（云南省第二人民医院 云南 昆明 650021）
【摘 要】目的：观察糖尿病SD大鼠在12、16、20、24周病程中，肾脏早期损伤指标变化、VEGF和mTOR基因表达及与肾脏损伤间的关系。方法：雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，链脲佐菌素（STZ）造模，糖尿病（DM）成模后第12、16、20、24周，选取DM组分别为7、6、6、9只和NDM组各5只，测定晨尿白蛋白/肌酐比值(UACR)；肾脏肥大指数(KW/BW)；光学显微镜下观察肾小球及肾小管病理改变程度半定量评分(HS)；电子显微镜下测定GBM厚度；免疫组化(IHC)测定VEGF、VEGFR2、mTOR抗体在左肾中半定量评分基因蛋白的表达；实时定量PCR（RT-Q-PCR）荧光染料法检测VEGF、VEGFR2、mTOR基因在右肾中mRNA表达，用标准化后基因的标化值(SCt)半定量PCR产物。结果：UACR在DM组高于NDM组；KW/BW比值、光镜下HS在总的DM组及各病程DM组均高于同期NDM组，20、24周DM组较12周明显升高，P<0.01，KW/BW比值与光镜下HS在总的DM组正相关；GBM厚度在总的DM组明显高于NDM组，与UACR在总的DM组及24周DM组正相关。VEGF、VEGFR2基因IHC半定量评分在总的DM组及各病程DM组均高于NDM组，二者在总的DM组中正相关，均与光镜下HS正相关，P值均<0.05。VEGF、VEGFR2基因SCt值在总的DM组均明显高于NDM组，VEGF基因SCt值在DM组间12周表达最高，24周次之，较16、20周明显升高，P<0.01；VEGFR2基因SCt值在DM组间随病程延长逐渐降低，24周最低。VEGF基因SCt值与VEGFR2基因SCt值在总的DM组明显正相关，P<0.01，与GBM厚度在总的DM组正相关。mTOR基因IHC半定量评分及SCt值在总的DM组及各病程DM组与NDM组比较，统计学均未见明显差异，但mTOR基因与VEGF、VEGFR2基因三者的IHC半定量评分在总的DM组中均互相正相关，均与光镜下HS正相关，P值均<0.05。结论：UACR、KW /BW 比值、光镜下HS及GBM厚度在糖尿病SD大鼠中升高，反应肾脏损伤，其中24w病程变化更显著，KW/BW 比值与光镜下HS正相关，GBM厚度与UACR正相关。VEGF、VEGFR2基因蛋白及mRNA在DM SD大鼠中肾脏中表达，且随着DM病程增长表达协同增高；VEGFmRNA表达与DN GBM厚度正相关；mTOR基因蛋白表达可能与VEGF、VEGFR2基因在糖尿病SD大鼠DN有协同相关作用，但不排外不同病程、不同动物样本量表达结果及实验条件可能存在结果差异。
【关键词】糖尿病SD大鼠；肾脏损伤；VEGF与mTOR基因间关系
【中图分类号】R725 【文献标识码】A 【文章编号】1004-6194（2015）02-0166-03
Evaluation study in diabetic rats of the relationship between VEGF and mTOR gene on nephropathy indicators
TAO Wen-yu Li Yi-ping
Department of Endocrinology The Second Hospital of Yunnan Province Kunming 650021, China
【Abstract】Objective：To study the relationship between VEGF and mTOR gene on nephropathy indicators in diabetic rats. Methods：Forty-eight male Sprague- Dawley（SD）rats were divided into diabetes mellitus group(DM=28 ) and control group(NDM=20 ). Diabetic models were produced by injection of streptozotocin. In the course of 12,16,20,24 week, nephropathy indicators including fasting urinary albumin and creatinine ratio(UACR)，renal hypertrophy index(kidney and body weight ration, KW/BW)，the histology scores(HS) and the glomerular basement membrane(GBM) thickness were collected. The protein and mRNA expression of the gene of VEGF, VEGFR2, mTOR