（1天津医科大学第二医院 心脏科 天津心脏病学研究所 天津300211
2 天津市滨海新区大港医院 急诊科 天津 300270
3 天津市胸科医院 心脏科 天津300350
摘 要： 目的 研究氯沙坦、辛伐他汀单独以及联合应用对兔动脉粥样硬化的影响和机制。方法 46只新西兰雄性大白兔适应性喂养1周后随机分为空白对照组、高脂组、氯沙坦组、辛伐他汀组、氯沙坦+辛伐他汀组，观察各组药物干预前后体重、血脂、炎症因子的变化。结果 动脉粥样硬化模型建立后，高脂组及药物干预组血脂水平显著高于空白对照组（P<0.05）,高脂组与药物干预组间比较无统计学差异。药物干预8周后，药物干预组IL-6、MCP-1均明显低于高脂组（P<0.05），氯沙坦+辛伐他汀组IL-6较氯沙坦组、辛伐他汀组无差异（P>0.05），MCP-1较氯沙坦组有明显下P<0.05），氯沙坦与辛伐他汀组组间无差异（P>0.05）。氯沙坦组、辛伐他汀组PPARγ无明显差异（P>0.05），氯沙坦+辛伐他汀组PPARγ较其他组别明显升高（P<0.05）。药物干预组比高脂组内膜中膜厚度比均有显著下降（P<0.05），氯沙坦+辛伐他汀组较氯沙坦组、辛伐他汀组明显降低 P<0.05）。结论 氯沙坦及辛伐他汀均能显著减少内膜中膜厚度比，稳定血管斑块，联合治疗具有更强的延缓动脉粥硬化进程的作用，独立于降低血脂的抗动脉粥样硬化作用可能与降低炎症因子密切相关。
关键词：氯沙坦 辛伐他汀 白介素-6 单核细胞趋化蛋白-1 过氧化物酶体增殖物激活受体γ
【中图分类号】R543.5【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)09-0122-02
中图分类号：R543.5 文献标识码：B
Synergetic effect of losartan and simvastatin on atherosclerosis related factors in rabbits
ZHANG Zong-yan1.2, XU Yan-Min1 , LIU Yuan-ying3
（1.Department of Cardiology ,Tianjin Institute of Cardiology，the Second Hospital of Medical University，Tianjin 300211；2. Emergency department ,Dagan g Hospital of Tianjin Binhai New Area,Tianjin 300270,China；3 Department of Cardiology ,Tianjin Thoracic Hospital, Tianjin 300350, China）
ABSTRACT: Objective To investigate the effect and mechanism of simvastatin and losartan synergistically inhibite the atherosclerosis progression in rabbits. Methods 46 New Zealand male rabbits adaptive feeded after 1 week were randomly divided into five groups: normal control group(NC group), high-cholesterol group(AS group), Losartan group(L group), Simvastatin group(S group) and Losartan Simvastatin group(LS group).The level of weights, lipids and inflammatory factors were detected before and eight weeks after the drugs intervention. Results After we builted the AS model, the lipid level of AS group and drug intervention group were higher compared with NC group. There was no significant difference (P> 0.05) between AS group and drug intervention group. After 8 weeks drugs intervention, the IL-6 and MCP-1 level in drugs intervention group were significantly lower (P <0.05) than AS group. There was no significant difference between IL-6 level at 12th week in LS group and S group at same point
of time (P> 0.05 ).MCP-1 level at 12th week in LS group compared with L was significantly lower(P< 0.05 ).There was no difference between L group and S group（P>0.05）. L,S groups compared with AS group were no significantly difference (P> 0.05 ).12th week PPAR-γ level in LS group was significantly increased compared with other groups（P>0.05）. The intima-media thickness ratio (I/M) in L group, S group and LS group compared to AS group were significantly decreased (P <0.05). I/M in LS group compared with L and S group were importantly decreased (P <0.05). Conclusion losartan and simvastatin could significantly reduced I/M and made the plaque stable. The combined treatment played an important role in slowing down the atherosclerosis development. The anti-atherosclerosis effect was independent of reducing the lipid level and maybe closely related to reducing the inflammation factors.
