李健[1]2002年在《长角血蜱雌虫唾液腺结构与分泌活性的研究》文中研究说明蜱类是重要的媒介动物，传播多种人、畜疾病，造成极大危害。唾液腺在蜱类生命活动中起重要作用，而且又是各类疾病传播的窗口。因此，对其研究具有重要的理论和实际意义。 本文以广泛分布于我国的长角血蜱Haemaphysalis longicornis Neumann为研究对象，利用电镜技术、Bradford法、SDS—PAGE和Na~-、K~--ATPase活性微量检测法等现代生物学技术对其唾液腺结构、蛋白含量和成分、Na~-、K~-—ATPase活性及其动态变化，特别是保幼激素类似物法尼醇对唾液腺结构与分泌活性的影响进行了较系统地研究，为深入开展蜱类唾液腺研究提供依据。主要研究结果如下： 1．长角血蜱雌虫唾液腺由腺管和大量的腺泡组成。唾液腺管逐级分支，由中央腺管、主分支腺管和小叶分支腺管构成：依据腺泡分布位置的不同，可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型腺泡，分别位于中央腺管、中央腺管与主分支腺管、小叶分支腺管上。首次发现长角血蜱腺泡表面呈非平滑状态，有大量的气管分布并逐渐分支深入到腺体内，为唾液腺生理活动提供氧气需求。 2．雌虫唾液腺随发育期而发生明显变化。饥饿雌虫唾液腺腺泡小(34.79μm)，表面有人量的突起和凹陷；吸血后2d腺体和腺泡明显增大：交配期腺泡达到最大值(97.81μm)，约为饥饿期的2.8倍，腺泡表面明显变得光滑；饱血后腺泡逐渐萎缩，发生自溶现象，饱血后4d唾液腺明显退化。 3．唾液腺蛋白水平在不同发育期发生明显变化，并与腺体结构变化趋势基本一致。饥饿期蛋白含量低(9.51μg/tick)：吸血后2d蛋白含量急剧增加(34.90μg／tick)；交配期达到峰值(84.40μg/tick)，约为饥饿期的8.9倍；饱血后蛋白含量明显下降，饱血后2d和饱血后4d的含量分别为39.47μg／tick和20.54gg／tick。 4．饥饿雌虫唾液腺有17条蛋白带：吸血后2d增加到23条；交配后达到26条，直到饱血后4d保持不变，吸血和交配能刺激新蛋白的合成。唾液腺蛋白中主带有10条，分子量分别为192KD、158KD、136KD、133KD、129KD、97KD、84KD、74KD、45KD、 长角血蝉雌虫唾液腺结构与分泌活性的研究——中文摘要 32KD，主带在不同发育期发生增加、缺矢和量的变化。 5．采用加大样品量和酶微量测定技术首次检测到长角血．婢饥饿期和饱血后唾浓 腺中Na、K－ATPase活性，并完成酶活性的动态分析。饥饿期Na、K－ATPase活力低 （0．76Whol Pi／mg Pr，七r）；吸血后 Zd活力急剧增大（1．06umol Pi／mg Pr／hr）；饱 血当无达到最大值（1．4lwhol Pi／。g Pr／hr卜 饱血后唾液腺中Na、K－ATPase活力急 剧．降；饱血后4d又降到低水平（0．62An。IPi／mg Pr／hr）。这一结果属首次报道。 6 法尼醇对雌虫唾液腺蛋白含量、成分和腺泡有作用，并随发育期和剂量的不同。而产生不同效应。吸血后Zd用法尼醇处理，10陀剂量使唾液腺蛋白含量明显增加， 10ug、50ug和 100ug剂量抑制 136KD蛋白的基因表达。饱血当大用法尼醇处理，10ug；”50卜g和 100us剂量的法呢醇显着提高饱血后Zd唾液腺蛋白含量，100ug剂量使35Kll 蛋白表达，高剂量200卜g和 400卜g使 136KD和 192KD的蛋白缺矢。饱血当大处理，1卜g 和 10ng剂量均能显着提高饱血后4d雌虫唾液腺蛋白含量，高剂量100ug、200ty利 400ug抑制136KD蛋白的表达。上述结果表明法尼醇对唾液腺蛋白的合成有调控作用； 7．在吸血后Zd局部施用法尼醇，剂量＊ 和 104g对吸血－饱血当大Na、K－ATPase 活力无显着影响，但有使Na、K－ATPase活力增加的趋势。 上述研究结果显示，长角血婢唾液腺随发育的不同阶段，其结构、蛋白含量和咸 分以及Na、K－ATPase活性均发生一系列复杂的动态变化。保幼激素类似物法尼醇对 唾液腺蛋白含量、蛋白成分和腺泡有影响。
