梁垚, 王俊, 陈明胜, 张生杰, 潘飞[1]2011年在《冠菌素生物合成的研究进展》文中指出介绍了冠菌素生物合成的研究进展,总结了冠菌素合成研究的3个阶段。介绍了近年来发酵生产冠菌素菌株的选育及诱变,重点总结了发酵生产冠菌素过程中培养条件优化,指出了目前冠菌素的生物合成仍然存在产量低、发酵条件苛刻等不足,在新菌株的选育、分子手段的应用以及培养基优化是今后生物合成冠菌素研究的热点。
张博, 吴晓丽, 吴慧玲[2]2010年在《P. syringae pv. glycinea M-18生产冠菌素补料发酵工艺优化研究》文中研究指明【目的】提高丁香假单胞菌大豆致病变种高产突变株P. syringae pv. glycinea M-18,发酵生产冠菌素的产量。【方法】研究补料分批发酵过程中初始葡萄糖浓度、葡萄糖补加浓度、补加时间、补加次数、补加叁氯化铁的浓度及pH对发酵产生的影响,并在5 L发酵罐中进行放大试验。【结果】在5 L发酵罐中,自发酵后84 h起,保持葡萄糖浓度在5—2 g.L-1,初始葡萄糖浓度为10 g.L-1,发酵后84 h每升发酵液补加0.005 mmol叁氯化铁,发酵过程中用40 g.L-1的MgCO3来调控pH在6.7左右,与对照相比冠菌素的产量显着提高,最高达31%。【结论】在发酵过程中将葡萄糖控制在一个较合适的范围内可以显着提高P. syringae pv. glycinea M-18发酵生产冠菌素的产量。
张国栋[3]2003年在《冠菌素的发酵研究》文中进行了进一步梳理冠菌素具有与脱落酸、茉莉酸盐类似的结构和功能，是植物的生长调节物质。目前脱落酸和茉莉酸盐过高的生产成本限制了二者在农业生产上的应用，如果能用发酵法生产二者的替代物—冠菌素，将有利于农业生产。 从四个假单胞菌中筛选得到冠菌素产生菌株003号。紫外诱变后得到104号菌株产量提高了43.1％，第二次用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍诱变后得到212号菌株，产量在第一次基础上提高了14.3％。并且得到产冠菌素的耐高温菌株409号，虽然其产量只有出发菌株的44.8％，但是部分打破了温度对冠菌素产生的限制，为今后的筛选耐高温菌株创造了可能性。正在进行的第叁次诱变，希望能够得到耐有机氮源的冠菌素产生菌。 用正交法对其发酵条件进行优化。各因素主次顺序为：摇瓶装量、pH、KNO_3、MgSO_4·7H_2O、NH_4Cl、葡萄糖。 通过二次200升发酵罐发酵生产，获得的冠菌素样品结晶具有使叶片褪绿、抑制大豆茎伸长和使马铃薯块畸形的生物学活性，经过高效液相色谱、毛细管气谱—质谱联用、核磁共振等检测，确定为冠菌素。
梁垚[4]2012年在《桑疫病的分子检测及其病原菌发酵生产冠菌素的研究》文中研究指明桑丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae Pv. mori Van Hall）是桑疫病的致病菌，桑疫病是桑树的常见病害之一，又称桑细菌病，主要为害桑叶，近年来其疫情严重影响了蚕桑产业的正常发展。冠菌素（coronatine, COR）是一种由丁香假单胞菌的植物致病变种产生的植物生长物质，对于植物细菌病的发病和爆发有重要影响。本文从桑疫病致病菌的产冠菌素活性入手，通过研究致病菌产冠菌素与冠菌素调节桑树两方面，为明晰菌株-冠菌素-桑疫病叁者关系提供了新的思路，为综合防治桑疫病奠定了基础，同时桑丁香假单胞菌作为一种新型的产冠菌素菌株，其较高的产冠菌素活性和耐温性，也为打破冠菌素发酵的工业化瓶颈提供了良好的野生菌株。从桑疫病桑园通过选择性培养基筛选建立了桑疫病生境菌库。以科赫法则和16SrDNA序列相似性分析确定M4-13为桑丁香假单胞菌。初步探索和优化了桑丁香假单胞菌M4-13发酵产冠菌素的条件，发酵液的质谱图和HPLC谱图均验证了桑丁香假单胞菌的产冠菌素活性。通过M4-13生长速率-温度的研究，得到其最适生长温度为32℃，耐温范围在3℃到40℃之间。单因素法优化红糖发酵培养基可以显着提高M4-13的冠菌素发酵产量达300%。通过冠菌素对于多向生理调节作用的研究，发现了冠菌素浓度1μmol/L时，桑叶中1-DNJ提高了120%，黄酮提高了80%，多糖含量下降了48%。