KEY WORDS: Losartan； simvastatin； Interleukin-6；Monocyte chemoattractant protein-1；Peroxisome roliferators-activated receptors γ
动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是动脉血管壁粥样斑块进行性积聚，最终导致血管堵塞的病理过程，是一种炎症性疾病。炎症能够促进血栓的形成，造成斑块的不稳定，不稳定斑块的破损是造成AS晚期并发症心肌梗死和中风的主要原因[1]。氯沙坦为AT1型受体，阻断AngII介导的生物学效应，发挥独立于降压的降低炎症因子的作用，辛伐他汀为他汀类降脂药物，具有显著的抗炎、稳定斑块、抑制平滑肌增生、改善内皮功能的作用。在临床中，kwang等人研究氯沙坦联合辛伐他汀治疗高胆固醇血症和高血压的病人，指出联合治疗有协同作用在内皮功能的改善和降低炎症因子，预测比单一用药更能减少高胆固醇血症和高血压患者的心血管事件[2]。该研究主要通过观察氯沙坦联合辛伐他汀对兔动脉粥样硬化炎症因子的影响，探讨两种药物联合应用对动脉粥样硬化的影响及机制。
材料和方法
1.1 分组 健康纯种新西兰雄性大白兔46只，周龄为4-6周，体重（2.24±0.87）kg。室温15℃～20℃，按需饮水，适应性喂养1周，稳定血脂水平和代谢状况，排除饮食异常者，按照随机数字表法将大白兔随机分为五组：空白对照组（N=8）喂食普通饲料100g，早晚各50g；高脂组（N=11）喂食高脂饮食（1%胆固醇+5%猪油+10%蛋黄粉+84%普通饲料100g ，早晚各50g ；氯沙坦组（N=9）、辛伐他汀组（N=9）、氯沙坦+辛伐他汀组（N=9）同高脂组喂养。高脂组、氯沙坦组、辛伐他汀组、氯沙坦+辛伐他汀组进行右侧颈动脉球囊损伤术，空白对照组同时行假手术。4周末称重，取耳缘静脉血测定血脂水平和血清炎症因子，氯沙坦组、辛伐他汀组、氯沙坦+辛伐他汀组在高脂饮食的同时，分别加用氯沙坦钾片（科素亚）25mg·kg-1·d-1、辛伐他汀片（舒降之）5 mg·kg-1·d-1、氯沙坦钾片（科素亚）25mg·kg-1·d-1+辛伐他汀片（舒降之）5 mg·kg-1.d-1口服，再喂养8周。12周末称重，取耳缘静脉血再次测定血脂水平和炎症因子。将动物处死，取颈动脉硬化斑块明显处的血管组织于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定24小时，备病理检测。研究期间及时移除死亡动物尸体，以免对环境造成污染。
1.2 实验方法 实验兔于术前12h禁食，不禁水，用3%戊巴比妥钠（0.5-1ml·kg）经耳缘静脉麻醉，待麻醉平稳后，仰面固定，颈部备皮，常规消毒铺巾，行颈正中切口，长度约4-5cm，暴露至甲状软骨上方水平，并分别游离右颈总动脉（common carotid artery,CCA）、右颈内动脉(internal carotid artery,ICA)以及右颈外动脉（external carotid artery，ECA）。于ECA远心端，距离ICA、ECA分叉处约2cm使用丝线结扎，动脉夹临时夹闭ICA及CCA，将ECA结扎处丝线提起，使用眼科剪于ECA结扎处下游剪出约1mm的切口，送入球囊，注入生理盐水至球囊内，维持4atm压力，松开CCA处动脉夹，送入球囊至10cm左右，增加球囊内压力至8-12atm，缓慢回拉球囊至剪口处，回抽球囊内液体保持4atm压力，再次将球囊送达深处，重复上述操作3次，退出球囊，结扎ECA剪口下游，松开ICA及CCA处动脉夹，观察血管搏动及伤口情况，如有出血点结扎止血。生理盐水、安尔碘清洗术野，腿部肌肉注射庆大霉素4万单位预防感染，逐层缝合切口。空白对照组行假手术，不插入球囊，其余步骤同上。
实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。
1.3 血脂、炎症指标的检测 实验动物喂养4周末，耳缘静脉采集静脉血4 ml，药物干预8周后，即处死前，再次耳缘静脉采集静脉血4 ml。血样静置30 min，以4000r ·min速度离心10min，取上层血清进行分装， - 80℃冻存。应用酶法测定血脂，应用Selectra-E全自动生化仪进行检测。应用ELISA法检测白细胞介素6 ( IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）。
