周武[1]2003年在《DNA与过氧化物酶催化性质的差异》文中研究表明本论文分为实验报告和综述两大部分。实验部分主要是比较了DNA和辣根过氧化物酶催化性质的差异。首先底物经催化后的吸收峰不同，如：以联苯胺与α-萘酚为底物，DNA催化产物吸收峰在450nm，而过氧化物酶催化产物的吸收峰在501nm。以联苯胺与邻苯二酚为底物，DNA催化后的吸收峰在503nm，过氧化物酶催化后的吸收峰在603nm。然后对以联苯胺与α-萘酚为底物，以H_2O_2为氧化剂，进行高效液相色谱分析，分析结果表明DNA与过氧化物酶作用后的产物在峰面积和峰高上有不同数值；同时，不同形式的DNA对该反应都有催化活性，表明只要是生物来源的DNA(非特异性DNA)都具有一定程度的催化活性。接着进行了pH梯度实验，发现不同pH条件下，DNA和辣根过氧化物酶也表现不同之处。最后又以七种底物进行实验，发现DNA均无明显活性，而辣根过氧化物酶有不同程度的活性。上述研究表明：DNA具有过氧化物酶样的活性，但是又不同于一般的蛋白质性质的酶，因为它与蛋白质性质的辣根过氧化物酶的催化性质有明显差异。在综述部分概括了deoxyribozyme研究的发展过程，并探讨了deoxyribozyme的理论及应用价值。
迟茂强[2]2018年在《一维导电高分子基复合纳米材料的构筑及其协同类酶催化性质研究》文中研究指明酶催化反应是生物工程的重要组成部分,广泛应用于食品、纺织、医药、化工等多个领域,具有催化效率高、用量少、反应专一等优点。然而天然酶在提取、应用以及存储的过程中存在很多问题,例如制备与提纯昂贵,使用稳定性较差,对催化环境要求苛刻,难以回收再利用等。因此人造模拟酶的开发应运而生,它是指人工合成的具有与天然酶相似功能的催化物质,具有制备简单、成本低廉、稳定性好、改性方便等特点。目前人造模拟酶的热点为纳米酶,即具有类天然酶活性的纳米材料。近年来,许多纳米材料如Au纳米粒子、磁性Fe_3O_4纳米粒子、V_2O_5纳米线、碳纳米管等均展现出优异的固有模拟酶催化性质,在分子检测、生物传感、生物防护等许多方面具有广泛应用。但是单一组分的材料往往很难满足实际需求,存在着催化活性低、亲和力差、易团聚等缺陷。将多种组分复合制备出二元或多元的复合纳米材料,能够结合不同材料的性质与优点,增强其催化活性及扩大应用范围。导电高分子纳米材料具有优异的导电性及电荷传输能力,可以加速电子转移,加快催化进程。将导电高分子与其它纳米酶材料复合,除了能优化材料的分散性、稳定性等,还可能会产生协同效应,使复合材料的类酶催化性能得到提升。本论文从一维纳米材料的设计合成出发,通过不同的制备方法,如自组装聚合法、静电纺丝法、原位聚合法、气相聚合法等,合成了导电聚合物与其它金属或金属化合物的一维纳米复合结构,研究了不同材料组分与形貌的调控对其类酶催化性质的影响,着重考察了导电高分子对材料催化性能的作用。基于材料的类酶催化特性,进一步实现了对过氧化氢、谷胱甘肽、抗坏血酸等分子的高灵敏检测,并对其选择性进行了研究。具体内容如下:1.聚3,4-乙撑二氧噻吩基复合材料:(1)通过自组装聚合法,利用亚碲酸钠为氧化剂氧化EDOT单体聚合,制备出了一种Te@PEDOT同轴核壳结构纳米纤维,进一步通过置换反应将Te@PEDOT纳米纤维转换为Pd@PEDOT纳米纤维。所得的Pd@PEDOT核壳纳米纤维展现出了比钯黑更加优异的类过氧化物酶催化性质,可以归因于其独特的核壳结构以及Pd与PEDOT的协同效应。利用该体系实现了对H_2O_2的检测,其检测限可达到4.83μM。此材料初步验证了导电高分子PEDOT的类酶催化增强作用。(2)从二元拓展至叁元,通过静电纺丝法及高温煅烧法制备了CeO_2/Co_3O_4复合纳米纤维,与单独的CeO_2纤维和Co_3O_4纤维比较,CeO_2/Co_3O_4复合纳米纤维展现出了更好的类过氧化物酶催化性质,归因于CeO_2/Co_3O_4 p-n异质结的形成。进一步利用原位氧化还原法以组分中的Co_3O_4为氧化剂在其表面又修饰了一层PEDOT导电高分子,制备了CeO_2/Co_3O_4/PEDOT叁元纳米复合纤维,该材料相比CeO_2/Co_3O_4纳米纤维其类过氧化物酶催化活性进一步提升,展现出了PEDOT高分子的二次协同作用。动力学研究表明其对H_2O_2和TMB基质均展现出良好的亲和力,对H_2O_2的检测限可以达到1.67μM。2.聚吡咯基复合材料:(1)结合静电纺丝法与高温煅烧法制备出FeMnO_3双金属氧化物。