罗磊[1]2012年在《L-异亮氨酸产菌株的选育及苏氨酸脱水酶编码基因的克隆与表达》文中研究指明L-异亮氨酸(L-Isoleucine, Ile)是人体8种必需氨基酸之一,与L-亮氨酸、L-缬氨酸统称为分支链氨基酸,因有特殊的结构和功能,在人体生命代谢中具有重要的地位。本研究采用诱变育种及基因克隆手段对一株黄色短杆菌Bf420进行改造,以望获得能进行工业化生产的L-异亮氨酸高产菌株。主要内容及成果如下：1、应用纸层析法、纸层析—色斑洗脱比色法和高效液相色谱-邻苯二甲醛法(HPLC-OPA)对发酵液中L-异亮氨酸进行了定性、定量分析研究,确立了L-异亮氨酸定性定量测定的方法、条件以及计算方法。采用纸层析法对发酵液进行测定,通过比较不同氨基酸色斑的Rf值,并与标准样比较,可以快速、方便的定性测量L-异亮氨酸。以HPLC-OPA法与纸层析—色斑洗脱比色法定量测定结果对比,HPLC-OPA法测定结果更为准确。但纸层析—色斑洗脱比色法更加切合实际而且较为简单快速的方法。2、以黄色短杆菌Bf420为出发菌株,经紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)复合诱变,并采用α-氨基丁酸(α-AB)作为抗性药物,通过摇瓶初筛和复筛、单菌落纯化以及连续传代测定,最终选育一株带多遗传标记的遗传性状稳定的L-异亮氨酸高产菌BM2610(Met-+α-ABr),在未优化的条件下摇瓶发酵96h,平均可积累L-异亮氨酸7.12g/L,比出发菌株提高了122.5%。经验证,该菌株遗传稳定性良好。3、进一步对BM2610突变株进行分子改造。利用PCR技术从E.coli JM109中扩增出L-异亮氨酸代谢途径中的关键酶——苏氨酸脱水酶的编码基因ilvA,将其与表达载体pET-28a连接,通过电转化方法,将重组质粒pET-28a-ilvA转入黄色短杆菌BM2610中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得了高效表达。对含质粒的菌体胞内粗酶液经SDS-PAGE检测到大小约为4.6KDa的重组融合蛋白,酶活分析表明,苏氨酸脱水酶的活性比对照组提高了36%。
魏春[2]2002年在《L-异亮氨酸产生菌的选育及其发酵条件的研究》文中研究表明本文以代谢控制发酵理论为指导，重点研究了L-异亮氨酸产生菌的选育及其发酵条件。主要研究内容和结果如下： (1)建立了发酵液中L-异亮氨酸定量测定的“纸层析-色斑洗脱比色法”，并对该方法的应用条件进行了研究。 (2)以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)TL411为出发菌株，经硫酸二乙酯(DES)和紫外线(UV)诱变处理，定向选育出一株L-异亮氨酸生产菌株WYJ1(Met~-+AEC~r+α-AB~r)，在未经优化条件下摇瓶分批发酵96h，可产L-异亮氨酸8.2g/L。 (3)研究了菌株WYJ1的摇瓶分批发酵条件。应用均匀设计和MATLAB软件获得该菌株优化的种子培养基和发酵培养基配比，并对种子培养条件和发酵培养条件进行了研究。在优化条件下，菌株WYJ1摇瓶分批发酵96 h，可产L-异亮氨酸16.7g/L。 (4)利用5L罐分批发酵数据，对发酵过程进行了代谢流分析。基于物流平衡原理，初步建立了发酵过程的代谢流分析方法；结合发酵过程曲线，分析了L-异亮氨酸发酵全程代谢行为；应用菌株WYJ1的代谢流量平衡模型计算出了L-异亮氨酸发酵中后期的代谢流分布并通过MATLAB线性规划得到理想代谢流分布以及各种极端情况的代谢流分布。结果表明：还原力NADPH的大量生成对高产L-异亮氨酸有利，具有适宜的PPC/PDC活力比、从遗传改造和发酵控制方面减少副产氨基酸的生成、摸索最适的溶氧控制对提高L-异亮氨酸的产率至关重要。 本文选育获得的突变株WYJ1在5L罐上可产L-异亮氨酸18.3g/L，遗传性状稳定，具备生产潜力。代谢流分析方法(MFA)在L-异亮氨酸5L罐分批发酵过程分析上的应用，有助于进一步开发该菌株及优化L-异亮氨酸的生物合成代谢流。