1.4 内膜中膜厚度的检测 12周末静脉采血后，采用空气栓塞法处死（耳缘静脉注射空气15ml），立即剪开颈部皮肤，分离两侧颈总动脉，右侧从颈外动脉结扎处剪断，留取长度约4cm，左侧同样留取长度约4cm的颈总动脉， 将留取的血管固定于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液24小时，脱水、石蜡包埋切片及HE染色操作后，显微镜下观察并测量血管内膜、中膜，取其均值，并计算两者的比值。
1.5 统计学方法 实验数据用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，同一受试对象前后比较采用配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 4周末，高脂组（AS组）、氯沙坦组（L组）、辛伐他汀组（S组）、氯沙坦+辛伐他汀组（LS组）与NC组比较血脂均有明显升高(P<0.05)，各组间无差异。12周末，AS组、L组、S组、LS组与NC组比较TC、LDL-C均有显著升高(P<0.05)，其中AS组、L组TG与NC组比较明显升高(P<0.05)，S组、LS组与NC组TG比较无差异。12周末，L组血脂水平与AS组比较无明显差异，S组、LS组血脂较AS组有明显下降(P<0.05)，LS组、S组对比无明显差异。12周末L组血脂水平较4周末血脂明显升高(P<0.05)，而12周末S组、LS组血脂水平较4周末血脂有明显下降(P<0.05)。见表1。
2.4 各组内膜中膜厚度比较 空白组，内膜光滑完整，无斑块形成。高脂组内膜显著增厚，
管腔呈不规则偏心性狭窄，部分可见管腔堵塞，内膜不完整，主要由大量泡沫细胞组成，中膜血管平滑肌细胞减少，排列紊乱，可见内弹力膜分离断裂，突破内弹力板向内皮下迁移，重度狭窄可见中膜变薄，平滑肌减少，泡沫细胞浸入。氯沙坦组：内膜增厚，与高脂组比较明显减轻，可见纤维帽，中膜变薄，并且泡沫细胞向中膜浸入，内弹力膜完整，中膜胶原纤维增生。辛伐他汀组：内膜增厚，呈偏心性狭窄，内弹力膜较完整，平滑肌细胞排列较整齐，未向内膜浸润生长，内膜、中膜界限清楚，斑块明显减小。氯沙坦+辛伐他汀组：可见内膜增厚，较高脂组明显减轻，内膜较完整，间断较少，内弹力膜完整，中膜平滑肌细胞排列规整，未侵入内弹力膜（图1）。12周末，AS组、L组、S组、LS组内膜厚度（I）及内膜中膜厚度比(I/M)与NC组显著增高（P<0.05），给药组比高脂组I及I/M均有显著下降，LS组I及I/M较L组、S组均有显著下降（P<0.05）。见表4。
讨论
动脉粥样硬化（atherosclorosis，AS）斑块中大量脂质和炎症细胞，单核细胞迁移到内皮下，变成巨噬细胞，吞噬含胆固醇的脂蛋白，形成泡沫细胞，形成脂质条纹。AngII可诱导血管炎症和血管重塑促进AS。他汀类药物除降脂作用外，还能抑制炎性细胞向病变处迁移及炎症因子释放，抑制平滑肌细胞增殖，促进斑块稳定，改善内皮功能，抑制细胞凋亡。氯沙坦能选择性阻断AngII AT1型受体，阻滞AngII生物学效应，在治疗原发性高血压同时，还能降低炎症因子的水平，如IL-6、TNF-α，hs-CRP[3]。
该研究通过球囊损伤及高脂饲料喂养建立AS模型，12周末，高脂组及氯沙坦组较正常组TG、TC、LDL-C明显升高，组间无差异，辛伐他汀组及氯沙坦+辛伐他汀组血脂较高脂组明显降低，组间无差异，可见氯沙坦对血脂水平没有影响，辛伐他汀降脂作用明显，能发挥抗AS作用。高脂组12周后病理观察颈动脉存在严重狭窄，炎症因子IL-6、MCP-1增高更加明显，可见炎症因子的增加与AS严重程度相关。8周药物干预后，发现用药组内膜中膜厚度比对比高脂组明显降低，联合用药组优于单独用药组，对兔血清的IL-6、MCP-1进行检测，结果显示：12周末，氯沙坦及辛伐他汀组与高脂组比较均能显著降低IL-6、MCP-1水平。在临床实验中，血清IL-6水平斑块组较无斑块组有显著增高，提示颈动脉粥样硬化斑块范围越大、严重程度越高，血清IL-6水平也越高[4]。