进一步,利用材料本身的氧化性通过气相聚合方法在其外部生长了导电高分子PPy,通过反应时间的调控,制备出形貌可控的FeMnO_3@PPy一维纳米复合物。当反应时间为120 min时,该结构外部为管状PPy,内部为FeMnO_3纳米粒子,这种新颖结构的纳米管表现出了良好的类过氧化物酶催化活性,同等条件的催化效果可以达到FeMnO_3纳米纤维的五倍。原因在于这种纳米结构具备表面积大、密度低、界面位点多等优势,在催化反应过程中还提供了纳米级的反应室,避免了活性组分的团聚。另外导电高分子PPy还可以对材料电荷转移等能力进行优化,与FeMnO_3组分产生协同,这些原因共同导致了复合材料催化活性产生的巨大提升。在材料固有的类过氧化物酶性质的基础上,本文提供了一种简便灵敏的检测GSH的方法,其检测限低至36 nM,且具备优异的选择性。(2)通过水热法制备了MoS_2纳米管,以此为基底一步法在其外部直接生长了PPy与Pd,制备了叁元MoS_2-PPy-Pd纳米管,与任意两元组成的复合材料相比,MoS_2-PPy-Pd纳米管展现出了更优的类过氧化物酶催化活性。材料对H_2O_2检测限可以达到2.51μM,此外可以利用该材料体系实现对L-半胱氨酸的检测,其检测限低至78 nM,且具备优异的选择性。3.聚苯胺基复合材料:(1)通过溶液混合法,制备了PANi纳米线,利用其具有的还原性,以KMnO_4为氧化剂在其表面生长了Mn O_2。所制备的PANi-MnO_2纳米线具备优异的类氧化物酶催化性质,与单独的MnO_2组分相比,材料展现出了更为优异的类氧化物酶活性,体现出了PANi基底对材料类酶性质的增强作用。利用材料固有的类氧化物酶性质,实现了其对SO_3~(2-)与AA的检测,检测限分别为79 nM和26 nM,且选择性都较为优异。不足的是,其类过氧化物酶催化性质较差。(2)为了改善PANi-MnO_2的类过氧化物酶催化性质,通过电子转移还原法成功的引入了Pd粒子,制备出了PANi-MnO_2-Pd纳米线。该复合物既具备优异的类过氧化物酶催化性质,也同时保留了类氧化物酶催化性质。其类过氧化物酶催化效果远远优于组分中等量的Pd黑,归因于PANi-MnO_2基底的协同作用。其对L-半胱氨酸的检测限低至83 nM,对抗坏血酸检测限低至35 nM,证明其是一种优异的双类酶性质材料。(3)通过一步自组装聚合方法,制备出了纺锤状的Au-PANi纳米棒,研究了不同含量的APTES与HAuCl_4对材料形貌的影响。由于Au纳米粒子与PANi基质之间的协同作用,材料展现出了远优于Au纳米球的类过氧化物酶催化活性。此外Au-PANi纳米棒也是一种优秀的SERS基底,结合其类过氧化物酶性质与SERS性质,可以实现对H_2O_2的检测,其最低检测浓度可达到10~(-8) M,远远低于利用紫外监控所得的结果。这为H_2O_2或其它分子的高灵敏检测提供了一种新思路。
陈静[3]2016年在《功能化石墨烯纳米材料模拟过氧化物酶及其应用研究》文中认为酶是一种具有生物催化活性的高分子物质,能够高效专一地催化各种与生命活动相关的化学反应,应用十分广泛。但酶也存在一些固有缺陷,如稳定性差、易受外界环境影响而失活以及不易保存和制备等,极大限制了它们的应用。实际需求促使人们寻找一种既具有酶的催化性能又简单稳定的物质实现对酶功能的模拟。氧化石墨烯(GO)具有一定的模拟酶活性,然而,随着含氧官能团的引入,石墨烯的大π-π共轭结构遭到破坏,势必会消弱其电子传导能力,可能会导致催化性能降低。相比GO,石墨烯可能具备更好的催化性能。但是,由于片与片之间的范德华力作用及π-π堆积作用,石墨烯难分散、易团聚,限制了它的应用。高分子聚合物功能化的石墨烯既有石墨烯原有的特性,又克服了难分散、易团聚的问题,还可以利用功能分子特殊的性质实现石墨烯与其他纳米材料的复合,从而赋予其更优异的催化活性。本论文制备了聚苯乙烯磺酸钠功能化的石墨烯(PSS-Gr)和负载纳米铂的聚苯乙烯磺酸钠功能化的石墨烯(PSS-Gr-Pt),对它们的模拟过氧化物酶活性进行了考察,利用这一性能建立了测定H_2O_2、葡萄糖、抗坏血酸(AA)和谷胱甘肽(GSH)的比色传感方法,并应用于实际样品的检测。具体研究内容如下:1.PSS-Gr模拟过氧化物酶及其在比色传感上的应用本课题研究了PSS-Gr模拟过氧化物酶时的稳态动力学和催化机理,它的催化行为满足典型的Michaelis-Menten动力学模型,类似于HRP,属于乒乓机理。由于PSS-Gr具有更强的负电性,在酸性条件下,更易吸附带正电的TMB,它的的类酶活性高于石墨烯和GO。