谢俊仁[2]2007年在《长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA文库的构建及免疫学筛选》文中研究表明长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)及其传播的疾病严重威胁着我国畜牧业的发展。现在,对蜱的控制方法主要是化学药物应用,但随着蜱耐药性的产生以及环境污染和药物残留等严重公共卫生问题的出现迫使人们寻求防治的新途径。在众多控制蜱的方法中,免疫学防制是前景最诱人的方法之一。本研究首先采用不同的免疫途径制备了两种兔抗长角血蜱阳性血清,旨在研究长角血蜱唾液腺的免疫特性。为了更好的研究长角血蜱的免疫原基因,本研究以半饱血长角血蜱雌蜱唾液腺为材料提取mRNA,反转录合成双链cDNA,并定向插入λ-SCREEN载体,成功地构建了长角血蜱的cDNA表达文库。为了获得抗原基因,本研究利用免疫印迹方法,用抗长角血蜱的血清筛选长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库,自动亚克隆为重组质粒p-SCREEN后转入JM109中,提取重组质粒进行PCR、酶切和测序分析。ELISA检测结果表明,叮咬组家兔血清中的抗体效价从初次叮咬后第叁周开始呈阳性,随着叮咬次数的不断增加抗体水平也随之持续上升,在第11周时达到高峰;免疫组的家兔血清抗体水平持续上升,两组家兔均能表现出一定的抗蜱效应。实验证明,所构建的文库质量很高,基础库容量为4.2×10~6 pfu,扩增后的文库滴度为7.8×10~9 pfu/ml。经免疫学筛选得到26个的阳性克隆。经鉴定这些基因均来自长角血蜱,它们的大小在199bp~1876bp之间。这为研制长角血蜱的分子疫苗和克隆功能基因奠定了坚实的基础。
杨晓红[3]2013年在《蜱唾液腺蛋白Salp20的补体抑制机制和卵黄发生的激素调控》文中研究指明蜱类是世界广泛分布的专性吸血外寄生物，由其传播的人畜疾病非常多，对人类及畜牧业发展危害极大。肩突硬蜱（Ixodes scapularis），又名鹿蜱、黑腿壁虱，可传播多种病原体，包括莱姆病病原体伯格多弗疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）。肩突硬蜱唾液腺分泌多种具有抗炎症反应、抗凝血和抗免疫反应的唾液分子到宿主体内，抑制宿主对蜱体表吸血的抵御反应。该蜱唾液腺蛋白Salp20能保护莱姆病血清敏感型病原体伽氏疏螺旋体（B. garinii）免受补体介导的裂解。本文表达纯化了蜱唾液腺蛋白Salp20，对其分离纯化条件进行了优化，并对其补体抑制机制进行了研究。该研究对蜱媒疾病防治和畜牧业发展具有重要的理论和实际应用意义。优化后的分离条件为：500ml样品量流经500μl的Ni-NTA亲和层析柱，用2ml含有20mM咪唑的缓冲液清洗四次，用250μl含有500mM咪唑的洗脱液洗脱四次并收集样品。SDS-PAGE和Western blot分析所得蛋白样品，结果显示蛋白具有高纯度且为目的蛋白Salp20。纯化的Salp20能够保护伽氏疏螺旋体免受补体裂解，证明分离纯化所得蛋白具有很高的生物学活性。用C3b单克隆抗体检测莱姆病病原体表面C3b的沉积，免疫荧光分析结果显示血清敏感型病原体伽氏疏螺旋体表面有大量的C3b沉积，而血清抗型伯格多弗疏螺旋体表面C3b沉积量极少。说明血清敏感型病原体伽氏疏螺旋体能够引发强烈的补体反应，而血清抗型伯格多弗疏螺旋体不能。用C3b和P因子单克隆抗体检测伽氏疏螺旋体表面补体替代途径中C3b和P因子的沉积，免疫荧光分析结果显示菌体表面有大量的C3b和P因子沉积，说明伽氏疏螺旋体引发了强烈的补体替代途径反应。向反应体系加入10μg/ml Salp20后，菌体表面没有C3b和P因子沉积，说明Salp20可抑制补体替代途径中的C3b和P因子结合到伽氏疏螺旋体表面。伽氏疏螺旋体与10μg/ml P因子反应后，菌体表面无P因子的沉积。伽氏疏螺旋体与C3缺失型人血清反应后，发现菌体表面无P因子。表明P因子不能直接与伽氏疏螺旋体表面结合来起始补体替代途径。因此Salp20通过P因子结合，使其不能稳定C3转化酶，抑制了C3b蛋白的产生，从而抑制了补体替代途径。研究了两种激素20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone，20E）和保幼激素III（juvenile hormone III，JH III）对长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）孤雌生殖种群卵黄发生的影响，对揭示蜱类生殖生物学规律和蜱类防治具有重要的科学意义。蜱在宿主体表吸血3天后，向半饱血成蜱注射20E和JH III，20E的最大注射剂量为10μg/tick，JH III的最大注射剂量为5μg/tick。注射后叁天检测结果。体式显微镜下观察20E注射剂量为0.5μg/tick和1μg/tick20E蜱的卵巢充满了含有卵黄颗粒的卵细胞，卵巢体积较大，整体呈现棕黄色，而注射对照组卵巢体积极小，呈白色半透明状。