血管紧张素II可以诱导血管炎症和血管重塑促进动脉粥样硬化。AngII能刺激MCP-1、IL-8、TNF-α和IL-6的产生[5]。氯沙坦为AT1受体拮抗剂，研究表明氯沙坦具有抗炎作用，能降低IL-6水平[6]。辛伐他汀显著降脂的同时，还能发挥重要的抗炎、改善内皮功能、抑制血小板聚集及血栓形成和稳定斑块的作用。kwang等人的研究中显示辛伐他汀能显著降低IL-6水平[7]，研究中结果与之相符，氯沙坦、辛伐他汀及氯沙坦+辛伐他汀组均能降低IL-6水平，组间未见差异。氯沙坦降低MCP-1水平，可能与降低AngII水平有关，降低NF-κB的活化，减少MCP-1表达，辛伐他汀能直接抑制NF-κB而减少MCP-1的表达。Koh, K. K.等临床实验中，联合氯沙坦和辛伐他汀在高胆固醇血症和高血压的病人中的治疗，显示辛伐他汀单独治疗、联合治疗、氯沙坦单独治疗降低血清MCP-1水平与基线相比分别降低了7±3%、15±3%和5±4%，联合治疗组比单独用药组明显降低了MCP-1水平[2]，这与该研究结果相符。在动脉粥样硬化的慢性炎症中，PPARγ可以下调黏附分子的表达，减少炎症细胞聚集，减少炎症介质的释放，抑制单核/巨噬细胞向泡沫细胞的转化，减少内皮细胞的迁移[8]。在张瑞英等的实验[9]中， PPARγ与LDL、TG、FPG负相关，冠心病患者血清PPARγmRNA表达，与冠状动脉病变支数、病变类型呈负相关。Schupp等的研究指出，氯沙坦的血清代谢物EXP3179，而非有AT1受体阻断作用的代谢物EXP3174，在体外能显著的激活PPARγ的活性和刺激脂蛋白靶基因的表达。服用氯沙坦100mg/d的高血压患者的药物代谢物EXP3179能够在体外实验单核细胞中增加PPARγ靶基因的表达[10]。他汀类能增加PPARγ表达，推测的机制有：增加PPARγDNA结合域的活性，使其与PPARγ反应元件的结合增强[11]；对PPARγ有直接激活作用[12]；通过促使细胞内PPARγ内源性配体的产生来激活PPARγ。研究中，辛伐他汀的8周治疗PPARγ水平较高脂组及4周有所提高，但未达统计学意义，联合治疗组PPARγ水平显著提高，这与氯沙坦及辛伐他汀对PPARγ的激活有关，PPARγ的激活能够进一步调节脂质代谢、糖代谢、脂肪代谢等等，发挥抗动脉粥样硬化稳定斑块的作用。
辛伐他汀和氯沙坦的联合治疗可能是一些相互作用的机制引起的一些额外益处。AngII是很强的内源性血管收缩剂，LDL能诱导AT1受体的上调[13]。而且，高胆固醇血症兔能通过激活AngII活性来增强血管AT1受体的表达[14]。此外，他汀能逆转因AngII升高的血压伴随AT1受体浓度的下调[15,16]。AngII促进超氧阴离子的产生和内皮功能受损[17,18]。CRP在血管平滑肌细胞能上调AT1受体，这能被氯沙坦抑制[19]。他汀类药物及ARB类药物可能在干预NF-κB信号通路上能共同作用干预炎症因子。
在人类和动物实验中，他汀能显著抑制前炎症因子的释放来抑制炎症，氯沙坦可能调节血管平滑肌细胞增殖，通过抑制脱氧核糖核酸的合成和调节其他功能，比如AngII诱导的组织型纤溶酶原激活剂、金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制因子[20]。在他汀和ARB类药物联合应用时，有些信号传导通路是相互影响的，如NF-κB信号传导通路、PPARγ、CD40/CD40L等，两种药物独立应用均能发挥抗动脉粥样硬化炎症的作用，联合用药也显示出了协同作用，抑制内膜的增生，抑制平滑肌细胞的增殖，抑制泡沫细胞的形成，降低炎症因子的表达。
总之，对于有高脂血症高血压的患者来说，两药联合应用不仅能降低这两种危险因素对动脉粥样硬化的影响，还能减少动脉粥样硬化炎症、稳定斑块，提高胰岛素敏感性，抑制动脉粥样硬化进展，以减少急性心血管事件发生的作用。
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论文作者:张宗艳1.2，, 徐延敏*，,刘远莹3
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年9月
论文发表时间:2016/10/31
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