基于PSS-Gr优越的类酶催化性能,建立了一种灵敏检测H_2O_2的方法,线性范围为5.00×10-6-1.00×10-3 mol·L~(-1),检测限为1.50×10-7 mol·L~(-1)。葡萄糖在葡萄糖氧化酶(GOx)的作用下产生H_2O_2,基于此,对葡萄糖进行了检测,线性范围为6.00×10-6-4.00×10-4 mol·L~(-1),检测限为2.80×10-7 mol·L~(-1)。并检测了血浆中葡萄糖的含量,与葡萄糖试剂盒的检测结果相符。AA具有还原性,可以消耗H_2O_2,抑制TMB的氧化,基于此,建立了一种新颖的比色传感方法,对AA检测,线性范围为8.00×10-7-6.00×10-5 mol·L~(-1),检测限为1.50×10-7 mol·L~(-1),并成功应用于维生素C片和果汁中AA的检测。2.PSS-Gr-Pt模拟过氧化物酶及其在比色传感上的应用由于纳米铂和石墨烯片层间较强的电子转移作用及其在模拟酶催化性能上的协同作用,PSS-Gr-Pt具有较高的类似过氧化物酶的催化活性,能在室温条件下快速催化H_2O_2氧化TMB发生显色反应。PSS-Gr-Pt满足酶促反应的特征,催化反应遵循乒乓机理。建立了H_2O_2和葡萄糖的分析方法,检测限分别为5.19×10-9mol·L~(-1)和9.28×10-8 mol·L~(-1),与上一个工作相比,分别降低了29倍和3倍。基于GSH对H_2O_2或氧化态TMB(ox TMB)的还原作用,建立了检测GSH的比色传感方法,线性范围为4.00×10-7-6.00×10-5 mol·L~(-1),检测限为2.90×10-7 mol·L~(-1),并成功用于谷胱甘肽眼药水中GSH的检测。
黄忠[4]2003年在《金属配合物及金属胶束模拟水解金属酶及过氧化物酶研究》文中认为金属配合物及金属胶束作为人工酶的模型化合物受到广泛而深入的研究，本文通过合成一系列的草酰胺桥联同核和异核双核配合物，较为系统地研究了它们催化羧酸酯、磷酸酯水解反应的动力学，探讨了它们的作用机制；同时，本文还探索了将金属胶束这一较为成功的水解酶模拟模型应用于过氧化物酶模拟研究的可行性。 从研究羧酸酯水解反应过程中金属离子的催化作用入手，本文研究了铜离子与二胺类配体与表面活性剂CTAB在溶液中形成的金属胶束催化乙酸对硝基苯基酯(PNPA)水解反应，通过定量的动力学分析，总结了胶束催化的一般特性。 对比研究了两种同核和异核草酰胺桥联双核配合物催化α—吡啶甲酸对硝基苯基酯(PNPP)水解反应的动力学，探讨了双核配合物中不同金属离子对羧酸酯水解反应的影响，动力学分析结果表明，在催化PNPP水解反应过程中，Zn(Ⅱ)比Cu(Ⅱ)具有更大的催化活性。 对比研究了两种同核草酰胺桥联双核配合物与不同类型的表面活性剂形成的金属胶束催化PNPP水解反应的动力学。结果表明阳离子表面活性剂形成的金属胶束对酯水解反应的促进作用最为明显，根据胶束的静电作用提出了较为合理的阐释。 四川大学博士学位论文二二巴宫巴巴巴巴巴巴二二巴巴二吕 研究了四种不同配体的Cu(II)Ni(II)异双核配合物在表面活性剂Brij35中形成的金属胶束催化对硝基苯基磷酸酷(NPP)水解反应的动力学，结果表明四种金属离子相同、结构类似的配合物形成的金属胶束催化NPP水解反应表现出不同的催化活性，通过对配体的极性比较，得出了催化活性的不同是由配体极性的差异使得配位水的活化程度不同而造成了催化活性的差异。 对比研究了叁种Cu(II)Ni(II)异双核配合物在不同类型的表面活性剂形成的金属胶束催化双(对硝基苯基)磷酸酷(BNPP)水解反应的动力学，结果表明，叁种配合物形成的金属胶束催化BNPP的水解反应表现出较高的活性，机理研究表明，由于配体和胶束的极性差异而使得金属胶束表现出不同的催化活性。 探索了将金属胶束模拟过氧化物酶的可行性，本文用一种Co(II)单核配合物与不同类型的表面活性剂形成的金属胶束催化过氧化氢对苯酚氧化反应，得到了较为满意的结果。这一结果既为胶束催化拓宽了研究领域，也为金属胶束模拟过氧化物酶的进一步研究提供了有价值的参考信息。