were observed by Immunohistochemical(IHC) and real-time quantitative polymerase chain reaction（RT-Q-PCR）by SYBR Green. And the Standardized Cycle of threshold（SCt）was regarded as the indicators of the mRNA expression. Results：UACR was higher in DM rats than those of NDM rats. KW/BW and HS were higher in DM rats than those of NDM rats, especially high in DM rats of the course of 20,24w(P<0.01). KW/BW was positive correlation to HS in total DM rats. The thickness of GBM was higher in total DM rats and was positive correlation to the UACR in total DM rats and the course of 24w in DM rats. The IHC scores of the gene of VEGF, VEGFR2 were higher in total DM rats and were positive correlation each other, were positive correlation to the HS in total DM rats (P<0.05). The SCt of the gene of VEGF, VEGFR2 were significantly high in total DM rats and was positive correlation each other in total DM rats (P<0.01). The SCt of VEGF was positive correlation to the thickness of GBM in total DM rats. The SCt of VEGF was highest in the course of 12w DM rats. The SCt of VEGFR2 gradually decreased following by the diabetic course. The IHC scores and SCt of mTOR were not significantly difference in DM rats than those of NDM rats. But the IHC scores of the gene of mTOR, VEGF, VEGFR2 were positive correlation each other, were positive correlation to the HS in total DM rats (P<0.05). Conclusion：UACR， KW/BW， HS and the thickness of GBM were high in diabetic SD rats, especially in the diabetic course of 24w, which can reflect the injury of nephropathy. In DM rats, KW/BW was positive correlation to the HS, the thickness of GBM was positive correlation to the UACR. The protein and mRNA of the gene of VEGF, VEGFR2 were high expressed in DN of the DM rats and increased followed by the increasing of diabetic course. The mRNA expression of the gene of VEGF was positive correlation to the thickness of GBM in DN. The protein expression of the gene of mTOR, VEGF, VEGFR2 might collaborative making in DN in DM rats. But the resuls could be distinguished to the other diabetic course, sample size, experimental error.