这两个注射剂量组蜱的卵巢重量占体重比例，脂肪体、血淋巴和卵巢中卵黄原蛋白白含量和卵黄原蛋白含量与对照组相比较显着增高。注射JH III蜱的的卵巢重量占体重比例，脂肪体、血淋巴和卵巢中卵黄原蛋白白含量和卵黄原蛋白含量与对照组相比较无显着差异。说明20E对半饱血期孤雌生殖长角血蜱卵黄发生和卵黄原蛋白的摄取具有促进作用，而JH III无作用。向饱血当天成蜱注射20E和JH III，20E的最大注射剂量为1μg/tick，JH III的最大注射剂量为0.5μg/g bw。注射后四天检测结果。结果显示20E和JH III注射组蜱卵巢重量，脂肪体、血淋巴、卵巢组织中卵黄原蛋白和Vn含量与对照组无显着差异。说明这两种激素对饱血期长角血蜱卵黄发生无作用。这些结果表明20E对半饱血蜱卵黄发生具有促进作用，但对饱血期蜱卵黄发生无显着作用。JH III对半饱血期和饱血期蜱的卵黄发生均无显着影响。
李知新[4]2007年在《长角血蜱生物学特性研究及免疫原基因的筛选》文中研究说明长角血蜱是我国流行最广泛的蜱种之一,主要叮咬牛、羊以及多种脊椎动物,是病毒、立克次氏体、螺旋体、细菌、原虫、支原体、以及衣原体等多种重要病原的传播媒介,主要影响家畜的生产性能,为畜牧业的发展造成极为严重的危害,具有重要的流行病学意义。本研究旨在实验室条件调查我国北方长角血蜱甘肃株的生物学特性,在此基础上构建卵的cDNA文库,利用免疫学方法筛选克隆免疫原基因。获得以下结果:1、长角血蜱为叁宿主型,完成一个世代需101~148d;成年饥饿雌蜱吸血期具有两个显着特征:缓慢和快速吸血;不同饲喂条件下长角血蜱饱血体重、产卵量差异极显着(P<0.01),饱血体重越大,产卵量越大;经兔体叮咬的成年雌蜱其饱血体重小于羊体。在一定温度范围内,幼蜱、若蜱的蜕皮时间随温度升高而缩短;当饱血雌蜱处于发育阶段时,产卵前期、产卵期及卵的孵化期都随着温度的升高而缩短;16℃~30℃条件下长角血蜱产卵量没有变化,利于蜱存活;4℃以下和45℃以上饱血蜱及其后代不能存活,而饥饿蜱可以存活;16℃以下蜱的发育周期延长。随着湿度增加产卵量增加,70%相对湿度以下发育周期均延长。结果表明,雄蜱可以帮助雌蜱吸血,蜱自身因素和外界因素对长角血蜱的发育繁殖有影响。2、孤雌生殖的长角血蜱也为叁宿主型;在兔体完成一个世代共需106~154d,饥饿期的幼蜱、若蜱与两性生殖的饥饿幼蜱、若蜱体重差异不显着(P>0.05),而饱血体重与两性生殖的长角血蜱种群饱血体重差异极显着(P<0.01);雌蜱饱血体重可达吸血前的108.46±19.72倍,与两性生殖的种群饱血体重差异亦极显着(P<0.01)。雌蜱产卵量与饱食体重之间呈极显着的正相关r=0.8970(P<0.01);生殖效率指数REI=6.76,生殖适合度指数RFI=6.29;蜱发育时间在不同季节无明显变化。3、利用单、双向琼脂糖凝胶扩散试验检测各长角血蜱饥饿雄蜱蛋白阳性血清的滴度,结果表明,用成年长角血蜱雄蜱蛋白在家兔淋巴内外注射制备的两种抗血清,其抗体效价分别达1:128、1:64,可判定为阳性血清;检测直接用雄蜱叮咬兔子制备的血清抗体效价为1:8。雄性成蜱抗原与卵、幼蜱、若蜱抗原免疫动物制备的血清之间存在交叉免疫。淋巴内免疫制备的血清更适合于长角血蜱cDNA表达文库的免疫学筛选。4、所构建的长角血蜱卵的cDNA文库的库容量约为4.0×106pfu,重组率为99%,扩增后文库的滴度为9.07×1010pfu/ml。对文库用已知的促卵泡激素引物进行扩增,得到长角血蜱促卵泡激素全长cDNA序列。与GenBank中的长角血蜱促卵泡激素(DQ248886)的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为97.8%和99%。说明所构建的长角血蜱卵cDNA表达文库库容量大、重组率高,为筛选功能基因奠定了基础。5、免疫筛选获得12个阳性克隆。经Genbank blast序列比对确证后,认为3个为长角血蜱免疫原基因,还有4个基因分别是热休克蛋白、rRNA串联重复序列、组胺激酶和假定蛋白,其余克隆与Genbank数据库中的序列无明显的同源性,有待进一步研究。
