代表早期造血细胞的HPP六FC集落。诱导生成的细胞在BFU士培养体系中形成的集落细胞，联苯胺染色的结果显示，集落细胞的胞浆呈黄褐色，为阳性反应。该集落大部分细胞表达小鼠红系特异抗原 （TEd 人同时这些细胞表达胚胎型（p十）和成体型（p－major）珠蛋白基因。以上说明诱导生成的细胞能形成代表早期红系祖细胞的 BFU士集落。 以形成造血集落＊PP＜FC和 BFU中）的数量为检测指标，观察InBMEC七M诱导生成的细胞数与其形成的造血集落数之间的关系，并且观察InBMEC六M的适宜诱导浓度和诱导天数。结果显示：种入的由帕皿卜枷诱导生成的细胞数（在卜4X m‘个／M范围内）与形成的HPP—CFC禾 BFU—E集落数之间均呈良好的线性关系（HPP－CFC，r＝0．gi 6，HO．05；BFU－E，r＝0．927，RO．05）。InBMEC－CM诱导浓度（在 0－20％范围内）与其诱导生成的细胞形成的造血集?
王跃嗣[3]2005年在《人nthESC向HSC诱导分化和胚胎造血标志物表达研究》文中提出造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是近年来研究较多的一类组织干细胞,目前发现卵黄囊、胎肝、主动脉-性腺-中肾区(AGM)、胎儿血液以及胎盘中均存在具有高度扩增能力的HSC。本论文主要进行了具有课题组专利的人自体基因胚胎干细胞(nthESC)向造血干细胞的诱导分化、人胚胎发育过程中卵黄囊、胎肝和胎盘中的造血发育以及胎盘贴壁细胞的分离培养、向神经细胞诱导分化的研究,为nthESC 和HSC的临床应用提供了理论依据和技术方法。1. 探讨了人胚骨髓间充质干细胞(MSC)的体外分离、扩增、冻存、复苏、转GFP基因和向成骨和神经细胞的诱导分化条件,结果发现MSC有60%可转染GFP基因,表达CD29、CD13、CD59,而CD34、CD45和CD38表达阴性。Vimentin染色阳性,mallory染色显示胶原存在,分离的细胞可在神经诱导体系和成骨诱导体系下进一步向神经细胞和成骨细胞分化。表明MSC在体外能迅速扩增,具有向成骨和神经细胞分化潜能,可以作为稳定饲养层来源。2. 利用人MSC 与人nthESC 共培养,研究人MSC 对胚胎干细胞诱导造血的作用并建立一种有效诱导nthESC 为HSC 的方法。经过20 d 培养,获得大量的CD133+和CD34+绿色荧光标记的HSC。来源于nthESC 的KDR+细胞首先出现在第5 天,CD133 随后出现,CD34+细胞出现在第7 天,随时间延长叁者表达增强,第11 天左右表达最强,随后减弱,20 d 仍有表达。培养中发现11 d 可形成小造血集落,14 d 形成大集落。在BMP4、FGF-1和VEGF 等因子作用下,可促进造血细胞形成。结果显示由nthES 与MSC 共培养可产生CD34+细胞,nthESC 的造血分化程序为先形成KDR+细胞,其次是CD133+,再形成CD34+细胞。表明nthESC 可在人胚骨髓MSC 饲养层上有效诱导成HSC。3. 采用分阶段悬浮培养法,首先诱导nthESC 形成拟胚体(EB),在此过程中添加BMP4 和FGF-1。第二阶段,打散EB,再添加VEGF 和其他细胞因子,对HSC 进行扩增。结果发现,采用低黏附板可有效促进EB 形成,BMP4 和FGF-1 可使EB 形成数量明显增加,可使KDR+和CD133+荧光细胞数量明显增多。添加VEGF 等细胞因子,可有效促进CD34+细胞数量增加。结果表明,联合使用BMP4、FGF-1、VEGF 和SCF 等细胞因子,可使悬浮培养形成EB 数量增加,产生更多的造血前体细胞,继而产生大量HSC。