王菲[3]2004年在《L-异亮氨酸产生菌的融合育种选育及其关键酶与发酵条件的研究》文中认为本论文根据代谢控制发酵理论，研究了L-异亮氨酸生产菌的选育及其发酵条件。主要研究内容和结果如下： (1)建立了发酵液中L-异亮氨酸定量测定的偏最小二乘分光光度法，并对该方法的应用条件进行了研究。以高速氨基酸分析仪测定结果为参比，用偏最小二乘分光光度法测定结果的准确度比纸层析—色斑洗脱比色法高，且方法较简便。 (2)确定了亲株ISW330和AS1.495原生质体形成和再生及进行原生质体融合的最佳条件，采用原生质体融合技术最终筛选出一株带有目的遗传标记的L-异亮氨酸高产菌SW0370(Leu~-+Met~-+AEC~r+á-AB~r)。该菌株在未优化条件下可产L-异亮氨酸14.27g／L。经验证，菌株SW0370的遗传性能稳定。 (3)初步研究了菌株SW0370发酵过程中关键酶苏氨酸脱氨酶的提取、测定方法与调节性质。在得到的酶活测定与提取方法的最佳条件的基础上，分别考察了不同L-异亮氨酸浓度和不同氨基酸对酶活力的影响。 (4)研究了菌株SW0370的摇瓶分批发酵条件。应用二次回归正交旋转组合设计获得该菌株优化的发酵培养基配比，并对分批发酵和补料分批发酵培养条件进行了研究。在优化条件下，菌株SW0370摇瓶补料分批发酵96h，可产L-异亮氨酸21.96g／L。 本论文在L-异亮氨酸代谢控制发酵研究领域的创新之处在于，成功地利用原生质体融合技术选育出一株带有双缺标记的L-异亮氨酸高产菌SW0370，并研究了菌株SW0370发酵过程中关键酶苏氨酸脱氨酶的酶活测定与纯化方法和反馈调节性质。对以后继续进行L-异亮氨酸的育种工作有指导性意义。菌株SW0370，采用补料分批发酵工艺，在摇瓶上发酵96h可产L-异亮氨酸21.96g／L，具备了在发酵罐上生产的潜力，达到国内先进水平。
张灿丽[4]2006年在《高产L-异亮氨酸菌种的选育及其发酵条件研究》文中研究表明本论文根据代谢控制发酵和代谢流分析理论,研究了高产菌L-异亮氨酸选育及其发酵条件。主要研究内容和结果如下:应用“薄层层析法”“HPLC”对发酵液中L-异亮氨酸进行了定量分析研究,确立了L-异亮氨酸定量测定条件和计算方法。采用“HPLC-UV法”、“HPLC-OPA法”以及高速氨基酸分析仪进行了L-异亮氨酸含量的测定对比,OPA法测定结果的准确度比UV法更高。应用HPLC法测定L-异亮氨酸是一种比较方便而且较为准确的方法。以黄色短杆菌T6-13为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)和紫外线诱变处理,摇管初筛、摇瓶复筛、遗传标记验证、单菌落分离和连续传代,筛选出一株L-异亮氨酸生产菌株AJS406(Met-+α-ABr)。该菌株在未经优化的条件下可积累L-异亮氨酸9.2g/L。确定了亲株AJS406和F9114原生质体形成和再生及进行原生质体融合的最佳条件,采用原生质体融合技术最终筛选出一株带有目的遗传标记的L-异亮氨酸高产菌IA412 (Leu-+Met-+α-ABr)。该菌株在未优化条件下可产L-异亮氨酸14.3g/L。经验证,菌株IA412的遗传性能稳定。研究了菌株IA412的摇瓶分批发酵条件。应用均匀设计和MATLAB软件获得该菌株优化的种子培养基和发酵培养基配比,并对种子培养条件和发酵培养条件进行了研究。在优化条件下,菌株IA412摇瓶分批发酵96 h,可产L-异亮氨酸20.7g/L。以摇瓶分批发酵最优条件为依据,进行200吨发酵罐分批发酵放大试验,确定了最佳分批发酵工艺,6批次的L-异亮氨酸糖酸转化率23.2 g/L,糖酸转化率为14.6%。