张维谊[5]2004年在《镰形扇头蜱唾液腺及其表达序列标签的研究》文中指出镰形扇头蜱可传播牛的巴贝斯虫病等，是我国南方的优势蜱种。其唾液腺是重要器官，在吸血过程中分泌大量的功能分子，这些功能分子成为最有价值的候选疫苗抗原分子。本文通过对镰形扇头蜱唾液腺及其表达序列标签(EST)研究，旨在寻找抗蜱及蜱传病疫苗的抗原候选分子。 本研究选择温度为25℃、相对湿度为92％的条件进行镰形扇头蜱兔体的人工饲养和繁殖，获得单雌蜱克隆蜱群。解剖镰形扇头蜱，取其唾液腺，经液氮反复冻融、超声、离心获得唾液腺提取物(SGE)。将含量为10μg的镰形扇头蜱未吸血和半饱血SGE进行SDS-PAGE，发现二者蛋白表达存在明显差异，主蛋白条带分别为69kDa、100kDa，吸血后蛋白表达发生变化，在分子量为45-100kDa间产生一些新的蛋白分子。将蛋白抗原转印到PVDF膜，用被镰形扇头蜱叁次叮咬的兔抗血清进行Western-blotting分析，发现35kDa的蛋白可能是较重要的抗原，100kDa蛋白是蜱吸血时产生的新抗原。用半饱血SGE抗原经间接ELISA法检测人工感染的镰形扇头蜱幼虫、若虫、成虫的免抗蜱唾液抗体的变化情况，发现被蜱叮咬的兔抗体效价随着叮咬次数的增加而增加。通过Smart方法结合长链PCR(LD-PCR)构建了高质量的镰形扇头蜱半饱血唾液腺cDNA广西大学硕士论文镰形扇头蝉唾液腺及其表达序列标签的研究文库，文库重组率为95.2%，插入片段多在0.5一Zkb之间，库容量为2、75X106pfu/mL，为分离有价值的基因提供了资源及平台。经大肠杆菌BM25.8质粒化，从eDNA文库获得1 00条平均长度为745bp的有效ESTs，经功能分析发现，分别与能量代谢、信号传导、蛋白合成等基因相关，Es丁s中有27%的未知新基因，2条分别为ATP酶、细胞色素氧化酶m蛋白的全长基因，并登录在Ge心ankTM上，登录号分别为AY319968、AY422796;同时在ESTs中还发现一些抑制分子、粘合素蛋白等有价值的ESTs。 通过研究，发现了镰形扇头蜂唾液腺的重要蛋白抗原;构建了国内第一个镰形扇头蟀唾液腺cDNA文库，并运用EST技术获得了新基因，为蟀的相关研究提供了平台，为控制蟀及蟀传病奠定了基础。
周丽峰[6]2011年在《两种硬蜱雄性性腺功能因子的研究》文中进行了进一步梳理交配是蜱类繁殖过程中的关键环节,诱发雌蜱发生一系列的生理变化,并最终产卵。雄蜱性腺分泌物在交配过程中发挥着十分重要的作用,一方面保护、活化精子,促进授精,刺激卵巢发育和卵黄发生,另一方面对雌蜱的生理行为等产生影响,如诱导雌蜱快速吸血,加速产卵等。本文的综述部分在简要描述雄蜱性腺形态结构和分泌物生化特性基础上,系统阐述了雄蜱性腺分泌物中各种功能因子的研究现状,着重论述其在精子获能、诱导雌蜱吸血、促进雌蜱卵巢发育和卵黄发生方面的进展,并对未来的研究提出了展望,以期为今后此领域研究开拓思路,促进防治工作的开展。本研究以河北省广泛分布的两种硬蜱—长角血蜱和森林革蜱为研究对象。利用体腔注射、酶联免疫分析对饱血雄蜱性腺分泌物的功能活性进行了研究;利用cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增、反转录PCR、实时定量PCR技术扩增得到饱血因子的全长序列并对其阶段和组织表达进行了系统分析;利用液相色谱-质谱联用技术对长角血蜱饱血雄蜱性腺蛋白质组进行了分析。以上工作为进一步探索蜱类引发雌蜱交配效应的功能物质以及利用它们开发抗蜱疫苗奠定了基础。为了进一步加深对蜱类饱血因子的了解,并为蜱类饱血因子序列保守性研究提供基础,同样采用cDNA文库构建和cDNA末端快速扩增技术扩增得到了森林革蜱饱血因子的全长序列。主要研究结果如下:1.长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)(1)饱血雄蜱性腺提取液具有刺激处于缓慢吸血期未交配雌蜱进入快速吸血期,从而快速饱血脱落的功能,表现在饱血时间短,饱血率高,对饱血体重方面影响显着。(2)饱血雄蜱性腺提取液具有促进卵巢发育,促进外周脂肪体合成卵黄原蛋白,促进卵巢摄取卵黄蛋白的功能。(3)不同注射剂量的饱血雄蜱性腺提取液在雌蜱的饱血体重,卵巢重量,外周脂肪体合成卵黄原蛋白,卵巢摄取卵黄蛋白方面无明显差异。仅高剂量实验组在饱血体重和卵黄原蛋白两方面有差异。(4)根据体腔注射饱血雄蜱性腺提取液得到的实验结果与正常交配相类似,而在交配中雄蜱的交配功能物质进入的是雌蜱生殖道,本实验中提取液进入的是雌蜱的血淋巴,因此推断雄蜱交配功能物质在雌蜱体内的运输循环途径是随精液进入雌蜱生殖道后透过生殖道管壁,进入血淋巴中,通过血淋巴的循环到达靶组织,发挥功能。(5)成功构建高质量的饱血雄蜱性腺cDNA文库,初级文库库容量是1.71×106,扩增文库的库容是2.8×108。(6)成功扩增得到饱血因子HlEFα的全长序列(HQ908090),全长647 bp,开放式阅读框起始于116位终止于572位,共编码152个氨基酸。(7)发育10天后的卵,处于饥饿期的幼蜱、若蜱、雌蜱、雄蜱均不表达HlEFα,吸血96h的未交配雌蜱各组织均检测不到HlEFα。