卢霞[4]2006年在《体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞》文中指出胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)是由哺乳动物囊胚的内细胞团(inner cell mass，ICM)或原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)分离出来的，能够在体外保持未分化的状态，并能进行高度增殖的多潜能细胞。它用途广泛，其中，诱导胚胎干细胞向各种功能细胞如血细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞、骨细胞等细胞的分化是目前的研究热点之一。通过部分基因被选择性的激活或者差异性表达，控制专一性蛋白质的合成和排布，从而获得特定的细胞。获得的功能细胞可以应用于细胞疗法，治疗神经系统疾病(如帕金森症)，免疫系统的疾病(如艾滋病)，造血系统疾病(如白血病)，心血管系统疾病(如心肌梗塞)以及各种恶性肿瘤(如肝癌)等等。 造血干细胞作为最原始的造血干细胞，是临床应用和基础研究的优良材料之一，它是当前应用于细胞疗法最多的一类细胞，当把它注射到患有白血病、再生障碍性贫血、重症免疫缺陷症、地中海贫血、急性放射病、恶性实体瘤或者淋巴瘤等造血及免疫系统功能障碍性疾病的患者体内，它能够发挥功能，重建患者体内的造血系统和免疫系统，从而达到治疗的目的，它是当前治疗恶性血液疾病和免疫疾病的最佳手段。但是在实际应用中，造血干细胞的分离方法复杂，含量很稀少，而且来源于体内的造血干细胞在体外增殖能力有限，因此利用胚胎干细胞分化为造血干细胞，可以获得大量长期增殖的多潜能的造血干细胞，从而解决临床应用和基础研究中造血干细胞材料不足的难题。 目前国际上常用的诱导方法有两种：一是采用OP9基质细胞与胚胎干细胞共培养；二是将胚胎干细胞先分化为拟胚体，然后添加一些外源细胞因子的组合，如BMP-4、VEGF、IL-3、IL-6、G-CSF、M-CSF、EPO等等，来诱导胚胎干细胞向造血干细胞。虽然这两种方法在诱导胚胎干细胞向造血干细胞分化取得了很大的成效，但是仍然存在着一些难以克服的局限性：①OP9基质细胞来自于M-CSF基因缺陷的小鼠，所以难以得到人的“OP9”细胞，另一方面，为了安全性着想，研究人胚胎干细胞向造血干细胞分化时，不应当使用小鼠来源的OP9基质细胞与之共培养。所以但是长远看来，ES／OP9共培养诱导体系有着其难以克服的局限性。②使用多种细胞因子混合作用，可以明确的显示各种细胞因子的
姜景岩[5]2005年在《胚胎干细胞来源的造血干/祖细胞辅助化疗的实验研究》文中研究指明第一部分:小鼠胚胎干细胞体外定向造血分化的研究 目的:ES-D_3细胞是来自129小鼠囊胚内细胞团的具有全能分化潜能的细胞。在合适的体外培养条件下,ES细胞体外可分化为造血干/祖细胞,作为造血干/祖细胞移植的新来源。研究表明,将ES细胞在体外分化为造血细胞的方法主要有两种。一种是利用可溶性细胞因子诱导ES细胞的分化。另一种方法是通过ES细胞与造血基质细胞的相互作用。本实验将两种方法合而为一,探讨体外高效诱导胚胎干细胞生成造血干细胞的方法。 方法:1、ES细胞的培养:为维持ES细胞的未分化特性,将ES细胞系ES-D3培养于PMEF上,培养基为高糖DMEM内含体积分数20%胎牛血清、1%非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、0.1 mmol/L丙酮酸钠和2 mmol/L谷氨酰胺。2、制备小鼠骨髓基质细胞饲养层BMSC:取6-8周昆明鼠骨髓,经淋巴细胞分离液分离,离心洗涤后,种植于含15%小牛血清的DMEM培养基中。2-3w后MMC处理1-2h,PBS冲洗5遍备用。3、拟胚体(EB)的形成:0.05%胰蛋白酶-0.53mmol EDTA消化生长在PMEF上的细胞克隆,制成单个细胞悬液,按10~5/ml转入IMDM培养基中(含20%胎牛血清,0.9%甲基纤维素,1%非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巯基乙醇和2 mmol/L谷氨酰胺)培养4-10天。4、诱导分化造血干细胞及造血祖细胞集落培养:将EB细胞消化分散为单个细胞,转入不同的培养基中,在37℃,5%CO2培养箱中培养7-14天。实验分4组:第一组:自发分化对照组;第二组:细胞因子组(VEGF+SCF+TPO);第叁组:骨