宋文军, 陈宁, 魏春, 刘淑云, 张克旭[5]2003年在《L-异亮氨酸产生菌的选育及其发酵条件优化》文中认为根据代谢控制发酵原理 ,经硫酸二乙酯诱变处理 ,定向选育出具有Met-+Ethr+α ABr+AECr 遗传标记的目的突变株ISW330。采用均匀设计法考查了发酵培养基中几种主要成分对L 异亮氨酸发酵的影响 ,通过MATLAB软件获得最佳发酵培养基配比 ,并对该目的突变株的摇瓶发酵条件进行了研究。在最佳条件下该菌株可产L 异亮氨酸 2 0 2 g/L。
陈婷婷[6]2016年在《产L-异亮氨酸突变株的生化特性鉴定及发酵条件研究》文中研究说明高产菌株的选育是微生物发酵的关键。本课题组前期通过全局转录机器工程技术构建了容量约为104大小的黄色短杆菌RNA聚合酶sigA基因突变文库。从突变库中筛选出19株突变菌株,其摇瓶L-异亮氨酸产量比出发菌株高。为更好地利用这些菌株,本论文对这19株突变菌株的生化特性及其发酵条件进行研究,主要研究内容和结果：1、对19株突变菌株的生化特性进行鉴定,采用生长谱法对突变菌株进行了鉴定、分析。结果表明在19株突变菌株中有12株是赖氨酝营养缺陷型菌株,4株是赖氨酸渗漏缺陷型菌株,1株是蛋氨酸营养缺陷型菌株,2.若不是营养缺陷型菌株。2、从中选择生长状况较好的赖氨酸缺陷型突变菌株21-28进一步进行发酵条件研究。遗传稳定性试验表明突变菌株21-28连续传代五次,仍保(?)其遗传标记且L-异亮氨酸产量稳定。通过研究不同种子培养基对菌体生物量和发配产酸的影响,得到最适的种子培养基。结合单因素实验和响应面分析法对突变菌株.-28发酵培养基的成分及发酵条件进行研究。在最优条件进行发酵产酸实验,96h产品量为9.19g·L-1。比未优化时产酸量(5.12 g·L-1),提高了79.49%。以上结果为该菌株菌扩大培养奠定了基础。
徐国栋[7]2015年在《L-异亮氨酸生产菌株的构建及发酵条件优化》文中研究说明L-异亮氨酸是八种必需氨基酸之一,在人体代谢中具有重要作用。在L-异亮氨酸的合成过程中,乙酰羟基酸合成酶催化丙酮酸和前体α-酮基丁酸生成L-异亮氨酸。由于乙酰羟基酸合成酶对α-酮基丁酸亲和性高于丙酮酸,当胞内α-酮基丁酸供应量增加时,乙酰羟基酸合成酶可优先催化生成L-异亮氨酸。同时乙酰羟基酸合成酶是L-异亮氨酸合成途径的限速酶,强化该酶可以加速限速反应,有利于L-异亮氨酸积累。为了研究增加胞内α-酮基丁酸的供应和强化乙酰羟基酸合成酶对L-异亮氨酸发酵的影响,本文以L-异亮氨酸生产菌C. glutamicum YILW为出发菌株进行改造,通过质粒过表达cimA成功构建了C. glutamicum YILWpXMJ19cimA;在出发菌株基因组ilvB上游插入Ptac强启动子成功构建C. glutamicum YILWPtac;在C. glutamicum YILWPtac基础上质粒过表达cimA,获得C. glutamicum YILWPtacpXMJ19cimA。通过RT-PCR分析,cimA和ilvB的转录量分别提高了920.0倍和12.5倍。