李素萍[5]2015年在《微纳米催化材料在比色分析中的应用研究》文中认为本论文中,我们主要利用微纳米材料的固有催化特性构建比色检测传感器。主要研究工作如下：1、我们研究了基于汞诱导原位合成金纳米粒子的性质,发现该纳米粒子能够催化Au+氧化四甲基联苯胺(TMB)生成蓝色氧化态TMB产物。在Au+存在时,室温下,TMB很难被氧化。但是加入微量汞离子后,反应溶液能够较快从无色变为蓝色。基于此,构建了一种简单快速的检测汞离子的比色传感器。该方法对汞离子的检测具有良好的选择性,且检测限低至2 nM,远远低于世界卫生组织规定的饮水中最大无机汞浓度不大于6 ppb(30 nM)的标准。此外,我们还将该方法应用于实际水样品中的检测。2、我们首次证明了B和N共掺杂的碳纳米球(CNBs)具有类似过氧化物酶的催化活性并讨论了N单原子掺杂与B和N双原子掺杂以及碳化温度对催化活性的影响。CNBs可以在过氧化氢的存在下,催化氧化过氧化物酶的底物TMB,反应溶液从无色变为蓝色。该颜色的变化可以用于比色法检测过氧化氢。我们还结合葡萄糖氧化酶将该方法应用于葡萄糖的检测。实验证明,CNBs具有高效率的类似过氧化物酶活性、稳定性良好、易合成、成本低等优点,有望应用于实际样品中过氧化氢和葡萄糖的检测。
林英武[6]2005年在《细胞色素b_5向细胞色素c的结构转化以及不同表达体系对其结构、性质和功能的影响》文中提出血红素蛋白是一大类含有原卟啉Ⅸ(血红素，heme)作为辅基的金属蛋白，在生命体系中执行着重要的生物功能，如氧载体功能(血红蛋白，Hb和肌红蛋白，Mb)，电子传递功能(细胞色素b_5，cyt b_5和细胞色素c，cyt c等)，生物催化功能(细胞色素P450，cyt P450和细胞色素c过氧化物酶，CcP等)，以及生物传感功能(CO传感器CooA和NO传感器sGC等)。相同的辅基heme如何被不同的蛋白分子所利用，来执行不同的生物功能，一直是化学生物学和蛋白质化学研究领域所关注的重点，人们正试图对这一问题进行解答来认识金属蛋白结构—性质—反应—功能之间所蕴含的精妙关系。Cyt b_5是血红素蛋白中电子传递蛋白的典型代表，其辅基heme与蛋白肽链的结合是以非共价键的方式进行的，结合能力主要来自heme轴向双组氨酸His39和His63的配位作用，以及氢键和疏水作用等。Cyt b_5与cyt c不同，后者辅基heme的两个乙烯基与蛋白肽链上结合heme的结构片段域Cys-Xaa-Xaa-Cys-His(CXXCH)中的半胱氨酸形成了两个硫醚键，因而以共价键的方式相互结合。同时，与cyt c或Mb相比，cyt b_5分子中辅基heme有着更大的溶液暴露程度。这些原因直接导致了cyt b_5具有较低的辅基结合稳定性。纵观cyt b_5的研究历程，我们发现关于cyt b_5轴向配体的研究相对较少，这主要是因为heme轴向配体的突变会很大程度上降低cyt b_5的辅基结合能力，以至于通过体内表达的方法得不到轴向突变体的全蛋白(holo-protein)，只能表达出没有结合heme的脱辅基蛋白(apo-protein)。后者由于蛋白稳定性低，而且没有holo-protein的特征红色，给后续分离纯化带来了很大的困难，操作过程较提纯cyt b_5复杂得多，往往需要投入很多时间和精力，才能获得足够纯度的蛋白用于进一步实验研究。然而，关于血红素蛋白结构、性质和功能的很多研究，正是集中在活性中心辅基heme的轴向配体上。因此，如何提高cyt b_5辅基结合的稳定性，以及如何简化cyt b_5的分离纯化方法，特别是如何使用简便的提纯方法来获得cyt b_5轴向突变体的apo-protein，是一系列值得研究与探索的课题。由于cyt b_5中并不存在cyt c中所具有的结合heme的结构片段域CXXCH，而且整个蛋白肽链中并不存在Cys，因此无法形成类似cyt c中的硫醚键。通过对cyt b_5晶体结构信息作仔细深入地研究后，我们发现距离heme 2-乙烯基和4-乙烯基最近的氨基酸残基分别为Ser71和Asn57，它们的β位碳原子与2-、4-乙烯基α碳原子的距离分别为4.32和3.86(?)。这样的距离很适合共价键的形成，如果将这两个位点的氨基酸残基分别用Cys取代，在蛋白表达的过程中，所引入的Cys极有可能分别与heme的两个乙烯基发生加成反应，形成类似cyt c中的硫醚键。因此，我们运用定点突变的方法构建了cyt b_5，N57C、cyt b_5 S71C以及cyt b_5 N57C／S71C突变体，并对其进行了性质表征。研究证明，在cyt b_5分子中heme乙烯基附近适当的位置引入半胱氨酸，通过体内表达的方法，的确可以实现辅基heme与蛋白肽链的共价键合。所引入的Cys与heme分别形成了两种不同的Cysteine-Heme共价键：其中在57位形成了经典的硫醚键，而在71位形成了非典型的[heme-CO-CH_2-S-CH_2-C_α]键。这种差别主要取决于所引入半胱氨酸与heme乙烯基之间的距离，乙烯基自身的取向，以及各自所处的微环境等因素。