交配前后雌蜱卵巢的HlEFα含量变化不大。(8)吸血或者雄蜱性腺发育成熟是HlEFα合成的必要条件(饥饿期无,饱血后有),推断合成部位是雄蜱的精巢/输精管。(9)对cDNA文库进行随机筛选得到雄蜱饱血性腺的一些基因序列。(10)对饱血雄蜱性腺总蛋白进行LC-MS分析,经比对得到此时期此组织部分蛋白组成,建议以后的实验采用双向电泳进行初步分离后再进行LC-MS分析。2.森林革蜱(Dermacentor silvarum)(1)成功构建高质量的饱血雄蜱性腺cDNA文库,初级文库库容量是2.17×106,扩增文库的库容是3.5×108。(2)成功扩增得到饱血因子DsEFα的全长序列(HQ908089),全长672 bp,开放式阅读框起始于127位终止于580位,共编码151个氨基酸。(3)对cDNA文库进行随机筛选得到雄蜱饱血性腺的一些基因序列。(4)对目前已知的长角血蜱、森林革蜱、具尾扇头蜱(Rhipicephalus appendiculatus)、希伯来花蜱(Amblyomma hebraeum)、变异革蜱(Dermacentor variabilis)的饱血因子蛋白序列进行比对分析,结果显示5个饱血因子序列相似性与它们进化上的亲缘关系一致,即亲缘关系越近序列相似性越强。革蜱属与具尾扇头蜱属之间的保守性很强,这与它们在属级进化分支上属于同一支相关。
王振宝[7]2009年在《小亚璃眼蜱的生活史和抗菌多肽活性的研究及牛环形泰勒虫病二温式PCR检测方法的建立》文中提出本试验主要研究小亚璃眼蜱生活史和保种试验,在此基础上通过AU-PAGE和电泳凝胶琼脂糖弥散法,初步分析在小亚璃眼蜱与病原体相互作用过程中,起着重要作用的功能分子抗菌多肽及其抗菌活性。同时,利用疫区采集的抗凝全血建立牛环形泰勒虫病二温式PCR检测方法,可为综合防制小亚璃眼蜱及其所传播的牛环形泰勒虫病提供重要科学依据。小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)为一种叁宿主蜱,在中国主要分布于新疆维吾尔自治区的半荒漠地区和草原地区,是环形泰勒虫(Theileria annulata)的传播媒介之一,对畜牧业造成重大经济损失。鉴于此,本试验在实验室条件下对小亚璃眼蜱的各个发育阶段的生活史进行了研究。经观察:小亚璃眼蜱在22-28℃,60-85%相对湿度下室内人工饲养,完成一代需要138d,成蜱吸血期、产卵前期、产卵期分别为8.5d、10.5d、27.5d;卵孵化期为31.5d,孵化率为80%;幼虫吸血前期、吸血期、蜕化期分别为3d、5.5d、18.5d;若虫吸血前期、吸血期、蜕化期分别为4d、10d、19d;成蜱在4℃冰箱、室外模拟鼠洞保种试验成活率为80%。本试验表明,小亚璃眼蜱完全可以在实验室条件下大量繁殖和4℃冰箱保存,这可给蜱及蜱传疾病研究提供丰富、低廉的试验材料,且其各个发育阶段的生物学参数能为研究蜱及蜱传播疾病的综合防制提供依据。本文利用上述试验繁殖和保种的小亚璃眼蜱,对其血淋巴中阳离子抗菌多肽的电泳分析方法及其抗菌作用进行探讨,从半饱血的小亚璃眼雌蜱体内抽取血淋巴,用50ml/L的乙酸抽提,经AU-PAGE分析小亚璃眼蜱血淋巴中阳离子多肽成份,用电泳凝胶琼脂糖弥散法对各多肽进行抗菌活性的筛选。结果表明,小亚璃眼蜱血淋巴中阳离子多肽成份对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有很强的抗菌作用。AU-PAGE分析发现一电泳迁徙率明显高于溶菌酶的阳离子抗菌多肽。提示在小亚璃眼蜱的血淋巴中,存在与溶菌酶不同的阳离子抗菌多肽。AU-PAGE是一种较简单,快速,经济的分离纯化天然抗菌多肽的方法。在疫区采集牛体上硬蜱的同时无菌采取了该牛的全血,用于建立牛环形泰勒虫病二温式PCR检测方法,根据牛环形泰勒虫裂殖子表面抗原(Tams1)基因,设计了一对特异性引物,扩增出大小为154bp基因片段,经克隆、测序分析,与已知基因序列的相似性为96%。用建立的牛环形泰勒虫病二温式PCR检测方法,对新疆牛环形泰勒虫病流行地区采集的50份全血样品进行检测,阳性率为88%,而血涂片检出的阳性率只有58%。经试验验证,该方法具有特异性高、敏感性强、重复性和稳定性好等优点。表明,本试验所建立的二温式PCR检测方法可用于牛环形泰勒虫病的临床诊断、隐性感染和流行病学调查。
