（南京大学医学院附属口腔医院/南京市口腔医院牙体牙髓病科210008）
【摘要】目的：运用组织工程方法体外构建口腔黏膜模型。方法：选用人牙龈为组织来源，分别培养人牙龈上皮细胞及成纤维细胞，在transwell小室以胶原为培养基质，分别进行浸没培养和气液分化培养。结果：组织学检查发现，经此方法体外构建的口腔黏膜结构类似于正常口腔黏膜。结论：在口腔黏膜固有层构建当天接种牙龈上皮细胞，经过3天浸没增殖培养和10天气-液界面的分化培养，可以获得良好分化的口腔黏膜模型。
【关键词】口腔黏膜；三维体外构建；胶原
【中图分类号】R2【文献标号】A【文章编号】2095-9753（2018）12-0207-01
正常口腔黏膜包括两个不同的组织结构，即表面的上皮组织和下方的固有层。【1】 体外运用组织工程的方法构建口腔黏膜不仅可以运用于临床各种创面的短期覆盖及长期替代，也可作为体外实验模型，用于正常口腔黏膜特征，口腔疾病的发生机制，损伤修复机制，生物材料相容性，上皮和结缔组织间信号通路等多方面的研究。因此本实验的目的是以胶原为细胞外基质，构建具有一定表面积，稳定可靠的口腔黏膜结缔组织。
一、材料与方法
(1)口腔黏膜组织处理及细胞培养：取临床智齿拔除术中无明显炎症和感染的健康切除牙龈，取得患者知情同意，修剪组织块。分别将每个组织块置于5 ml 0.25% Dispase I溶液中，4℃过夜消化（16-18h）；次日丢弃消化液，用无菌眼科镊将上皮和结缔组织分离，可见上皮呈一薄层半透明片状组织，上皮细胞小心重悬于无血清培养基K-SFM进行培养。牙龈结缔组织切割成尽量小的组织块，用组织块培养法培养牙龈成纤维细胞。
(2)黏膜固有层培养：取生长状态良好的第4~6代牙龈成纤维细胞，0.05%胰酶-EDTA消化重悬计数，置于预冷的PBS中，与预先准备好的无细胞胶原混合液小心充分混合。将含成纤维细胞的胶原混合液接种在之前预备好的已凝固的无细胞层上，37℃静置一小时。待胶原完全凝固后，在6孔板内小心加入约4ml含1% FBS的DMEM培养液，没过胶原高度。培养7天后，取胶原中央直径约为5毫米的组织块进行组织学处理，胶原Weigert-azan染色。
(3)口腔黏膜模型的体外构建：取生长状态良好的第三代或第四代上皮细胞，消化，重悬，镜下以较小的圆形透亮的细胞计数，调整细胞浓度为20 x 106/ml；在结缔组织胶原凝胶表面中央小心滴加50μl上皮细胞悬液，置于细胞超净台上15min，转移至细胞培养箱中孵育2小时； 4ml 增殖培养液，次日可在胶原表面加入少许增殖培养液，确保上皮细胞完全浸没状态培养；浸没培养3天后，将培养物升至液-气平面，换用2ml不含血清的分化培养液，每天换液，继续培养10天；收获分化培养10天后的口腔黏膜模型，PBS小心洗涤两次，2% 多聚甲醛固定，组织学处理，石蜡包埋；10μ切片，HE染色。
二、结果：
1.我们对细胞培养小室种类，胶原浓度和细胞密度进行预实验，以尽可能减少胶原水平方向收缩，保证一定胶原表面面积，尽可能包含一定数量成纤维细胞接近生理情况为目的，对各种实验参数进行优化。实验中我们发现：在3μm，PET膜的细胞小室中，胶原混合液凝固完全，培养至第7天未见较明显的水平方向的收缩。胶原终浓度增加至2.5mg/ml时，培养7天后胶原在水平方向未见明显收缩。在终浓度为2.5mg/ml的胶原基质中，以2 x 105/ml，5 x 105/ml和106/ml的细胞浓度，培养7天未见胶原在水平方向上的明显收缩。见图1。
图1 胶原浓度为2.5mg/ml时不同细胞浓度胶原凝胶培养七天后Weigert-azan染色。A.细胞密度为2x105/ml；B. 细胞密度为5x105/ml；C. 细胞密度为106/ml
2.经过优化接种上皮细胞时机，我们发现在制备结缔组织当天接种上皮细胞，经过3天增殖培养和10天的分化培养后，胶原在水平方向上收缩不大。经过良好增殖和分化的口腔黏膜模型表面可见上皮细胞成膜片状，形态类似角化黏膜或皮肤，结缔组织部分较初建立时在垂直方向上有所收缩，质地坚硬较韧。口腔黏膜模型的HE染色可见，成纤维细胞均匀分散在胶原基质中，伸展成典型的梭状；上皮细胞增殖成多细胞复层，靠近胶原部分即基底层位置的上皮细胞可见较大的深染细胞核，越靠近表层，细胞核逐渐减少，表层细胞核少见，呈现典型的角化层结构。HE的结果表明，体外构建的口腔黏膜结构类似于正常口腔黏膜。见图2。