研究结果也表明并不需要构建类似cyt c中所特有的结合heme的结构片段域CXXCH，即可实现cyt b_5向cyt c的结构转化，这说明CXXCH对于heme与蛋白肽链间的共价键合并非是必需的因素。而且，我们研究发现，具有heme共价键合的cyt b_5(cyt c-like cyt b_5)在去折迭状态下表现出相当高的过氧化酶催化活性。这些研究成果为我们认识c-型细胞色素的形成机理，以及认识血红素蛋白的结构—性质—反应—功能之间的关系，提供了重要的信息。在寻求分离纯化cyt b_5的简化方法过程中，我们尝试了用谷胱甘肽S-转移酶表达系统，将cyt b_5表达为GST-cyt b_5融合蛋白的方式进行分离纯化。实验结果证实，cyt b_5的确可以以融合蛋白的形式进行表达，而且可以在体内表达得到结合有辅基heme的holo-protein。GST-cyt b_5融合蛋白的表达体系具有其他cyt b_5表达体系无法比拟的优越性，其操作相对简单，只需经过一步GST亲和层析即可得到目标融合蛋白。同时，融合蛋白的性质表征表明：融合蛋白内GST与cyt b_5之间的蛋白—蛋白相互作用相对较弱，它们的相互融合并没有很大程度上改变彼此的整体结构与基本功能。一方面GST-cyt b_5融合蛋白有着与cyt b_5相类似的性质与功能，另一方面它又具有GST的亲和性，这使得融合蛋白具有双重功能与应用前景。然而，在表达GST-cyt b_5轴向突变体蛋白时，只能得到apo-protein，而且，GST对heme的高亲和性严重影响了GST-cyt b_5突变体蛋白apo-protein与heme的体外重组。因而，GST表达体系并不适合用来获得涉及cyt b_5轴向突变的突变体蛋白holo-protein。此外，我们还通过组氨酸标记表达体系，在cyt b_5分子的N-端引入(His)_(6-tag)，然后用Ni~(2+)亲和柱对cyt b_5进行分离纯化。研究表明，(His)_(6-cyt b_5)有着与cyt b_5相类似的光谱学、电化学以及化学稳定性，说明(His)_(6-tag)的引入对蛋白的结构、性质和功能没有明显地影响。同时，(His)_(6-tag)的引入不影响apo-protein与heme的体外重组。因此，这种方法更适用于cyt b_5轴向突变的突变体蛋白holo-protein的获得。通过这种方法，我们获得了(His)_(6-cyt 6j H39G单点突变体，以及轴向His39与Gly42进行序列上互换的双点突变体蛋白[(His)_(6-cyt) b_5 H39G／G42H]。对突变体蛋白表征的结果表明：当heme轴向配位的组氨酸由39位转移至42位，仍能形成heme的轴向配体，只是相对天然的His39来说，His42的配位能力较弱。这一研究表明cyt b_5分子的蛋白肽链具有一定的柔韧性，因此要在cyt b_5的heme疏水腔中构建类似天然过氧化物酶分子中所存在的远端组氨酸(distal histidine)，困难远比在蛋白结构相对更加刚性的Mb分子中构建要大得多。这些研究成果进一步拓宽了我们对cyt b_5的结构—性质—反应—功能关系的认识。
王中华[7]2007年在《细胞色素c向过氧化物酶结构—功能的转化研究》文中研究说明血红素蛋白是一大类含有原卟啉Ⅸ(血红素，heme)作为辅基的金属蛋白，在生命体系中执行着重要的生物功能，如：血红蛋白(hemoglobin，Hb)和肌红蛋白(myoglobin，Mb)等具有载氧功能，细胞色素c(cytochrome c，Cyt c)和细胞色素b_5(cytochrome b_5，Cyt b_5)等具有电子传递功能，细胞色素P450(cytochrome P450，Cyt P450)和细胞色素c过氧化物酶(cytochrome c peroxidase，CcP)等具有生物催化功能，CO敏感器(CooA)和NO敏感器(soluble guanylate cyclase，sGC)具有生物传感功能等。相同的辅基heme如何被不同的蛋白分子所利用，来执行不同的生物功能，一直是化学生物学和蛋白质化学研究领域所关注的重点，人们正试图对这一问题进行解答来认识金属蛋白结构—性质—反应—功能之间所蕴含的微妙关系。Cyt c是血红素蛋白中电子传递蛋白的典型代表，其辅基heme与蛋白肽链的结合除了来自heme轴向配体组氨酸(His18)和甲硫氨酸(Met80)的配位作用、氢键和疏水相互作用等非共价键作用方式外，血红辅基heme的两个乙烯基还与蛋白肽链上的结构片段域Cys-Xaa-Xaa-Cys-His(CXXCH)中的两个半胱氨酸形成硫醚键以共价键方式相结合。