SDS-PAGE分析cimA在C. glutamicum YILWpXMJ 19cimA可以表达。对出发菌株和改造菌进行摇瓶补料分批发酵比较改造菌产酸水平的变化。结果发现,与出发菌C. glutamicum YILW相比,YILWpXMJ19cimA和YILWPtac的L-异亮氨酸积累量提高了8.9%和14.8%,糖酸转化率提高了17.8%和18.6%,单位菌体产酸提高了15.1%和20.3%,副产物L-丙氨酸较原菌分别降低了25.0%和29.9%。Cglutamicum YILWPtacpXMJ19cimA的L-异亮氨酸积累量较原菌提高了14.5%,副产物L-丙氨酸较原菌降低了8.6%,糖酸转化率和单位菌体产酸分别提高了42.4%和17.6%,糖酸转化率较YILWpXMJ 19cimA和YILWPtac分别提高了20.8%和20.0%。实验结果表明通过Ptac强启动子插入协同cimA表达增加胞内α-酮丁酸的供应和强化限速酶乙酰羟基酸合成酶的方法可以提高产酸,并能够较明显的提高菌体的糖酸转化率。代谢分析表明L-异亮氨酸合成代谢流从1.09%分别提高到2.33%、7.69%和4.26%。5L发酵罐发酵实验出现菌体在20 h过早地进入稳定期,并表现出生长停滞,耗糖耗氧变慢的情况。针对该现象在发酵过程中依次流加了豆饼水解液、玉米浆、生物素、氨基酸复合液、嘌呤核苷、酵母粉及微量元素等多种营养物质。结果菌体生物量低的问题依然没有解决。通过流加实验排除了流加的成分是菌体生长的限制因素,猜测可能是玉米浆中的某种或某几种未知的营养因子限制菌体生长和产酸。
李忠财[8]2016年在《高产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌的菌种选育及代谢优化》文中认为Corynebacterium glutamicum LD320是一株L-异亮氨酸高产菌株。该菌通过多轮传统诱变筛选获得,很难再进一步通过诱变提高其L-异亮氨酸产量。本文针对L-异亮氨酸生产菌Corynebacterium glutamicum LD320,结合代谢组学、蛋白组学等技术对L-异亮氨酸合成途径、分泌系统及其调节机制进行了研究,并进一步提高了C.glutamicum LD320的L-异亮氨酸的产量。主要结论如下:(1)通过在C.glutamicum LD320中过表达L-异亮氨酸合成途径中野生型和突变型的关键酶比较发现,表达突变型酶的产酸水平优于表达野生型酶,其中突变型的TD1和AHAS1能够显着提高谷氨酸棒杆菌中L-异亮氨酸的产量。(2)对TD和AHAS酶学性质研究发现,突变型TD1能够完全耐受高浓度的L-异亮氨酸的反馈抑制,还能被低浓度的L-异亮氨酸激活;突变型AHAS1能部分耐受单个或组合支链氨基酸的反馈抑制。同时,突变型TD1和AHAS1的共表达菌株LD320/pXMJ19-ilvBN1-ilvA1的L-异亮氨酸摇瓶产量达到4.55 g/L,产量较出发菌株提高了29%。(3)在C.glutamicum LD320中过表达突变型brnFE1基因能有效加强L-异亮氨酸的外排能力,LD320/pXMJ19-brnFE1的L-异亮氨酸摇瓶产量可达到4.44 g/L,较出发菌株提高了21%。(4)突变型基因ilvBN1、ilvA1和brnFE1共表达能显着提高L-异亮氨酸产量,LD320/pXMJ19-ilvBN1-ilvA1-brnFE1的L-异亮氨酸摇瓶产量达到5.17 g/L,产量较出发菌株提高了41.3%。(5)基于摇瓶水平对培养基进行了优化。结果表明:生物素biotin的最适浓度为0.5 mg/L,最适前体物苏氨酸的最适浓度为1 g/L的,最适表面活性剂Tween-80的添加时间和添加浓度分别是16 h和0.5 g/L。(6)综合所有优化条件,在7 L发酵罐上进行了放大实验,在发酵65 h后,LD320/pXMJ19-ilvBN1-ilvA1-brnFE1的L-异亮氨酸产量由18.53 g/L到25.45 g/L,相比对照组提高了37%。