【Key words】diabetic SD rats; nephropathy indicators; relationship between VEGF and mTOR gene
糖尿病肾病( diabetic nephropathy, DN)是引起终末期肾病的主要原因，也是糖尿病（Diabetes mellitus, DM）患者逐渐增加的死亡终点之一。多种因子包括血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）及其主要效应的靶受体之一VEGFR2（Vascular endothelial growth factor receptor 2）与DN的发生发展机制近几年正在被了解。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammals Target of Rapamycin mTOR），是一种细胞质激酶，调节细胞生长代谢及细胞对促细胞有丝分裂物（如胰岛素样生长因子IGF-I、血管内皮生长因子）、营养物（氨基酸、葡萄糖、脂肪酸）、激素（包括胰岛素、细胞因子）等的应答【1-3】。营养相关的mTOR途径是新生组织生长发育的基础，代谢综合征和衰老的基质增加了癌症风险【4-6】，故mTOR近年来主要在肿瘤相关疾病研究中备受关注。DM属于一常见的代谢综合征，mTOR与DM并发症之间的关系研究报道不多，故本课题设计观察糖尿病SD大鼠在12、16、20、24周病程中，肾脏早期损伤指标变化、VEGF和mTOR基因表达及与肾脏损伤间的关系。
1 资料与方法
1.1 糖尿病模型的建立 昆明医科大学实验动物中心提供雄性约6周龄的Sprague-Dawley（SD）大鼠，共60只，体重（335.83±27.65）g，清洁级，实验专员正常鼠料及垫料饲养8周后，进行糖尿病大鼠造模，予链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美国Sigma 公司）20-60mg/kg溶于柠檬酸缓冲液（上海国药集团化学试剂有限公司）（PH4.4，0.1%）专人一次性腹腔注射，注药后5天、8天、13天监测尾静脉晨间微量血糖（美国强生稳豪血糖仪及血糖试纸），未造模成功者补打STZ，直到血糖均达到造模成功标准（均>16.7mmol/L）。
1.2 实验资料收集及检测 分别在DM成模后12、16、20、24周，每阶段随机抽取DM组分别为7、6、6、9只和同期非糖尿病组对照（NDM)各5只，处死前用标准动物实验代谢笼收集晨尿送检，测定尿白蛋白/肌酐比值(urinary albumin and creatinine ratio，UACR)，（离心3千转5分钟，提取上清液，日立7600全自动生化分析仪，免疫放射比浊法测定）。
1.3 肾脏标本制作 处死标本解剖后由同一位实验员立即摘取双肾，分别记录左、右肾质量，计算肾脏肥大指数（renal hypertrophy index）即双侧肾脏质量之和/体质量(kidney and body weight ration, KW/BW)；统一取每只大鼠的左肾，用10%中性缓冲甲醛固定，送病理科由固定专业人员取材后进行脱水、透明、浸蜡、包埋，制作切片厚度3-4um，光学显微镜（日本奥林巴斯BX50，x100，x200）下由专业人员HE染色观察肾小球及肾小管形态，每只肾脏标本至少3张切片置于显微镜下观察,每张切片随机计数5个不同视野的肾小球和肾小管，以肾小球、肾小管改变的明显程度, -为无明显异常、+为<25%、++为25%-50%、+++为50%-75%、++++为>75%，取其平均值，进行光镜下病理改变(histology scores，HS)半定量评分；每只肾脏标本至少取3块组织在电子显微镜(美国FEI，Quanta 200，x20000)下测定肾小球基底膜（the glomerular basement membrane，GBM)厚度，取平均数值；脱蜡、水化，根据第一抗体（美国Thermo公司，摸索条件后适合稀释浓度为VEGF 1：100、VEGFR2 1：100、mTOR 1：800）的要求，对组织进行相应的抗原修复（柠檬酸修复PH6.0），采用免疫组化MaxVision 2/HRP染色，光学显微镜（x100，x200）观察每只切片随机计数5个不同视野的肾小球和肾小管，呈阳性反应的肾小球或肾小管细胞数占细胞总数的百分比,取其平均值，显色愈深代表阳性表达愈强,根据染色面积和强度按下列计数进行免疫组化(immunohistochemical，IHC)半定量评分,1=无染色或微弱染色面积<25%;2=染色面积在25%-50%之间;3=染色面积在50%-75%之间;4=染色面积>75%。