因而Cyt c的血红素辅基(heme c)与蛋白多肽链之间的结合很牢固，蛋白质的性质相对很稳定。正是由于Cyt c蛋白的稳定性使其不但是血红素蛋白结构与功能关系研究的典型代表，而且也是血红素蛋白结构与功能转换研究的良好模板蛋白。虽然Cyt c在生物体内的主要功能是在线粒体中传递电子和参与细胞调亡，在生物体外的一定条件下却也能表现出过氧化物酶活性并具有诸多优点，如：抗热变性、抗有机溶剂等。但与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)和细胞色素c过氧化物酶等天然过氧化物酶相比，Cyt c的过氧化物酶活性是很低的，其原因主要在于Cyt c与HRP及CcP等天然过氧化物酶在结构上存在较大的差异。通过晶体结构对比分析，我们不难发现Cyt c与HRP的结构之间主要存在以下区别：首先是血红素辅基heme在HRP中是处于五配位高自旋状态，而在Cyt c中是处于六配位低自旋；其次是HRP中heme的轴向位置有一个组氨酸，但没有与heme配位，而是一个远端组氨酸(distal histidine)；除此之外，HRP还有一个带正电荷的远端精氨酸(distal arginine)存在，这些结构特征都是Cyt c所不具备的。HRP所具有的这些结构特点不但有利于过氧化物酶反应过程中活性中间体CompoundⅠ的形成，而且也有利于反应底物与酶的结合。虽然对Cyt c蛋白分子进行定点突变及其过氧化物酶活性研究的报道不少，但却几乎没有人对如何将Cyt c转化成为类过氧化物酶(peroxidase-like)分子进行过专门的分子设计。因此通过分子设计和蛋白质工程等方法，将Cyt c这个具有较高稳定性的电子传递蛋白转化为一个具有较高pemxidase-like活性的酶分子，不但有助于我们对血红素蛋白结构—性质—反应—功能之间关系的理解，同时也有可能创造出一个具有一定应用前景的、新的金属蛋白酶。通过对Cyt c的晶体结构进行观察分析后，我们发现Pro71几乎位于heme辅基Met80一侧的正上方，如果将Pro71替换成His71后，His71上的Nε原子与heme中心Fe~(3+)间的距离为～5.62(?)，非常接近HRP和CcP分子中远端组氨酸Nε原子到heme中心Fe~(3+)的距离(在HRP和CcP中该距离分别为～5.84和～5.55(?))。因而我们通过基因突变方法，首先用一个无配位能力的缬氨酸(Valine，Va1)取代了轴向配体Met80，得到一个Cyt c的单点突变体(Cyt c M80V，M80V)；在此基础上又用histidine取代了71位的proline，得到一个双点突变体(Cyt cP71H／M80V，P71H／M80V)。突变体蛋白的peroxidase-like催化活性实验结果显示，Cyt c M80V突变体蛋白的peroxidase-like催化活性确实比野生型细胞色素c(wild type cytochrome c，WT Cyt c)高；然而，再在71位引入一个“distal histidine”后所得Cyt c P71H／M80V双点突变体蛋白的催化活性不仅没有比Cyt c M80V高，反而比WT Cyt c还低。于是我们对P71H／M80V蛋白性质进行了一系列的研究，结果表明可能是由于Cyt c中Ωloop D肽段(residues 70-84)具有很强的柔韧性，使得His71并没有象HRP中的distal histidine一样起到酸碱催化功能，而是与heme发生了配位作用，无论是在氧化态还是还原态都成了heme的第六轴向配体。由于在71位引入的histidine没有起到distal histidine的作用，我们对Cyt c分子再次进行分析后发现，Tyr67虽然不象Pro71一样位于heme的正上方(假定heme位于水平面上，第五轴向配体His18位于heme的下方)，但也位于heme的斜上方。同时分子模拟结果显示，如果将Tyr67突变成His67后，His67的Nε原子与heme中心Fe~(3+)间的距离为～5.18(?)，接近HRP中distal histidine到heme中心Fe~(3+)的距离(～5.84(?))，于是我们构建了Cyt c Y67H和Y67H／M80V突变体基因并进行了蛋白表达和性质研究。研究结果表明，Cyt c Y67H和Y67H／M80V蛋白的过氧化物酶活性都在WT Cyt c的基础上得到了很大的提高；而且在同样条件下，Cyt c Y67H催化氧化邻甲氧基苯酚反应得到的表观二级反应速率常数(k_(cat)／K_m)比天然过氧化物酶HRP还高。