魏转[8]2004年在《长角血蜱精巢与附腺发育、蛋白质分析及激素调节》文中提出蜱类是重要的媒介动物，传播多种人、畜疾病，造成极大危害。蜱类的一个重要生物学特点是能够迅速产生大量后代，雄蜱在其中发挥着重要作用。因此，对其研究具有重要的理论和现实意义。 本文以长角血蜱(Haemaphysalis longicornis Neumann)为研究对象，利用电镜技术、Bradford法、SDS-PAGE、局部点滴和体外培养等现代生物学技术对雄性生殖系统结构与蛋白组成、随发育期的动态变化及其影响因素进行了较系统研究，为深入开展蜱类生殖生物学研究提供了依据。主要结果如下： 1．长角血蜱雄性生殖系统由精巢、输精管、射精管和附腺复合物组成。雄性生殖系统的蛋白成分复杂，具有多样性。 2．精巢结构随发育期发生明显变化。饥饿时期精巢小(长960.00μm，宽为163.48μm)。随着吸血的进行，精巢逐渐增大，吸血后两天，长1573.70μm，宽330.44μm；交配期精巢达到最大(长为205852μm，宽490.10μn)，几乎占据了蜱体腔的大部分。交配后，精巢变小，萎缩(长为1602.40gm，宽为398.86gm)。 3．精巢蛋白水平在不同发育期呈现明显变化。饥饿期精巢中蛋白水平低(3.50μg／tick)；吸血后迅速增加(15.00μg／tick)，为饥饿期的4.3倍；交配期蛋白水平明显增加(45.80μg／tick)；交配结束后，蛋白水平降低(26.58μg／tick)。 4．附腺蛋白水平在不同发育期呈现明显变化。饥饿期附腺中蛋白水平低(3.50μg／tick)。吸血后两天增加(8.68μg／tick)，为饥饿期的2.5倍；进入交配期，蛋白水平达到峰值(31.70μg／tick)；交配后，蛋白水平有所降低(22.88μg／tick)。 5．饥饿期精巢中蛋白带少，主带有8条；吸血后两天和交配期明显增加，吸血后两天，增加8条，交配期20条，交配后条带又减少为15条。这几个时期主要条带基本相同，均有分子量为12.9KD、24.9KD、30.3KD、43.3KD、54.1KD、58.3KD、69.4KD和88.5KD的蛋白条带。但从饥饿期到交配期，条带颜色逐渐加深，并且在吸血后两天，增加了分子量为18.0KD、19.7KD、26.3KD、46.5KD、50.0KD、66.5KD、74.5KD和85.4KD的蛋白条带，交配时期，蛋白带为20条，相对吸血后两天，增加了分子量为15.9KD、21.1KD、37.3KD和78.1KD的蛋白带。交配结束后，分子量为15.9KD、21.1 研究论文—中文摘要KD、37.3KD、78.1 KD和85.4 KD处的蛋白含量明显减少，几乎消失。 6.饥饿期附腺的蛋白带少，主带有7条，分子量分别为26.3KD、29.9KD、30.6KD、51·SKD·57.0KD、65.3KD和85.3KD;吸血后两天和交配期明显增加，吸血后两天，增加9条，分子量分别为12.SKD、13.gKD、16.7KD、18.4KD、19.SKD、20.7KD、 35.6KD、sl.SKD和60.9KD;交配期达到21条，增加的蛋白分子量为34.2KD、42.IKD、46.4KD、68.5KD和70.9KD;交配后又增加分子量为74.IKD和77.IKD的两条蛋白带，而分子量为13.gKD、16，7KD、18.4KD、26，3KD和34.2KD蛋白带颜色降低。 7.保幼激素和蜕皮激素均影响长角血蜂精巢和附腺的发育。局部点滴保幼激素类似物法尼醇，在一定浓度范围内能促进附腺的发育。体外培养实验表明，10n留pl和50n留pl的蜕皮激素能够显着促进精巢的发育。 上述结果显示，雄性生殖系统由多个部分组成，精巢和附腺的结构、蛋白质含量和成分随发育的不同阶段发生一系列动态变化;在一定剂量范围内，保幼激素和蜕皮激素均对精子发生和附腺发育有影响。
杨小龙[9]2003年在《长角血蜱卵巢发育与卵黄发生的研究》文中研究说明蜱类是重要的媒介动物，传播多种人、畜疾病，造成极大危害。卵黄发生是蜱类生殖的中心内容，是决定产卵和种群数量的关键。因此，对其研究具有重要的理论和实际意义。 本文以长角血蜱Haemaphysalis longicornis Neumann为研究对象，利用电镜技术、Bradford法、SDS-PAGE、分子筛与离子交换层析、局部点滴和体外培养等现代生物学技术对其雌性生殖系统结构与蛋白组成、卵巢结构、蛋白含量与成份及其动态变化、卵黄蛋白的纯化及其部分性质、以及保幼激素和蜕皮激素对卵黄发生的影响进行了较系统的研究，为深入开展蜱类生殖生物学研究提供依据。主要研究结果如下： 1．长角血蜱雌性生殖系统由卵巢、输卵管、阴道、受精囊、附腺和吉氏器组成。与其它硬蜱基本相似，但其输卵管近末端处呈明显的壶腹状，吉氏器的角呈球囊状。雌性生殖系统的蛋白成分复杂，具有多样性，而在各部分结构之间蛋白既有同一性又有特异性。 