于莎, 姜峰, 安冬捷, 谭伟明, 李召虎[5]2017年在《丁香假单胞菌Z2-6半连续发酵生产冠菌素的研究》文中研究说明冠菌素(coronatine,COR)是一种环境友好的新型植物生长调节剂,能有效调控植物生长,增强植物抗逆性。目前冠菌素主要通过微生物发酵的方式获得,而发酵效率低是限制冠菌素应用的最大问题。为提高冠菌素产量,本研究建立了丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)Z2-6的半连续发酵方式,并对移取起始时间、移取间隔时间以及移取体积3个方面进行了优化。结果表明,第10天开始移取较第8、9天开始移取可以延长冠菌素产出周期,使冠菌素合成始终维持在较高的水平。间隔1 d移取较间隔2 d移取冠菌素生产效率更高。当移取量不大于30%时,不会对菌体量产生影响,并且当移取量为30%时冠菌素产量达到最高。与传统发酵方法相比,在发酵第10天起每隔1 d移出30%发酵液并补充等体积新鲜培养基,可使冠菌素产量由11.2 mg/(L·d)提高到22.1 mg/(L·d),生产效率提高了98%。本研究利用半连续发酵方式有效提高了冠菌素发酵生产效率,节约了生产成本,为冠菌素的工业化生产和农业推广应用提供有力支持。
吴慧玲, 焦睿, 章家长, 李召虎[6]2009年在《Tn5转座诱变选育冠菌素耐高温生产菌株及其发酵条件研究》文中进行了进一步梳理利用双亲接合的方法将含有Tn5转座子的质粒pRL1063 a导入丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudo-m onas syingaepv.glycinea)PG4180中,在含有卡那霉素和链霉素的MG平板上筛选抗性接合子。通过诱变,从874个突变株中筛选得到2株高温下产生冠菌素的突变株MFB132和MFB141。进而对菌株MFB141的发酵条件进行了优化,其最佳发酵条件为:2%葡萄糖为碳源,0.1%氯化铵为氮源,培养基初始pH为6.8,装液量为50 mL/500mL,接种量为2%,发酵温度由原来的18℃上升到28℃,而发酵时间由原来的168 h缩短到108 h。在最优化条件下,出发菌株28℃下冠菌素产量仅为1.8 mg/L,而突变株MFB141在28℃下的产量达到37.66 mg/L,大约是出发菌株的21倍。
王春燕[7]2017年在《冠菌素产生菌筛选及工程菌构建》文中研究指明冠菌素(coronatine,COR)是丁香假单胞菌某些致病变种产生的次生代谢物,其结构和功能与茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)相似,能够提高植物抗逆性、诱导次生代谢、抑制发芽、促进器官脱落等,作为一种新型植物生长调节剂应用前景可观。目前COR主要依靠微生物发酵法生产,现有野生菌株产量低,种质资源有待进一步发掘,其合成调控网络的研究也不够全面透彻,制约了 COR产量的进一步提升。本研究通过野生菌的分离试图发掘新的COR生产野生菌资源,通过Tn5诱变获得突变群体,对产量变异显着的诱变株进行插入基因定位,初步探究诱变基因与COR合成的关系,为后续基因工程改造提供依据。本研究还克隆了冠烷酸(CMA)合成基因,构建了能合成COR合成前体CMA的酵母异源表达系统,探索COR生产的新模式。本研究还考察了 COR在水中的降解特性,为COR的生产、贮存及田间应用提供科学指导与参考。主要研究结果如下:1.根据COR合成关键基因corS、corR设计特异性引物及PCR程序,将该方法应用于分离的104株野生菌初筛,发现2株野生菌(7号和18号)能扩增出850 bp (corS)和450 bp (corR)的目标条带,HPLC检测其COR产量分别为6.5 mg/L和2.1 mg/L。2.