本工作将单增李斯特菌最重要的毒力因子-编码溶血素的hlyA基因，与李斯特菌属16sRNA基因同时作为单增李斯特菌的检测指标，将双重PCR方法与选择性增菌法相结合，旨在建立一种快速灵敏检测单增李斯特菌的双重PCR方法。1 材料与方法1.1 材料1.1.1菌种单增李斯特菌标准株由省疾病预防控制中心提供；大肠杆菌（Escherichia coil）、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、产气杆菌(Aerobacter aerogenes)和伤寒杆菌(Salmonella typhi)为本实验室保存菌株。1.1.2试剂李斯特氏菌显色培养基、单增李斯特菌成套生化鉴定管、胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA-YE）、李氏增菌肉汤LB1、萘啶酮酸、吖啶黄素青岛高科园海博生物有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA Marker、溶菌酶、蛋白酶K、RNaseA以及PCR相关试剂北京天根生化有限公司。 1.1.3引物序列根据文献[1]以单增李斯特菌hlyA基因和李斯特菌属的16sRNA基因作为靶基因分别合成两对特异性引物，所用引物序列见表一，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。表一 目的基因及引物序列Table1 Target genes and corresponding primer sequences 特异基因 序列（5’→3’） 扩增片段 hlyA基因 上游引物（hlyA 1）：5’-CCTAAGACGCCAATCGAA-3’ 下游引物（hlyA 2）：5’-AAGCGCTTGCAACTGCTC-3’ 702bp 16sRNA基因 上游引物（U1）：5’-CTCCATAAAGGTGACCCT-3’ 下游引物（U2)：5’-CAGCAGCCGCGGTAATTC-3’ 938bp 注：其中引物对U1、U2及引物对hlyA 1、hlyA 2以下分别简称为引物1和引物2。1.1.4仪器VersaDoc凝胶成像仪 美国伯乐；PCR扩增仪 美国伯乐；JM-250电泳仪 大连捷迈科贸有限公司；D-37520高速冷冻离心机 德国Thermo公司。1.2 方法1.2.1细菌的活化培养取-80℃、25%甘油冻存的菌种，复苏培养后，分别划线于细菌培养基上，37℃培养24h，连续活化两次，将单菌落接种于普通肉汤培养基中，37℃振荡培养18h。 1.2.2细菌基因组DNA的制备取1ml菌液按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书步骤进行DNA提取，并溶于100 μL TE缓冲液中，于-20℃下保存。1.2.3双重PCR的体系建立及优化双重PCR扩增体系：10×Buffer（Mg2+）5µL 、dNTPs（2.5mmol/L）4µL、两对10mmol/L的上下游引物各1µL、 DNA模板5µL，Taq酶（2.5U/µL）0.8µL ，用ddH2O补足至50µL。双重PCR反应条件：采用热启动。95℃预变性3min ，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸80s，共30个循环，72℃终延伸10min。在上述反应体系和条件下，对退火温度进行优化，分别设定退火温度为：55℃、55.8℃、57.1℃、58.9℃、61.4℃、63.3℃，通过对电泳结果的分析，最终确定最佳退火温度。1.2.4双重PCR特异性及灵敏度检测特异性检测：分别提取单增李斯特标准株、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、产气杆菌及伤寒杆菌模板DNA，在最佳双重PCR体系及条件下扩增，检测引物特异性。灵敏度检测：将过夜培养的单增李斯特菌菌液用无菌的生理盐水10倍梯度稀释，使目标菌浓度依次为：106CFU/mL 、105CFU/mL 、104CFU/mL 、103CFU/mL 、102CFU/mL 、10CFU/mL。分别提取不同浓度菌液的模板DNA，在最佳双重PCR体系及条件下扩增，确定双重PCR的检测灵敏度。1.2.5人工污染海螺样品的制备及检出限检测无菌操作取一只海螺的软组织及体液（阴性）共12.5g，加入李氏增菌肉汤LB1（含抑菌剂）中，充分摇匀制成均质液，用无菌生理盐水10倍梯度稀释初始浓度为106CFU/mL的单增李斯特菌菌液，取1mL不同稀释度的菌液分别加入待检试样的均质液中，30℃震荡培养24h，分别取1mL增菌液按照方法1.2.2提取模板DNA，进行双重PCR检测，确定人工污染海螺样品的最低检出限。2 结果与分析2.1 不同退火温度下双重PCR扩增结果 对双重PCR的退火温度进行优化（图一），结果可见两条带在一定温度范围内均能有效扩增， 702bp 条带在相同退火温度下的扩增效果均较938bp条带明显，其中在退火温度为55.8℃和58.9℃时，两特异条带同时扩增清晰，考虑到降低退火温度可以提高扩增效率，最终选定55.8℃为最佳退火温度，从而确定双重PCR最佳反应条件。
M：DL2000；1：阴性对照；2：55℃；3：55.8℃；4：57.1℃；5：58.9℃；6：61.4℃；7：63.3℃图一 不同退火温度下的双重PCR扩增结果Fig.1 Duplex PCR detection at different annealing temperatures2.2 特异性及灵敏度检测结果在双重PCR最佳反应体系及条件下，应用引物1及引物2对不同细菌的模板DNA进行双重PCR扩增。特异性检测结果（图二）显示：只有单增李斯特菌标准株可扩增出938bp和702bp二条带，而其他6株致病菌除引物二聚体外均未出现任何扩增条带，该双重PCR特异性良好。将初始浓度分别为106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、10CFU/mL的单增李斯特菌菌液的DNA作为双重PCR反应模板，确定双重PCR检测纯菌液的灵敏度，由图三可知：两特异条带同时检出的最低菌液浓度为102CFU/mL，其灵敏度能够满足样品选择性增菌后的检测要求。
Fig.2 Specificity of the Duplex PCR primersM：DL2000；1：106CFU/mL；2：105CFU/mL；3：104CFU/mL；4：103 CFU/mL；5：102CFU/mL；6：10CFU/mL图三 双重PCR灵敏度检测结果Fig.3 Test for the sensitivity of the Duplex PCR2.3人工污染海螺样品的检出限单增李斯特菌菌液初始浓度为106CFU/mL，取不同稀释浓度菌液1mL，污染12.5g海螺阴性样品，30℃ LB1震荡培养24h，分别提取增菌液DNA进行双重PCR检测，检测结果如图四所示，当浓度为102CFU/mL的菌液污染海螺样模板品仍可检出，经计算，此双重PCR检测模拟污染海螺样品检出限为8CFU/g。
M：DL2000；1：稀释度10-1；2：稀释度10-2；3：稀释度10-3；4：稀释度10-4；5：稀释度10-5图四 模拟样品双重PCR检测结果Fig.3The Duplex PCR of simulative samples3 结论本工作所采用的检测水产品中单增李斯特菌的双重PCR快速方法，菌液灵敏度为102CFU/mL，模拟污染海螺样品检出限为8CFU/g，全程检测时间包括增菌时间在内仅27小时，与国标方法相比省时省力且经济，可快速检测出实际样品中的阳性样品与疑似阳性样品，可作为海螺样品中单增李斯特菌的初步鉴定方法。参考文献[1]王海艳,刘中学,等.食品中单增李斯特菌PCR检测方法所用引物的特异性比较[J].检验检疫科学,2007(6):3-8.(J)
论文作者:王昊宇
论文发表刊物:《中国保健营养》2019年第1期
论文发表时间:2019/6/4
标签：李斯特论文; 引物论文; 样品论文; 海螺论文; 基因论文; 特异性论文; 杆菌论文; 《中国保健营养》2019年第1期论文;