常高峰[9]2004年在《L-异亮氨酸产生菌的发酵控制研究》文中进行了进一步梳理本文以代谢控制发酵理论为指导，重点对L-异亮氨酸高产菌TC-21的发酵控制进行了研究。主要研究内容和结果如下： (1)建立了发酵液中L-异亮氨酸定量测定的“氧化比色法”，并对该方法的应用条件进行了研究。 (2)研究了菌株TC-21的摇瓶分批发酵条件。应用正交设计和响应面法分别优化出种子培养基和发酵培养基的配比，并对种子培养条件和发酵条件进行了研究。在优化条件下，TC-21菌株摇瓶分批发酵96h，产L-异亮氨酸21.18g／L。 (3)对TC-21菌株进行了5L发酵罐发酵研究，分析了分批发酵过程，研究了发酵过程动力学以及发酵过程中菌体形态；重点研究并提出了分阶段发酵控制方式，优化后的L-异亮氨酸发酵产酸达23.58g／L。 (4)基于5L发酵罐发酵数据对后期发酵过程中的代谢流迁移变化进行了研究。分别对不同补料方式和控制方式下代谢流迁移变化进行了初步研究，为进一步发酵研究提供有利的理论指导。 本文L-异亮氨酸高产菌TC-21菌株在5L罐上发酵可产L-异亮氨酸23.58g／L，发酵过程其性状稳定。利用代谢流迁移变化分析了L-异亮氨酸5L罐发酵过程中的变化，有助于进一步对该菌株开发和研究、优化其L-异亮氨酸生物合成代谢流。
林殿海, 黄和蓉[10]1990年在《产L-异亮氨酸新菌株选育及其发酵产物提纯和鉴定》文中认为以谷氨酸产生菌Corynebactelium SP·Hu7251为出发菌株,经NTG多次诱变,获得一株多标记突变株Am142—302(AHV~r,AHC~r、2-TA~r、Mef~-),可产9.6mg/mlL异亮氨酸。复将Am142-302经紫外线诱变和单菌落分离筛选,选得突变株Am1423—56。该菌在比较合适的摇瓶发酵条件下,可积累L-异亮氨酸达15.1mg/ml。发酵产物经提纯鉴定,确证是L-异亮氨酸。
参考文献：
[1]. L-异亮氨酸产菌株的选育及苏氨酸脱水酶编码基因的克隆与表达[D]. 罗磊. 福建师范大学. 2012
[2]. L-异亮氨酸产生菌的选育及其发酵条件的研究[D]. 魏春. 天津科技大学. 2002
[3]. L-异亮氨酸产生菌的融合育种选育及其关键酶与发酵条件的研究[D]. 王菲. 天津科技大学. 2004
[4]. 高产L-异亮氨酸菌种的选育及其发酵条件研究[D]. 张灿丽. 西北农林科技大学. 2006
[5]. L-异亮氨酸产生菌的选育及其发酵条件优化[J]. 宋文军, 陈宁, 魏春, 刘淑云, 张克旭. 食品与发酵工业. 2003
[6]. 产L-异亮氨酸突变株的生化特性鉴定及发酵条件研究[D]. 陈婷婷. 福建师范大学. 2016
[7]. L-异亮氨酸生产菌株的构建及发酵条件优化[D]. 徐国栋. 天津科技大学. 2015
[8]. 高产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌的菌种选育及代谢优化[D]. 李忠财. 大连工业大学. 2016
[9]. L-异亮氨酸产生菌的发酵控制研究[D]. 常高峰. 天津科技大学. 2004
[10]. 产L-异亮氨酸新菌株选育及其发酵产物提纯和鉴定[J]. 林殿海, 黄和蓉. 氨基酸杂志. 1990