2．卵巢随发育阶段发生明显变化。饥饿期卵巢呈管状结构，卵母细胞直径小(5.90μm)；吸血初期卵巢明显增大，卵母细胞直径增加(38.70μm)，纵沟外侧出现大量发育的卵母细胞；交配期卵巢继续延长，变粗，部分区段呈回折状，卵母细胞血径缓慢增加(73.33μm)；饱血后，卵巢快速发育，纵沟内外紧密排布大量的卵母细胞，越靠外侧其发育程度越高，卵母细胞直径迅速增加(270.00μm)，为交配期的3.7倍，产卵时卵母细胞直径达到最大值(286.33μm)，卵巢占据了蜱体腔的大部分。 3．卵巢蛋白水平在不同发育阶段呈现明显变化。饥饿期卵巢中蛋白水平低(1.73μg／tick)；吸血后迅速提高(15.60μg／tick)，约为饥饿期的9倍；进入交配期蛋白水平持续增加(26.72μg／tick)；饱血当天和饱血后2d蛋白 如夕l‘万艺论义.!，之摘要含量分别为99.33 pg八i。k和372.49“g八iek:刚产卵时达到址大值(1512.91pg/tiek):产卵Zd以后，蛋白含量降至1184.18pg八iek。 4.饥饿期卵巢中蛋白带少，只有l条主带，吸血初期和交配期明显增多，刚饱血时最多，这叁个阶段的一L带基本相同，共巧条主带:饱血以后至产卵期.主带发生变化，相对分子量为97 KD、9一KD、64 KD、 54 KD、53 KD的主带缺失，饱血后Zd、3d、刚产卵和，，’，:卵后Zd四个时期的主带基本相同，有9条。 5.首次确定长角血蟀的卵黄蛋自只有一种，经苏月·黑B和希夫试hlJ染色呈阳性，是一种血.糖脂复合蛋自，山H个亚从组成，亚荃相对分子员分别为1 12 KD、103 KD、80 KD、78 KD、71 KD、68 KD、62 KD和52 KD。 6.保幼激素和蜕皮激素均影响长角血蝉的卵黄发生。局部施用保幼激素类似物法尼醇，10“g和50“g显着提.岛交配期雌虫卵巢中蛋白含员;50 pg使饱血当天雌虫卵巢蛋白含量明显增加，显着提高卵巢中vn的含‘量;剂量大于100“g，呈现毒副作用;法尼醇对卵巢中蛋自的亚基组成没有影响。体外培养饱血当天雌虫的卵巢，培养液中含有不同浓度的20一轻基蜕皮酮(20一E)。1.00 ng/pl的20一E能显着提高卵巢蛋白含量，促进卵巢对卵黄原蛋白的吸收:浓度为5.00 ng/pl时，作用相反，并且2.50 ng/pl和5.00 ng/pl的20一E使vn在电泳中的迁移率发生·定的变化。_!几述结果表明，保幼激素和蜕皮激素共同参与调控蟀类的生殖，均对卵黄发生有作用。 上述研究结果显示，雌性生殖系统由多个部分组成;卵巢的结构、蛋白含量和成分随发育的不同阶段发生一系列动态变化;卵黄蛋白是一种含血红素、搪类、脂类和各种氮基酸的复杂性复合蛋白:在一定剂量范围内，保幼激素和蜕皮激素均对卵黄发生有影响。
罗建勋[10]2004年在《巴贝斯虫未定种的发现及牛巴贝斯虫病的免疫诊断和药物防治研究》文中提出牛巴贝斯虫病(Bovine babesiosis)是由媒介蜱传播的巴贝斯科巴贝斯属的多种病原体寄生于牛的红细胞内所引起的血液原虫病的总称。本病以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿为主要特征，严重时常常引起发病动物死亡。本病在我国分布广、危害严重，常常给疫区的养牛业造成巨大损失。尽管我国的研究人员已对本病的病原学、流行病学、诊断及综合防制技术等方面进行了大量研究，但仍不能满足畜牧生产中巴贝斯虫病防治需要。本研究以牛的巴贝斯虫为研究对象，采用传统技术与分子生物学技术相结合的方法对在我国已分离的牛巴贝斯虫病主要病原进行了分类学研究，在实验室内运用蜱传播试验对分离于我国新疆的牛的巴贝斯虫未定种的媒介蜱及其传播方式进行了详细的研究，采用组织抹片方法对牛的巴贝斯虫未定种在小亚璃眼蜱饱血雌虫体内的发育过程进行了观察；建立了间接血球凝集试验诊断方法，并对其在血清学调查中的应用效果进行了考察；研制了咪唑苯脲缓释注射剂，并通过实验室工作和田间试验对防治效果进行了评价。其主要研究结果总结如下： 一．在我国新疆首次发现了一种由璃眼蜱传播的牛的巴贝斯虫，并对其形态学特性、媒介蜱及致病性进行了描述。当使用新疆喀什地区莎车县黄牛体表寄生的饱血、半饱血的小亚璃眼蜱之子代蜱进行环形泰勒虫病的传播试验时，意外的发现了一种牛的巴贝斯虫，试验结果显示，小亚璃眼蜱的若虫可将该种巴贝斯虫传播给牛，而未发现幼虫(0／1)和成虫(0／2)传播该病原的证据。