利用Tn5转座对COR生产野生菌Pseudomonas.syringae pv. tomato DC3000进行诱变,通过随机PCR和基因组重测序方法成功定位了 19株COR产量变异显着突变株的插入位点,发现多个对COR生物合成具有重要调控作用的基因如PSPTO2603、PSPTO 2737、PSPTO 0367、PSPTO_1081 等,其中 PSPTO 2603、PSPTO_2737 基因突变导致COR无法合成。3.运用合成生物学方法,构建含有完整CMA合成基因的酵母表达系统,使得重组酵母成功合成COR合成前体CMA,产量达到6.1 mg/L。4. COR对温度和pH具有良好的耐受性;COR对可见光稳定,对紫外敏感,紫外光照射下,COR半衰期仅为61.9h; COR对氧化剂反应敏感,室温下3%H2O2处理12h,COR降解75%。
张生杰, 梁垚, 潘飞, 吕荣宾, 王俊[8]2011年在《生物合成冠菌素的桑丁香假单孢菌发酵条件》文中研究指明对自筛桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringaepv.moriM4-13)生物合成冠菌素的发酵条件进行研究。结果表明菌株M4-13采用变温模式发酵(在32℃培养3 d,18℃培养7 d)时,最佳培养基配方为:固定氮源为KNO3(0.3 g/L),红糖为碳源(20g/L),FeCl3(4μmol/L),KH2PO4(1 g/L),K2HPO4(3.6 g/L),MgSO4.7H2O(0.2 g/L),生物合成冠菌素的产量可由原来的40mg/L提高到149 mg/L。
李刚[9]2014年在《桑丁香假单胞菌稳产冠菌素关键技术的研究》文中进行了进一步梳理冠菌素是一种新型高效的生物源植物生长调节物质，喷施极低浓度的冠菌素，植物可获得更高的抗逆性和抗病性，具有广泛的应用前景。利用丁香假单胞菌发酵是工业化生产冠菌素有效途径之一，稳产高产冠菌素菌株是其前提。本文采用定量培养基技术对不同微生态环境下桑丁香假单胞菌密度分布进行了研究、采用重复序列PCR技术对不同生态型桑园桑丁香假单胞菌进行了分型研究和采用室温常压等离子体技术对产冠菌素菌株进行了诱变研究。结果认为，在对桑园桑丁香假单胞菌敏感的桑品种的桑树叶片组织中，可更有效地筛选到高产冠菌素野生菌株；利用室温常压等离子体突变技术，可获得稳产高产冠菌素突变体。研究结果对冠菌素规模化工业发酵奠定了基础。1）从桑树叶片组织中能更有效地分离获得高产冠菌素野生菌株。采用KBC选择性培养基对不同地区样品进行丁香假单孢菌野生菌株的筛选，对不同微生态环境下桑丁香假单胞菌密度分布进行了检测。结果表明，桑树叶片组织和桑园土壤中丁香假单胞菌的数量存在显着性差异，桑树叶片表现出较大的桑丁香假单胞菌种群生长密度，这与桑疫病发生过程中丁香假单胞菌分泌冠菌素来调控植物叶片气孔的侵染途径和方式有关。该结果为桑疫病爆发期间从桑树叶片组织中分离高产冠菌素的野生型丁香假单胞菌株找到了事实依据。2）水系丰富的桑园是筛选到高产冠菌素野生菌株最有潜力的目标源。以REP通用引物构建重复序列PCR技术，对本课题组菌种库中江浙一带筛选的产冠菌素野生菌株进行聚类分析和分型研究。结果表明，在相似系数为0.65时可将29株菌株分成5个类群，其中来自浙江淳安的桑树组织中假单胞菌类群的多样性程度高，可能与该地区水源充足的气候条件有关，由此推测出野生菌株多样性与地区水分条件可能具有一定的相关性，为后期筛选产冠菌素的桑丁香假单胞野生菌株提供了新思路。3）常压室温等离子体诱变技术获得高产稳产冠菌素的突变体菌株。对野生型出发菌株的冠菌素产能进行分析，发现在即使高温（32℃）下也能产冠菌素，但产量不稳定，且产冠菌素特性退化明显。采用常压室温等离子体诱变技术对出发菌株进行诱变，采取通用培养基培养。结果表明，冠菌素产量提高了5%；突变株经过10代传代培养后，冠菌素产量仍维持在稳定状态，变化幅度控制在2.24%之内，表现出工业化生产菌株的稳产特性。因此，常压室温等离子体诱变技术在保持出发菌株高产性质前提下有效地提高了菌株产量的稳定性，为冠菌素的工业化生产菌株的高效选育提供了一种新颖、有效的新技术。本文首次对生态型桑园微生态系统中桑丁香假单胞菌进行定量筛选，并将常压室温等离子体诱变技术应用于桑丁香假单胞菌的诱变，并对冠菌素产量提高机理进行了探讨，对冠菌素高产稳产关键技术进行了研究，对于工业化高产冠菌素菌株筛选和桑疫病监测预防具有重要的现实意义。