图2 口腔黏膜模型HE染色。 A. 5x；B. 20x；C.40x
三、讨论
成纤维细胞在上皮形态发生，上皮细胞粘附和真皮-表皮连接形成过程中发挥着重要作用[2]。为了研究口腔上皮细胞和成纤维细胞在损伤修复以及唇腭裂手术后修复中的相互作用和信号通路，用于体外实验的口腔黏膜模型，需要同时包含成纤维细胞和上皮细胞，因此在我们的口腔黏膜模型构建中首先需要构建包含一定数量的成纤维细胞的黏膜固有层。
1996年，Masuda首次用含有成纤维细胞的牛皮肤胶原凝胶作为固有层构建了分化良好的黏膜模型[3]。用胶原凝胶作为固有层支架具有很多优点。首先，胶原是正常口腔黏膜固有层最丰富的细胞外基质，细胞凝胶的组织学表现类似于固有层结构。其次，胶原溶液呈酸性，在4℃时呈相对较为粘稠的液体；当其pH接近中性，37℃孵育时胶原溶液可以凝固成胶冻状。因此可以利用胶原的这一特点，在低温时将所需的细胞数与pH接近中性的胶原溶液充分混合，37℃孵育使其固化，则形成包含成纤维细胞的胶原凝胶。
早在1983年，Prunieras等就提出在体外通过将器官培养组织升高至气-液界面（air-liquid interface， ALI）可以使得上皮细胞获得充分的分化[3]。气-液界面的培养通过重组组织的底部给予上皮细胞营养，以包含上皮细胞增殖，分层和分化所需营养物质的液体培养基喂饲上皮下方的支持组织如脱细胞真皮，或者包含成纤维细胞的胶原凝胶[4]，而将其表面暴露于空气中，模仿了体内上皮生长的环境。Transwell细胞小室用多孔通透性膜作为胶原凝胶的机械支持，设置了细胞内外室，可以仅在细胞外室内补充培养液，调整培养液高度，在升高培养界面，换液等日常操作中简洁方便，并且可以有效的减少对培养物的扰动，因此近年来被广泛的用于皮肤或黏膜的三维培养。
四、结论
本研究利用牙龈来源的成纤维细胞，在口腔黏膜固有层构建当天接种牙龈上皮细胞，经过3天浸没增殖培养和10天气-液界面的分化培养，获得良好分化的口腔黏膜模型，可用于正常口腔黏膜特征，口腔疾病的发生机制，损伤修复机制，生物材料相容性，上皮和结缔组织间信号通路等多方面的研究。
参考文献：
1、Liu, J., et al., Skin and oral mucosa equivalents: construction and performance. Orthod Craniofac Res, 2010. 13(1): p. 11-20.
2、Saintigny, G., et al., Reconstruction of epidermis on a chitosan cross-linked collagen-GAG lattice: effect of fibroblasts. Acta Derm Venereol, 1993. 73(3): p. 175-80
3、Prunieras, M., M. Regnier, and D. Woodley, Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. J Invest Dermatol, 1983. 81(1 Suppl): p. 28s-33s
4、Poumay, Y. and A. Coquette, Modelling the human epidermis in vitro: tools for basic and applied research. Archives of Dermatological Research, 2007. 298(8): p. 361-9.
论文作者:杨亚萍,徐蓉蓉,杨卫东通讯作者
论文发表刊物:《中国医学人文》2018年第12期
论文发表时间:2019/3/12
标签：胶原论文; 黏膜论文; 细胞论文; 口腔论文; 上皮细胞论文; 结缔组织论文; 纤维论文; 《中国医学人文》2018年第12期论文;