华进联[6]2005年在《人类胚胎生殖细胞的分离克隆及生物学特性研究》文中研究说明原始生殖细胞(PGCs)是各级生殖细胞和成熟配子的共同祖先。在体外适宜的培养条件下,PGCs 大量增殖形成与ESCs 高度类似的多能性细胞,称作EG 细胞。目前,小鼠和其他哺乳动物及人类:EG 细胞的分离培养均取得一些重要的进展,但有关人类PGCs 发育分化、体外分离培养体系及影响因素、无血清培养及检测、人类EGCs 的诱导分化特性等尚未见到系统的研究报道,本研究对上述4 个方面展开研究,以期探索出人类胚胎性腺生殖细胞发育分化规律;建立优化的人类EGCs 无血清分离培养体系;检测人类EGCs 的多向分化潜能,并在人类:EGCs 分离培养的基础上,向hEGCs 转染人类心肌α-actin 启动子,以探索人类心肌α-actin 启动子在人类心肌细胞分化中的作用。1 人胚胎性腺生殖细胞发育分化的研究组织学观察人胚胎睾丸和卵巢,Ki67 在10 w 胚胎睾丸表达最强,卵巢则在20 w 强表达。Bcl-2 在11.5 w 胚胎睾丸强表达,而在胚胎卵巢发育中一直表达较弱。在5～12 w 的睾丸,PGCs 强表达AKP、Oct4、SSEA-1;13 w 后,随胎龄增大,Oct4、AKP、SSEAl 表达减少。在5～32 w 的卵巢内,Oct4、AKP、SSEAl 在8 w 内的生殖细胞强表达;但在14 w 以后卵巢,Oct4、AKP、SSEAl 表达逐渐减少。透射电镜观察,早期胚胎的生殖嵴/腺见到大量的PGCs,一般为圆形或椭圆形,细胞核大,核质比高,细胞器较少。在出现性别分化后,雄性可见有间质细胞和支持细胞,细胞器较为丰富。雌性可见较大的卵母细胞和颗粒细胞。2 人类胚胎生殖细胞分离克隆体系的建立5%～15%NBS 均可以满足HEF、MEF 生长,以8%～10%NBS 为宜。对H=EF 的培养, 以}tDMEM 和α-MEM 效果较好。对MEF 的培养,HDMEM 效果最好。MEF、STO、HEF 等制作好的饲养层细胞维持时间不能超过7 d , 一般为5 ～7 d 。研究了流产胎儿对hEGCs 分离克隆的影响,表明7～12 w 最适于hEGCs 分离克隆, 自雄性胎儿分离hEGCs 的成功率明显高于雌性。筛选了几种细胞因子对hEGCs 生长增殖的最佳剂量,表明RA 和Forskolin 的最佳剂量分别为10-6mol/L 和10 u mol/L;LIF 为5 ng/mL:bFGF 为10 ng/mL;TNFa 为25 ng/mL;TGFB 的添加不利于hEGCs 克隆增殖;进一步将各种细胞因子组合能提高hPGCs 克隆增殖率,以此提出hEGCs 的最优培养基为:HDMEM+15%KSR+0.1 mmol/L 2Me +O.1 mmol/L 非必需氨基酸+2 mmol/L 谷氨酰胺+100 u/mL 青霉素+100 u/mL 链霉素,
杨超[7]2010年在《人胚胎干细胞定向诱导分化为造血细胞的实验研究》文中认为血细胞输注和造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)移植是目前细胞治疗的常用手段,广泛应用于恶性血液疾病、遗传性疾病、感染性疾病、重症免疫缺陷及肿瘤放化疗治疗后的造血支持治疗等领域。然而,血细胞来源紧张及病原微生物传播等问题给其临床应用的安全性和广泛性带来了很大的挑战。因此,人们期望寻找更为安全、经济和有效的血细胞和造血干细胞的资源。胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)在体外具有高度增殖和多向分化潜能,可定向诱导分化为神经细胞、心肌细胞、肝脏细胞、胰岛β细胞、造血细胞等多种类型的细胞。ES细胞具有比成体细胞更为广泛的分化潜能和可塑性,是最丰富的干细胞来源,备受科学家的青睐。大量的研究表明人ES细胞在体外可定向诱导分化为造血细胞,有可能为临床输血和造血干细胞移植,及恶性血液疾病的治疗提供新途径。目前,HSCs主要来源于脐带血、骨髓和动员后的外周血。从临床应用考虑,与传统来源的HSCs相比,人ES细胞来源的HSCs具有很多优势:合适的供体骨髓的来源短缺,虽然脐带血已建库,但脐血中的HSCs数量仍相对不足,限制了其在成人病人中的广泛应用。随着干细胞及其相关技术的发展,如核移植技术以及细胞重编程技术获得诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS细胞)等有可能为HSCs的获得提供患者自身遗传背景的ES细胞。此外,ES细胞在体外具有无限增殖潜能,可大量扩增培养,进而生成足够数量的HSCs,有可能成为治疗各种血液疾病的新的HSCs来源。目前,研究者主要采用可溶性细胞因子诱导法或造血基质细胞共培养法定向诱导人ES细胞向造血细胞分化。尽管ES细胞向造血细胞分化的研究已经取得了很大进展,且其研究和应用前景非常广阔,但体外大规模地定向诱导人ES细胞分化为成熟红细胞并最终应用于临床仍有很多关键的问题需要解决。首先,造血发育的过程有着复杂的基因调控,目前造血细胞分化的分子调控机制尚不明确,探讨ES细胞向造血细胞定向诱导分化调控的机制也将会提高ES细胞体外诱导分化的效率。其次,诱导中使用的各种细胞因子多为基因工程产品,价格昂贵。此外,鼠源饲养层是目前常用的诱导方法。然而,鼠源饲养层所带来的异源污染极大地限制了该研究在临床上的广泛应用。本研究中,我们首先探讨了前列腺素E2(prostaglandin,PGE2)在人ES细胞向造血细胞分化的作用并初步探讨了其机制,在此基础之上建立了转染促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)基因的人胎肝基质细胞(human fetal liver stromalcells,hFLSCs),利用其条件培养基诱导人ES细胞向红系细胞分化,建立了一种新型诱导人ES细胞向造血细胞分化的方法,既降低了实验成本,又可以避免异源污染。本研究主要包括两部分内容:一、PGE2促进人ES细胞向造血细胞分化人ES细胞在体外可定向诱导分化为造血细胞,尽管目前已建立了多种不同的诱导体系,仍处于起步阶段,细胞分化调控的机制尚不清楚,成为广大科研工作者研究的热点。PGE2是一种重要的细胞生长和调节因子。研究发现PGE2在正常及缺氧、感染等异常情况下对造血发育都有重要的调节作用。近年来,研究表明PGE2能够促进造血干细胞的存活、增殖及内环境调节方面具有一定的作用。最近研究指出PGE2能够促进放射性损伤后的成年斑马鱼恢复造血重建能力,提示PGE2在胚胎的造血发育过程中发挥重要的作用。此外,PGE2也可促进小鼠ES细胞向造血干细胞分化。因此,我们推测PGE2在人ES细胞向造血分化过程中也发挥一定作用。我们通过与OP9基质细胞共培养的方法考察PGE2对人ES细胞向造血细胞分化的影响:实验组添加PGE2,对照组不添加PGE2。结果发现,100ng/ml的PGE2可抑制集落的生长,20ng/ml的PGE2对集落生长有明显的促进作用,接种于半固体培养体系生成的造血集落最多,诱导产生的细胞具有向造血各谱系分化能力,加入PGE2抑制剂吲哚美辛后集落形成能力受到明显的抑制。为了观察PGE2对人ES细胞向造血细胞分化的影响,我们于显微镜下观察共培养细胞的形态学变化,结果发现不添加PGE2的情况下,人ES细胞接种于OP9细胞上,部分向上皮样细胞分化;部分形成血岛样的结构,随着培养时间的延长类似于血岛的结构会逐渐消失、变平。