1.4 检测VEGF、VEGFR2、mTOR基因的mRNA表达 统一取每只大鼠的右肾加Trizol保存后，立即予液氮冻存标本，分批在我院分子实验中心由专业人员提取冻存管中的肾脏样本总RAN，采用实时定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-Q-PCR） 荧光染料（SYBR Green）方法，对目标基因VEGF 、VEGFR2、mTOR和ΒACTIN（引物由美国ABI公司软件Primer Express3.0设计，上海生工生物技术服务公司合成）半定量分析PCR产物表达，PCR结束后采用溶解曲线确定产物特异性（ 美国ABI 7300随机软件自动计算出每个样本的目标基因和管家基因ΒACTIN的Ct值(Cycle of threshold)，数据经处理后得到经ΒACTIN标准化后的基因的标化值(SCt)，该标化值反映样本中基因的真实表达情况。
1.5 统计学方法 用SPSS统计软件(19. 0版)进行处理, 计量资料以均数±标准差(x±s) 表示，组内比较用独立样本t检验，组间比较用单因素方差分析，ANOVA分析法。病理半定量评分采用秩和检验分析。相关性分析采用线性相关分析（Pearson/Spearman）法。P<0.05示差别有统计学意义，P<0.01差别有显著统计学意义。
2 结果
2.1 不同病程的SD大鼠肾脏损伤指标（见表1）
IHC半定量评分秩均值SCt
DM组与NDM组比较中：*P<0.05，**P<0.01。在第12周、16周、20周、24周DM组的组间比较中：与12w比较，ΟP<0.05，ΟΟP<0.01；与16w比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与20w比较，◇P<0.05，◇◇P<0.01。
2.2 镜下病理改变 光学显微镜下NDM组（见图1示）肾脏结构基本正常，DM组中（见图2示），肾小球部分肥大、瘀血，球袢结构不清，毛细血管腔变窄，基质增多，系膜增厚，系膜细胞增多，近曲小管水肿，有的可见局灶性炎性细胞分布，有的还可见小部分肾小球萎缩。电镜下DM组GBM不规则增厚，足细胞连续性中断、结构不清晰。免疫组化中肾小球及肾小管染色情况，正常细胞核呈蓝色（见图3示）,阳性反应细胞核呈棕褐色，VEGF及VEGFR-2的免疫复合物主要在肾小球毛细血管壁胞浆内见棕褐色颗粒沉积（见图4示），VEGF的免疫复合物有部分还在肾小管上皮细胞胞浆内见棕褐色颗粒沉积，mTOR的免疫复合物（见图5示）部分在近端肾小管上皮细胞胞浆内见棕褐色颗粒沉积，极少数见远端肾小管上皮细胞胞浆内棕褐色颗粒沉积。
图6 图7
2.4 各指标间相关性 肾脏肥大指数：与光镜下HS在总的DM组正相关，r=0.387，P=0.042；与GBM厚度12周DM组中明显正相关， r=0.955，p=0.003。GBM厚度：与UACR在总的DM组及24周DM组正相关，分别的r=0.420、0.753，P=0.026、0.019。VEGF基因IHC半定量评分与光镜下HS在总的DM组及16周DM组正相关，分别r=0.605、0.894，p=0.001、0.016。VEGFR2基因IHC半定量评分：与光镜下HS在总的DM组明显正相关，r=0.543，p=0.003，与VEGF基因IHC半定量评分在总的DM组及16、24周DM组均正相关，分别r=0.618、 0.853、 0.704，p=0.000、0.031、0.034。mTOR基因IHC半定量评分：与光镜下HS在总的DM组及16周DM组正相关，分别r=0.443、0.953，p=0.018、0.003；与VEGFR2基因IHC半定量评分在总的DM组及20周DM组正相关，分别r=0.502、0.876，p=0.006、0.022；与VEGF基因IHC半定量评分在总的DM组及16、24周DM组均正相关，分别r= 0.480、0.826、0.857，p=0.010、0.043、0.003。mTOR基因SCt值：与UACR在总的DM组负相关r= - 0.421，p=0.026；与GBM厚度16周DM组明显正相关r=0.963，p=0.002；与mTOR及VEGF基因IHC半定量评分均负相关，分别r= - 0.897、-0.732，p=0.001、0.025。VEGFR2基因SCt值：与VEGF基因SCt值在总的DM组明显正相关，r=0.511，p=0.005；与光镜下HS在总的DM组负相关r= - 0.466，p=0.012；与肾脏肥大指数在总的DM组明显负相关r= - 0.508，p=0.006，而在24周DM组正相关，r= 0.709，p=0.032。VEGF基因SCt值：与GBM厚度在总的DM组正相关，r=0.397，p=0.036。
3 讨论