同时，对动物红细胞和小亚璃眼蜱血淋巴内的病原形态进行了描述，红细胞内病原的形态为多形性，可为空泡形、圆形、卵圆形、环形和成对梨籽形，有时在一个细胞内可存在2～6个裂殖子，单个虫体的量度为1.5～5.0μm×1.2～3.0μm，而成对卵圆形虫体为1.78μm×1.08μm，成对梨籽形虫体的大小为2.77μm×1.60μm；小亚璃眼蜱血淋巴内大裂殖子的大小为11.8～14.5μm×2.1～4.1μm；该病原对健康动物致病性较低，但通过染虫血液的转移可引起除脾动物发生典型的巴贝斯虫病症状。 二．采用蜱传播试验，研究了璃眼蜱蜱种、长角血蜱和微小牛蜱对牛的巴贝斯虫未定种的传播能力与传播方式：为了确定小亚璃眼蜱、残缘璃眼蜱、麻点璃眼蜱、长巴贝斯虫未定种的发现及牛巴贝斯虫病的免疫诊断和药物防治研究角血蟀和微小牛蟀对在我国分离的牛的一种未命名的巴贝斯虫的传播能力与传播方式而进行了研究。在实验室内饲养、繁殖上述蟀种，待发育至饥俄成虫时，将它们分别饲喂于用巴贝斯虫未定种感染的牛体上，收集虫血症期间饱血脱落的雌虫，待雌虫产卵并孵出幼虫后，用次代蟀进行经卵传播试验.结果显示:小亚璃眼蟀雌虫感染后，其次代幼虫(2/4)、若虫(6/6)和成虫(3/8)均能传播该病原;残缘璃眼蟀和麻点璃眼蟀的雌虫获得感染后，其若虫(2/2)和成虫(2/2)阶段也可传播该巴贝斯虫，但幼虫(0/2)不能传播;长角血蟀和微小牛蟀均不能经卵传播该巴贝斯虫;用小亚璃眼蟀的幼虫和若虫在巴贝斯虫未定种感染的动物体上吸血后，再用它们所发育的若虫和成虫进行传播试验时，获得的结果均为阴性，说明小亚璃眼蟀不能以阶段性传播的方式传播该病原。从以上结果可以看出，本实验室所分离的牛的巴贝斯虫未定种可被璃眼蟀属的多个蟀种经卵传播，但不能被长角血蟀(卵形巴贝斯虫的传播媒介)和微小牛蟀(牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的传播媒介)传播，也不能被璃眼蟀以阶段性传播方式传播，说明该病原属于巴贝斯虫，并且与目前我国已报道的巴贝斯虫种类存在明显区别. 叁.采用蟀传播试验调查了小亚璃眼蟀在梨形虫病传播中的流行病学意义:通过在实验室内的人工饲养繁殖，将采自新疆野外的小亚璃眼蟀进行净化，获得清洁的媒介蟀，将其饥俄成虫饲喂于巴贝斯虫未定种感染的动物体表，收集饱血雌虫，并置于28℃、相对湿度80一90%条件下进行产卵孵化，所孵育出的幼虫、若虫被再次饲喂于环形泰勒虫感染的动物体表，观察感染有巴贝斯虫未定种的小亚璃眼蟀的幼虫和若虫能否再次被环形泰勒虫感染，并通过传播试验调查小亚璃眼蟀对这两种梨形虫的传播能力。实验结果表明:巴贝斯虫未定种感染的小亚璃眼蟀可再次被环形泰勒虫感染，其若虫和成虫可在一次传播试验中将两种梨形虫一一环形泰勒虫和巴贝斯虫未定种同时传播给实验动物，并且在潜伏期、染虫率等指标方面基本保持不变。 四.牛的巴贝斯虫未定种在小亚璃眼蟀饱血雌虫体内的发育形态观察:通过实验室繁殖净化获得小亚璃眼蟀饥饿成虫，将其置于巴贝斯虫未定种感染的实验牛的体表吸血，收集饱血脱落的雌虫，并将其置于28℃、相对湿度80%的条件下进行孵育，每天取两只蟀在实体显微镜下进行解剖，分离蟀的血淋巴、中肠、卵巢(包括卵和输卵管)及唾液腺，制备组织涂片，经甲醇固定、姬姆萨染色后，观察巴贝斯虫未定种自蟀饱血脱落到产卵结束期间在蟀体内各器官的移行规律及发育形态.结果显示:巴贝斯虫未定种首先在蟀的肠道内发育，经一系列未知的变化后，在蟀饱血脱落5天内形 2摘要成运动体，随后，几乎同时可在肠道、血淋巴、唾液腺及卵巢内发现大裂殖体?
参考文献：
[1]. 长角血蜱雌虫唾液腺结构与分泌活性的研究[D]. 李健. 河北师范大学. 2002
[2]. 长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA文库的构建及免疫学筛选[D]. 谢俊仁. 甘肃农业大学. 2007
[3]. 蜱唾液腺蛋白Salp20的补体抑制机制和卵黄发生的激素调控[D]. 杨晓红. 河北师范大学. 2013
[4]. 长角血蜱生物学特性研究及免疫原基因的筛选[D]. 李知新. 甘肃农业大学. 2007
[5]. 镰形扇头蜱唾液腺及其表达序列标签的研究[D]. 张维谊. 广西大学. 2004
[6]. 两种硬蜱雄性性腺功能因子的研究[D]. 周丽峰. 河北师范大学. 2011
[7]. 小亚璃眼蜱的生活史和抗菌多肽活性的研究及牛环形泰勒虫病二温式PCR检测方法的建立[D]. 王振宝. 新疆农业大学. 2009
[8]. 长角血蜱精巢与附腺发育、蛋白质分析及激素调节[D]. 魏转. 河北师范大学. 2004
[9]. 长角血蜱卵巢发育与卵黄发生的研究[D]. 杨小龙. 河北师范大学. 2003
[10]. 巴贝斯虫未定种的发现及牛巴贝斯虫病的免疫诊断和药物防治研究[D]. 罗建勋. 南京农业大学. 2004