在加入PGE2的情况下,大部分会形成血岛样的结构,随着培养时间的延长血岛样的结构体积变大,但形态不会发生改变。收集共培养3～9d的细胞,用半定量PCR检测胚胎干细胞标志Oct4及造血和内皮相关基因的表达情况。结果表明,在不添加PGE2的情况下,诱导的细胞持续表达Oct-4,从培养的第3d开始表达中胚层标志Brachyury,早期造血标志CD34和内皮细胞标志VE-cad,从第5d开始表达造血调控相关基因Runx1,GATA1,SCL和内皮标志vWF。在添加PGE2的情况下Oct-4的表达从培养第3d开始降低,共培养的细胞从培养第3d开始表达Brachyury,CD34,Runx1,GATA1,SCL和VE-cad,从培养第5d开始表达vWF。这提示外源性添加PGE2可明显促进造血和内皮相关基因的表达。我们进一步考察了PGE2处理后Smad信号通路的变化。Western-blot结果显示,与对照组相比,PGE2处理能够上调p-Smad1/5的表达,同时Smad4的表达也上调。而加入PGE2的抑制剂后p-Smad1/5和Smad4的表达受到抑制,提示Smad信号通路可能参与了PGE2介导的人ES细胞向造血细胞分化。二、EPO基因修饰的hFLSCs条件培养基诱导人ES细胞向红系细胞分化在ES细胞体外诱导分化为造血细胞的过程中,研究造血微环境的调控机制是其发生和分化的重要环节。在胚胎发育的过程中,不同的造血微环境对造血的发生发挥着重要的作用。造血发生经历了卵黄囊造血、胎肝造血和骨髓造血叁个阶段。人卵黄囊造血时期发生在胚胎的4～6周;胎肝造血时期发生在胚胎的6～22周;骨髓造血时期从22周至出生以后。胎肝是造血早期发育的主要位点,是造血细胞发育和分化的重要微环境,构成其微环境的胎肝基质细胞很有可能在造血细胞的发育和分化过程中发挥重要的作用。此外,血细胞的产生还受到造血干细胞内在基因和造血因子的共同调控,EPO是其产生的最重要的因子。EPO是一种糖基化的蛋白质激素,主要来源于肾脏和肝脏,而脑、肺、脾也能产生少量。EPO可促进造血干细胞向原始红细胞分化,加速幼红细胞的分裂、增殖,促进血红蛋白的合成,在红细胞诱导分化研究中发挥重要作用。而造血因子提供的方式对其作用的发挥也有重要的影响。研究表明以造血生长因子基因修饰的基质细胞比相同条件下的造血生长因子更能有效地调控造血。因此,本部分研究中我们采用慢病毒系统建立了稳定高表达EPO基因的hFLSCs,能够高效分泌具有生物学活性的EPO蛋白,从而避免了添加外源性细胞因子,极大地降低了实验成本。随后,将人ES细胞培养于低黏附的细胞培养皿中诱导生成拟胚体(embryoid bodies,EBs),用过表达EPO基因的FLSCs条件培养基(EPO/hFLSCs-CM)诱导EBs细胞向造血细胞分化,未转染EPO基因的FLSCs条件培养基(hFLSCs-CM)作为阴性对照,未转染EPO基因的FLSCs条件培养基外源性添加重组的EPO(hFLSCs-CM+EPO)作为阳性对照。收集诱导不同天数的细胞,通过流式细胞术分析诱导过程中CD34阳性的表达,以确定不同培养条件下EBs向造血细胞分化的情况。结果表明叁种不同的培养体系均能诱导人ES细胞向造血细胞分化。然而,hFLSCs-CM组的诱导效率较低,在诱导第12d中CD34阳性细胞低于11%。添加外源性EPO之后,人ES细胞向造血细胞定向分化的能力增强,其中CD34+细胞最高可达13.1%。EPO/hFLSCs-CM组能更为有效地促进人ES细胞向造血细胞分化,其中CD34+细胞可高达22.74%。此外,我们还应用实时定量PCR检测不同组细胞造血相关基因的表达情况;应用克隆形成实验检测了诱导细胞的造血集落形成能力;通过瑞氏-吉姆萨染色观查了诱导细胞的形态;应用联苯胺染色和RT-PCR方法检测了诱导造血集落珠蛋白的表达情况。