在天然过氧化物酶(如HRP)中除了有一个远端组氨酸外，还有一个远端精氨酸(distal arginine)。为了模拟过氧化物酶的这一结构，我们又制备了Cyt cY67R和Y67R／P71H／M80V突变体蛋白，并对它们的基本性质和催化活性进行了研究。结果表明在Cyt c的heme腔中引入的arginine(Arg67)确实提高了Cyt c的催化活性，但同时也可能是由于Arg的R基团较大而产生的空间效应影响了底物(guaiacol)的结合，从而导致了米氏常数(K_m)的增加。此外，为了进一步研究在heme的轴向配体Met80存在的情况下，Cyt c中第71位的保守氨基酸残基proline被具有较强配位能力的histidine替换后，对Cyt c蛋白结构和性质的影响，我们又制备了Cyt c P71H这个单点突变体蛋白。通过一系列光谱学性质研究后，我们发现在Cyt c P71H中heme的轴向配体随蛋白所处的氧化还原状态不同而发生变化，在氧化态时heme的第六轴向配体是His71，而在还原态时和WT Cyt c一样仍然是Met80。这一研究表明Cyt c分子中位于Ωloop D肽段中的Pro71对稳定Cyt c分子的构象有着重要的作用，在加上Ωloop D这一肽段本身就比较柔韧，所以要想在71位构建一个distal histidine需要重新进行分子设计。总之，本论文的这些研究不但丰富了我们对Cyt c分子的认识，同时也进一步拓宽了我们对血红素蛋白结构—性质—反应—功能关系的理解。
韩凤[8]2011年在《番薯过氧化物酶的纯化及其催化鲁米诺化学发光特性研究》文中研究指明过氧化物酶是一类可催化由过氧化氢参与的氧化各种还原剂的氧化还原酶,广泛存在于各种动物、植物和微生物体内,该酶可应用于酶联免疫测定、诊断试剂、生物传感器、有机合成和污染治理等。论文以番薯(Ipomoea batatas Lam.)为实验材料,研究了番薯过氧化物酶的分离纯化方法、酶学性质以及其催化鲁米诺化学发光性质。从番薯皮中分离和纯化番薯过氧化物酶,纯化过程包括匀浆、水提、双水相萃取、Sepharose CL-6B凝胶层析、Phenyl Sepharose 6 fast flow疏水层析和Con A Sepharose 4B亲和层析。经纯化的番薯过氧化物酶比活力为6930 U/mg,纯化倍数为165,回收率为17%。SDS-PAGE显示一条带,分子量为34000,RZ值为2。以愈创木酚作底物对纯化的番薯过氧化物酶酶学性质进行表征,分析了温度、pH对酶促反应的影响,考查了酶的热稳定性、酸碱稳定性。酶反应的最适pH在5.5附近,最适温度为70℃；在pH2.2处保存24小时酶活性都未完全失活,中性偏碱性条件下酶稳定性非常高,60℃保温1 h,酶活力残余60%,番薯过氧化物酶是一种良好的耐酸碱、耐热过氧化物酶。Fe2+、Fe3+对番薯过氧化物酶有强抑制作用,而Ca2+、Mg2+对其有一定的激活作用,表面活性剂PEG和SDS则对其活性无显着影响；有机溶剂甲醇、丙酮和乙醇对该酶均有抑制作用,抑制作用由强到弱表现为乙醇＞丙酮＞甲醇。对番薯过氧化物酶催化鲁米诺化学发光条件进行优化,发现在该酶催化鲁米诺化学发光体系中,Tris缓冲液最适pH为9.0,最适浓度为60 mmol/L;鲁米诺、过氧化氢最适浓度分别为5 mmol/L和4 mmol/L；番薯过氧化物酶浓度最低检测限为5 fmol/L。同其它的阴性植物过氧化物酶一样,番薯过氧化物酶在不依赖于增强剂的条件下催化鲁米诺发光,可以得到稳定的光信号,且灵敏度高,发光时效长；番薯过氧化物酶这一性质结合它本身的高稳定性,使其在化学发光酶联免疫分析中具有极大的应用潜力。
胡伟[9]2007年在《金属配合物及其金属胶束模拟水解酶和过氧化物酶的研究》文中研究表明天然酶由于具有高选择性、高活性和反应条件温和而受到化学和生物学者的关注。学者们利用各种各样简单或复杂的化学体系(模拟模型)来模拟天然酶。通过研究模拟酶了解天然酶的结构、性质和功能之间的关系，探索酶催化反应机理，为设计和合成结构简单、高活性、高选择性和反应条件温和的理想催化剂奠定理论基础，开发出具有实用价值的绿色催化剂。本文以不同类型的功能配合物及其与表面活性剂形成的金属胶束作为水解酶和过氧化物酶的模拟酶模型，分别研究它们对羧酸酯、磷酸二酯水解反应和酚类氧化反应的催化作用，取得了新的有学术意义的成果。