王晓飞[10]2011年在《冠菌素高产菌种选育的初步研究》文中提出冠菌素(coronatine,简称COR)是20世纪70年代末发现的一种由微生物产生的生物活性物质,该物质应用时不会对环境造成污染,在农业生产上有广阔的应用前景。由于目前COR的产品只在实验室条件下极少量合成,使对其生理功能的研究和应用受到很大的限制,目前制约COR产业化的重要因素之一是缺少高产的优良菌株,因此有必要进一步采用诱变等育种手段,选育COR高产菌株来提高COR产量,以期COR的生物合成尽早进入工业化生产阶段。本论文从实验室已有菌种中自然分离出优良的出发菌株,建立抗药性致死突变模型,以原生质体融合和平阳霉素诱变为育种手段,对COR产生菌进行融合和诱变处理,最终得2株COR高产菌株：即原生质体融合菌株S1893和平阳霉素突变株PWLⅢ-12。其主要研究内容和结果如下：首先,采用稀释平板自然分离法,对现有菌株BCC 933、189、T1828进行自然分离,经摇瓶发酵和高效液相色谱法(HPLC)检测各菌株产COR单位,根据叁株菌产素频率分布情况,选择菌株189为供试菌株,进行摇瓶复筛,根据COR产量和性能稳定性,筛选出菌株189-20作为后续育种试验的出发菌株。采用最小浓度抑制法测定出发菌株189-20的敏感抗生素为卡那霉素,致死浓度为6μg/mL,建立了抗药性致死突变标记筛选模型。其次,以出发菌株189-20(带有6μg/mL卡那霉素抗性标记)和谷氨酸缺陷性菌株A4.6.727(G1u-)为出发菌株,采用抗药性标记和营养缺陷型标记筛选目的菌株,经过溶菌酶的去壁处理和促融剂PEG的作用,最终成功筛选到一株遗传性能稳定的融合子S1893,其COR产量为308.5μg/mL,能力相对于出发菌株分别提高184.1%和519.0%,说明该筛选模型的科学性和可行性。再次,采用新型诱变剂平阳霉素为诱变剂,通过单因素实验确定平阳霉素对于本实验出发菌株的最佳诱变剂量为浓度1.0mg/mL,处理时间6h,此时菌体存活率为70.5%,致死率即为29.5%,突变率达24.5%。经过多轮诱变试验,最终成功选育到高产突变株PWLⅢ-12, COR摇瓶发酵单位由107.0μg/mL最终提高到333.4μg/mL,产量提高了211.6%,遗传稳定性试验证明菌株PWLⅢ-12为遗传性能良好的COR产生菌。最后,对平阳霉素诱变高产突变株的生物学特性进行研究,考察诱变剂对于冠菌素生成菌株生物特性的影响。
参考文献：
[1]. 冠菌素生物合成的研究进展[J]. 梁垚, 王俊, 陈明胜, 张生杰, 潘飞. 现代化工. 2011
[2]. P. syringae pv. glycinea M-18生产冠菌素补料发酵工艺优化研究[J]. 张博, 吴晓丽, 吴慧玲. 中国农业科学. 2010
[3]. 冠菌素的发酵研究[D]. 张国栋. 中国农业大学. 2003
[4]. 桑疫病的分子检测及其病原菌发酵生产冠菌素的研究[D]. 梁垚. 江苏科技大学. 2012
[5]. 丁香假单胞菌Z2-6半连续发酵生产冠菌素的研究[J]. 于莎, 姜峰, 安冬捷, 谭伟明, 李召虎. 农业生物技术学报. 2017
[6]. Tn5转座诱变选育冠菌素耐高温生产菌株及其发酵条件研究[J]. 吴慧玲, 焦睿, 章家长, 李召虎. 中国农业科技导报. 2009
[7]. 冠菌素产生菌筛选及工程菌构建[D]. 王春燕. 中国农业大学. 2017
[8]. 生物合成冠菌素的桑丁香假单孢菌发酵条件[J]. 张生杰, 梁垚, 潘飞, 吕荣宾, 王俊. 现代化工. 2011
[9]. 桑丁香假单胞菌稳产冠菌素关键技术的研究[D]. 李刚. 江苏科技大学. 2014
[10]. 冠菌素高产菌种选育的初步研究[D]. 王晓飞. 江西农业大学. 2011