结果表明,诱导生成的细胞具有造血细胞的一般特性,在半固体培养基中可分化为不同种类的造血集落,不同培养条件下产生的造血细胞的集落形成能力与珠蛋白的表达量不同,EPO/hFLSCs-CM诱导产生细胞的造血基因的表达量及所形成的造血克隆最多,且以红系克隆为主。此外,我们还检测了诱导产生的红系细胞的携氧能力。结果显示,EPO/hFLSCs-CM诱导的红系细胞具有和脐带血相似的“S”形氧离曲线,这表明体外诱导的红系细胞具有和脐带血相似的携氧能力。综上所述,在本研究中我们初步考察了PGE2在人ES细胞向造血细胞分化过程中的作用并初步探讨了其作用机制;并利用稳定表达EPO基因的FLSCs条件培养基诱导人ES细胞向红系细胞分化,该方法可高效诱导人ES细胞定向诱导分化为造血细胞,同时降低了研究成本,且有效避免了鼠源饲养层带来的异源基因污染。上述研究为深入探讨造血细胞的发育调控机制及以胚胎干细胞或造血干细胞为启动细胞大规模地诱导产生红细胞奠定了一定的实验基础。
徐令, 乔春平, 黄绍良, 李树浓, 吴旋[8]2000年在《体外定向诱导胚胎干细胞为造血细胞》文中认为采用分阶段诱导小鼠和人胚胎细胞分化的培养体系，用流式细胞仪、免疫组织化学及Ｗｒｉｇｈｔ染色鉴定细胞，探索体外定向诱导小鼠及人的胚胎干细胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ， ＥＳ）为造血细胞的方法，为胚胎干细胞来源的造血细胞应用于临床，以及研究造血细胞发育机制奠定基础．结果表明：采用β－巯基乙醇（２－ＭＥ）可使ＥＳ细胞发育形成胚胎体，此阶段各种细胞因子不利于胚胎体的形成．干细胞因子（ＳＣＦ）、血小板生成素（ＴＰＯ）和胚胎细胞条件培养液可使胚胎体细胞发育分化为造血干／祖细胞．诱导第 ６天流式细胞仪检ＣＤ~＋_（３４）细胞为 ８６％．原代骨髓基质细胞饲养层，ＳＣＦ和ＩＬ－６可使胚胎干细胞来源的造血干／祖细胞向Ｂ淋巴细胞系分化，诱导第１４天大多数为ＣＤ~＋（３４_）ＣＤ~＋（３８_）浆细胞形态、免疫球蛋白阳性的细胞采用分阶段诱导人的胚胎细胞分化，与小鼠相似，第１阶段可以形成胚胎体，第２阶段形成ＣＤ~＋（３４_）的造血干／祖细胞．
赵惠萍, 卢光琇, 王绮如[9]2003年在《骨髓内皮细胞条件培养液促进小鼠胚胎干细胞向造血分化》文中研究说明为观察骨髓内皮细胞条件培养液 (BECM)和 (或 )细胞因子 (VEGF +SCF +EPO)对小鼠胚胎干细胞 (ESC D3细胞 )生成造血干 /祖细胞的促进作用 ,先将ESC D3细胞形成 4天胚状体 (Day 4embryoidbody,4dEB) ,再诱导 4dEBs生成造血干 /祖细胞。实验分 4组 ,第 1,2和 3组分别为BECM +VEGF +SCF +EPO ,BECM和VEGF +SCF +EPO组 ,第 4组为自发分化对照组。检测各组造血干 /祖细胞特异抗原、造血转录因子表达以及造血集落的形成。结果显示 ,BECM和 (或 )细胞因子诱导生成的细胞均表达造血干 /祖细胞抗原 (c kit,Sca 1,Thy 1和CD34)和造血转录因子(c myb ,SCL和β H1) 基因mRNA ,培养后可产生HPP CFC和BFU E。从诱导ESC D3细胞生成造血干 /祖细胞的数量和生成的集落总数看 ,BECM联合细胞因子组诱导效率均显着高于单用组和对照组。结论 :骨髓内皮细胞条件培养液能显着促进胚胎干细胞早期造血分化 ,且骨髓内皮细胞条件培养液与细胞因子联合时效果更强