以不同结构的Schiff碱金属配合物作为羧酸酯、磷酸二酯水解酶的模拟酶，在缓冲溶液和胶束溶液中催化PNPP和BNPP水解，考查了它们催化PNPP和BNPP水解反应动力学，建立了一种新的动力学数学模型。结果表明：(1)催化水解的活性物种是含配位水分子的过渡金属配合物；(2)含冠醚的模拟模型物催化活性远远高于非冠醚类似物的催化活性，这是由于冠醚有助于亲脂性底物分子进入活性部位和通过氢键力协同中心金属离子对水分子的活化，并以此提出了水解反应机理；(3)作为侧链的(氮杂)冠醚环的结构对其催化活性有一定的影响，即侧链的大小、组成、结构和性质对金属配合物及其金属胶束的催化活性有重要影响；(4)催化活性与中心金属离子的Lewis酸性有关，Lewis酸性越强，配合物的pKa越小，其催化活性越高，因此在相同配体的配合物中有Ni~(2+)＞Cu~(2+)＞Co~(2+)的活性顺序；(5)催化活性随底物浓度增加、缓冲溶液pH值增大和在一定范围内反应温度的升高而增加。研究了冠醚Schiff碱金属配合物作为过氧化物酶的模拟模型对酚类物质氧化反应的催化作用，取得如下结果：(1)几种冠醚Schiff碱金属配合物对催化酚类物质氧化具有良好的催化活性，其中配体结构对其催化活性有较大的影响；(2)建立了金属配合物与表面活性剂形成的金属胶束催化酚类物质氧化反应的动力学数学模型；(3)探讨了金属胶束模拟过氧化物酶催化酚类氧化反应的可行性及其机理。上述不同类型的金属配合物及其金属胶束模拟酸酯水解酶和过氧化物酶的研究新结果，为今后设计活性更高的模拟水解酶和过氧化物酶以及研究它的催化机理提供了有价值的信息和依据。
张明[10]2010年在《DNA过氧化物酶的活性及在生物检测中应用的研究》文中指出DNA是生命体内十分重要的功能大分子,是绝大多数生物物种的遗传信息的载体。DNA具有不同的二级结构,包括叁螺旋DNA、G-四链体和i-motif序列等。探讨DNA的结构与功能的关系具有十分重要的意义,可以加深对生命本质的认识以及拓展DNA在各个领域的应用。DNA过氧化物酶是由G-四链体DNA与氯高铁血红素形成的复合物,具有过氧化物酶的活性,能够催化双氧水(H2O2)氧化2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)发生显色反应。本论文研究了DNA过氧化物酶的结构与功能的关系,并设计了一种基于DNA过氧化物酶的检测腺苷的生物传感器。1.通过对DNA过氧化物酶的DNA序列的末端进行突变的策略,利用紫外光谱,圆二色谱等实验手段,本文较系统地研究了DNA过氧化物酶的结构与酶活力的关系。我们发现在DNA过氧化物酶的DNA序列的末端增加核苷dTn会对其酶的活性发生较大的影响。当组装成的DNA过氧化物酶的结构越稳定,越有利于酶与底物(H2O2)间的结合,DNA过氧化物酶表现出的活性就越高,反之则越低。2.进而我们设计了一种基于DNA过氧化物酶的生物传感器,它是以核酸适配子为识别分子,以Fok I限制性内切酶为信号控制器,以DNA过氧化物酶为信号输出装置。该DNA生物传感器具有很好的灵敏度和选择性,只对腺苷有识别作用,且其最低检测下限可达500nM,对于其他核苷则无响应。此生物传感器能通过酶促反应的显色效果实现可视化检测,而无需依赖于仪器。
参考文献：
[1]. DNA与过氧化物酶催化性质的差异[D]. 周武. 湖南师范大学. 2003
[2]. 一维导电高分子基复合纳米材料的构筑及其协同类酶催化性质研究[D]. 迟茂强. 吉林大学. 2018
[3]. 功能化石墨烯纳米材料模拟过氧化物酶及其应用研究[D]. 陈静. 郑州大学. 2016
[4]. 金属配合物及金属胶束模拟水解金属酶及过氧化物酶研究[D]. 黄忠. 四川大学. 2003
[5]. 微纳米催化材料在比色分析中的应用研究[D]. 李素萍. 福建师范大学. 2015
[6]. 细胞色素b_5向细胞色素c的结构转化以及不同表达体系对其结构、性质和功能的影响[D]. 林英武. 复旦大学. 2005
[7]. 细胞色素c向过氧化物酶结构—功能的转化研究[D]. 王中华. 复旦大学. 2007
[8]. 番薯过氧化物酶的纯化及其催化鲁米诺化学发光特性研究[D]. 韩凤. 杭州师范大学. 2011
[9]. 金属配合物及其金属胶束模拟水解酶和过氧化物酶的研究[D]. 胡伟. 四川大学. 2007
[10]. DNA过氧化物酶的活性及在生物检测中应用的研究[D]. 张明. 武汉大学. 2010
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