中国调查社区糖尿病患者DN患病率高达63.3%【7】，但我国目前尚未统一DN的诊断【8】，尿蛋白升高和肾脏病理损伤改变多年来均被推荐为DN评估的主要指标【9】 。相比之下，UACR相对稳定，随机UACR与24小时尿蛋白有良好的相关性【10】，标本简便，只需检测随机时间点尿即可，故多推荐【11】UACR为临床糖尿病肾损伤的早期筛查及肾损伤程度的主要监测指标。本实验UACR在总的DM组及12、16、20、24周DM组均高于同期NDM组，其中12、24周DM组明显高于同期NDM组，但该实验不同病程DM组间比较未见统计学差异；有实验【12】DM大鼠病程4周KW /BW 比值显著升高，显微镜下即可见肾小球体积增大，基底膜增厚、胞膜基质多。本实验SD大鼠KW /BW 比值、光镜下HS在总的DM组及各病程DM组均明显高于同期NDM组，20、24周病程DM组较12周明显升高，而且KW /BW 比值与光镜下HS在总的DM组正相关；GBM厚度在总的DM组明显高于NDM组，DM组24周明显高于16及20周，而且与UACR在总的DM组及24周DM组成正相关。上述结果提示尿UACR、KW /BW 比值、光镜下HS及GBM厚度在糖尿病SD大鼠中升高，反应肾脏损伤，其中24周病程变化更显著。
自发现有促进血管内皮细胞生长的作用后，血管内皮生长因子正式被命名【13】。有报道【14】转基因小鼠模型中，VEGF表达上调引起蛋白尿、肾小球肥大，并证实了DN中VEGFR2在肾脏足细胞中表达，其与肾素间的相互作用及VEGF作用诱导了体内蛋白质的磷酸化。当VEGFR2与VEGF特异性结合后，刺激磷酸化肌球蛋白轻链激酶，导致肌球蛋白细胞骨架重构，内皮细胞间孔隙加大，大分子物质通透增加。这些正是DN血管系统和肾小球病理生理早期改变的角色之一。该实验VEGF、VEGFR2基因IHC半定量评分在总的DM组均明显高于NDM组，其中VEGF基因IHC半定量评分在12、20、24周DM组明显高于NDM组，P<0.01，16周DM组高于NDM组，DM组间20周高于12周，P<0.05；VEGFR2基因IHC半定量评分16周、24周DM组高于NDM组，分别P<0.05及0.01，DM组间20周高于12周，P<0.05。VEGF与VEGFR2基因IHC半定量评分在总的DM组中明显正相关，均与光镜下HS明显正相关，P均<0.01。以上提示VEGF、VEGFR2基因蛋白在DM SD大鼠中肾脏中表达，且随着DM病程增长表达协同增高。
发生在糖尿病进程中的高血糖、胰岛素抵抗、高血压、血脂紊乱、中心性肥胖和一氧化氮（NO）合成受损等因素影响了血管中的血流及引起组织缺氧。有实验利用小鼠模型观察了NO缺乏在VEGFR2介导的内皮细胞增殖反应【15】，结果表明VEGFR2信号增强能够诱导异常的血管再生，进一步证实了内皮一氧化氮合成酶（eNOS）在糖尿病肾脏中缺乏。缺氧是诱导血管再生和许多基因(如VEGF和 VEGFR2)表达的信号，由于它们表达的增加，继而产生糖尿病并发症的进展【16】，如文献提示VEGF和 VEGFR2的表达明显增加了糖尿病肾病和视网膜病变的病理生理进程【17，18】。该实验VEGF、VEGFR2基因SCt值在总的DM组均明显高于NDM组，VEGF基因SCt值在12、16、20、24周DM组均明显高于NDM组，P<0.01，尤其DM组间12周表达最高，24周次之，较16、20周明显升高，P<0.01；VEGFR2基因SCt值在12、16、20周DM组均明显高于NDM组，P<0.01，DM组间SCt值随病程延长逐渐降低，24周最低。VEGF基因SCt值与VEGFR2基因SCt值在总的DM组明显正相关，P<0.01，与GBM厚度在总的DM组正相关。以上说明VEGF基因、VEGFR2基因mRNA在DM SD大鼠肾脏中协同表达，VEGFmRNA表达与DN GBM增殖病变正相关。
VEGF刺激血管形成，引起血-视网膜屏障损伤，有研究胰岛素/mTOR途径刺激了视网膜色素上皮细胞 VEGF的合成【19】。在研究mTOR途径抑制DN进展的药物干预实验中，有数据显示DM组大鼠mTOR蛋白在肾小球水平较正常对照组增加12%（p<0.05）【20】，说明mTOR蛋白可能参与DN的发病过程。该实验mTOR基因IHC半定量评分及SCt值在总的DM组及各病程DM组与NDM组比较，统计学均未见明显差异；mTOR基因SCt值：与UACR在总的DM组负相关，与mTOR及VEGF基因IHC半定量评分均负相关，p<0.05。但mTOR基因与VEGF、VEGFR2基因三者的IHC半定量评分在总的DM组中均互相正相关，均与光镜下HS正相关，P值均<0.05，说明mTOR基因蛋白表达也可能与VEGF、VEGFR2基因在糖尿病SD大鼠DN有协同相关作用，亦不排外不同病程、不同动物样本量表达结果及实验条件可能存在结果差异。
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基金项目：
云南省应用基础研究基金资助项目（2013FZ193）
论文作者:陶文玉,李奕平,熊煜欣,陈郊丽,杨莹,谢余澄,冯
论文发表刊物:《中国慢性病预防与控制》2015年8月第2期供稿
论文发表时间:2016/3/21
标签：基因论文; 肾脏论文; 定量论文; 病程论文; 高于论文; 肾小球论文; 评分论文; 《中国慢性病预防与控制》2015年8月第2期供稿论文;