孙璇[10]2010年在《胚胎干细胞或胚胎样干细胞向血管细胞的分化及调控机制研究》文中提出血管系统是人类最大,分布最广的系统。血管细胞主要包括内皮细胞和平滑肌细胞。血管细胞的功能异常可以导致动脉粥样硬化,心肌梗塞,脑中风等血管疾病。胚胎干细胞来源于囊胚内细胞团,是具有无限增殖能力和向各胚层细胞分化能力的全能干细胞。胚胎干细胞向内皮细胞或平滑肌细胞分化的研究对血管细胞的发育生物学,心血管药物的筛选,并可望为细胞移植治疗提供细胞来源。本研究论文主要进行小鼠和人类的胚胎干细胞(ESCs)及胚胎干细胞样细胞(iPS细胞)向内皮细胞(ECs)和平滑肌细胞(SMCs)分化的体系构建及相关机制研究,包括以下五个方面：1、小鼠骨髓内皮细胞条件培养液对小鼠胚胎干细胞向内皮细胞分化的诱导作用；2、人类胚胎干细胞来源的内皮样细胞与脐血来源的内皮祖细胞和脐静脉内皮细胞的比较；3、iPS细胞向内皮细胞及平滑肌细胞的分化；4、平滑肌细胞分化过程中促进分化的转录因子的筛选及调控机制的初步研究；5、锌指蛋白297B协同Myocardin调节平滑肌细胞的分化。第一章小鼠骨髓内皮细胞条件培养液促进鼠胚胎干细胞向内皮细胞的诱导分化目的：小鼠骨髓内皮细胞的条件培养液在以前的实验中被证明能促进造血细胞的增殖及分化,促进骨髓内皮细胞的生长。本实验研究内皮细胞条件培养基(mEC-CM)对小鼠胚胎干细胞向内皮细胞分化的促进作用及分化的内皮细胞的纯化。方法：在这个研究中,我们用mEC-CM诱导mESCs向内皮细胞前体细胞Flkl+细胞分化,并将诱导分化的效率同细胞因子(VEGF,EGF,bFGF和IGF-1)诱导的效率相比较。我们还从分化的mESCs中机械挑选了吞噬DiI-Ac-LDL的鹅卵石样细胞,分析其生物学特性。结果：mEC-CM能明显促进mESCs向Flkl+细胞的分化,其效率与细胞因子的诱导相似,mEC-CM与细胞因子组合没有协同诱导作用。mEC-CM的诱导结合机械挑选DiI-Ac-LDL标记阳性的鹅卵石样细胞的方法,能纯化分化的内皮样细胞,表达内皮细胞标志,结合UEA1,并能在体外形成血管样结构。结论：mEC-CM能诱导mESCs向内皮细胞的分化。机械挑选DiI-Ac-LDL标记阳性的鹅卵石样细胞的方法能纯化mESCs分化的内皮样细胞。第二章胚胎干细胞来源的内皮细胞的诱导分化及其与人脐静脉内皮细胞和脐血内皮祖细胞的比较目的：从人类胚胎干细胞分化系统中分选出内皮前体细胞(KDR+细胞),研究其特性,并与脐血来源的内皮祖细胞和脐静脉内皮细胞进行比较。方法：用本研究所建立的人类胚胎干细胞株chESC-1, chESC-3, chESC-8, chESC-20和chESC-22,自发分化成9天的拟胚体,磁珠分选出KDR+细胞,在内皮细胞培养基培养后,检测其内皮细胞标志的表达,生长特性,及其内皮细胞功能,并与脐血内皮祖细胞和脐静脉内皮细胞进行比较。结果：从9天EBs中分选出KDR+细胞在内皮细胞培养基中培养后,与成体内皮细胞相比较,胚胎干细胞来源的KDR+细胞表达更多的内皮祖细胞标志如CD133,CD34,不表达成熟内皮细胞标志vWF,能结合UEA1,吞噬DiI-Ac-LDL,并能在matrigel上形成血管样结构。在体外培养过程中,KDR+细胞的祖细胞标志逐渐减少,出现成熟内皮细胞标志。结论：人胚胎干细胞株能向内皮细胞分化,分选得到的KDR+细胞在内皮细胞培养条件下与成体内皮细胞比较显示其内皮祖细胞特性,并能在体外培养中向成熟内皮细胞分化。第叁章iPS细胞向内皮细胞和平滑肌细胞的诱导分化目的：成纤维细胞转染Oct4, c-Myc, Sox2和Klf4四种因子得到的诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)是一种胚胎干细胞样细胞,能无限增殖并具有多向分化潜能,较之胚胎干细胞,iPS细胞避免了伦理问题,且能建立患者特异性的细胞株,具有很高的临床应用价值。本研究探讨小鼠iPS细胞向血管细胞(内皮细胞和平滑肌细胞)分化的能力。方法：采用单层贴壁诱导及流式细胞术进行Flkl+细胞分化与分选,进而与OP9基质细胞共培养,并用VE-cadherin为标志纯化内皮细胞(09-EC)；用高剂量反式视黄酸(RA)诱导iPS向平滑肌细胞分化。检测分化细胞的基因表达,免疫标记和细胞功能,与普通小鼠胚胎干细胞的分化效率相比较。结果：小鼠iPS细胞可以向内皮细胞和平滑肌细胞分化,分化效率与普通小鼠胚胎干细胞相似。分化的内皮细胞能表达CD31,CD144等表面标志,吞噬DiI-Ac-LDL,并能在matrigel上形成血管。分化的平滑肌细胞能表达SMAa, SMMHC等标志,在碳酰胆碱刺激下有收缩功能。分化过程中内皮或平滑肌细胞特异性基因表达上调,而Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc这四种诱导iPS细胞形成的转录因子的表达显着下调。结论：小鼠iPS细胞能向内皮细胞和平滑肌细胞诱导分化,其分化潜能与小鼠胚胎干细胞相似。第四章平滑肌细胞重要调节因子Myocardin的协同转录因子的筛选目的：平滑肌细胞的增殖分化与血管内膜增生,冠状动脉狭窄等血管病理密切相关,Myocardin是平滑肌分化过程中不可缺少的一个协同转录因子,本实验希望通过筛选与Myocardin结合的蛋白,找到在平滑肌分化过程中新的重要的转录因子或协同转录因子,研究其在平滑肌分化过程中的功能及所属信号通路,进而更深入了解平滑肌分化的分子机制。方法：用荧光素酶活性实验筛选1170个转录因子中能上调Myocardin表达的转录因子,并用免疫共沉淀等方法进一步确认候选因子与Myocardin蛋白水平的物理结合,通过生物信息学分析等方法筛选出候选因子,在小鼠胚胎干细胞向平滑肌细胞分化模型中确定其在平滑肌细胞分化中的调节作用。结果：我们从1170个转录因子中筛选出ZNF297B,RAI14和MAGED1等转录因子,确定其在平滑肌中高表达,在平滑肌分化过程中上调,并能与Myocardin直接结合,其过表达能促进平滑肌分化基因的表达。结论：ZNF297B,RAI14和MAGED1等转录因子可能是调节平滑肌分化的重要转录因子。第五章锌指蛋白297B协同Myocardin调节平滑肌细胞的分化目的：探讨锌指蛋白297B(ZNF297B)在平滑肌细胞分化过程中的表达及相关机制。方法：用定量实时PCR检测ZNF297B在人,大鼠,小鼠平滑肌细胞中体内／体外的表达量及在平滑肌细胞体内和体外分化或增殖过程中的表达变化；构建ZNF297B-Myc表达质粒,免疫荧光检测ZNF297B-Myc在大鼠平滑肌细胞中的表达分布；用荧光素酶活性检测及免疫共沉淀实验检测ZNF297B与Myocardin的结合及相互作用。结果：ZNF297B在平滑肌细胞中特异性高表达,在小鼠胚胎干细胞向平滑肌细胞分化过程中表达上调,在PDGFBB刺激的平滑肌细胞增殖过程中下调,在大鼠颈动脉球囊损伤内膜修复过程中表达先上调后下降。ZNF297B主要分布于细胞核及核周的细胞质。ZNF297B能与Myocardin蛋白结合,荧光素酶活性检测显示ZNF297B的表达受Myocardin的调控。结论：ZNF297B可能在平滑肌细胞分化过程中起到重要正向调控作用,这一作用很可能是通过ZNF297B与Myocardin的协同作用来完成。
参考文献：
[1]. 骨髓内皮细胞条件培养液诱导胚胎干细胞向造血细胞分化[C]. 赵惠萍, 卢光秀, 王绮如. 中国生理学会张锡钧基金会第八届全国青年优秀生理学学术论文综合摘要. 2003
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[8]. 体外定向诱导胚胎干细胞为造血细胞[J]. 徐令, 乔春平, 黄绍良, 李树浓, 吴旋. 科学通报. 2000
[9]. 骨髓内皮细胞条件培养液促进小鼠胚胎干细胞向造血分化[J]. 赵惠萍, 卢光琇, 王绮如. 中国实验血液学杂志. 2003
[10]. 胚胎干细胞或胚胎样干细胞向血管细胞的分化及调控机制研究[D]. 孙璇. 中南大学. 2010
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