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【摘要】 目的：建立一种无创性甲基化PCR对亨廷顿病HTT基因(CAG)n重复序列进行检测的基因诊断方法。方法：通过采集患者口腔粘膜脱落细胞，提取DNA。使用亚硫酸氢盐修饰试剂对DNA进行修饰，降低其CG%。然后进行亚硫酸氢盐测序法PCR（BSP）和琼脂糖凝胶电泳。结果：患者的（CAG）n片段皆可顺利扩增，并且能检测出高达90次重复的(CAG)n的样品。结论：通过分子水平上使用无创性甲基化PCR方法，对 (CAG)n片段长度进行检测。对未发病的有亨廷顿病家族史的人群和疑似患病的散发患者进行早期基因诊断和鉴别诊断具有重要意义。
【关键词】 亨廷顿病；甲基化；PCR
【中图分类号】R392 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）06-0163-02
亨廷顿基因(huntingtin，HTT)的(CAG)n重复序列异常增加是导致亨廷顿病(Huntington disease , HD)的主要原因[1]。HD是一种迟发性常染色体遗传病，患者一般中年发病，发病前较难通过临床表征进行诊断。HTT基因定位于4p16.3[2]。HD患者病情严重程度同CAG重复次数呈正相关[3]。
HTT基因的(CAG)n重复序列下游还有另一个重复序列(CCG)n，因此该区段GC含量极高，GC%在局部区域达到100%，形成复杂二级结构，DNA模板难以打开，往往导致高重复次数(CAG)n的 PCR以失败告终。故难以对亨廷顿病患者的(CAG)n的重复次数进行测量。[4-5]
本研究基于无创性的DNA获取方法，利用亚硫酸氢盐修饰，将HTT基因(CAG)n的胞嘧啶（C）转换成尿嘧啶（U），从而降低DNA模板的CG%，使PCR能成功扩增。实现对患者(CAG)n重复次数的无创性检测。
1.资料与方法
1.1 一般资料
标本收集主要来源于2009年9月至2012年5月于郑州大学附属洛阳中心医院神经内科就诊的患者。3例为散发型HD患者，1个HD家系。散发病例符合临床三联症（舞蹈、痴呆和人格障碍），无HD家族史，2例男性，1例女性，平均发病年龄（49.6±5.3）岁。HD家系来自河南省，符合常染色体显性遗传系谱特点（图1）。患者知情同意后，采集患者及家系中正常表型者的唾液2ml，进行DNA检测。[6]
1.2 方法
1.2.1唾液中脱落口腔黏膜细胞DNA的提取 在装有0.1mL唾液的离心管中加入生理盐水，反复吹打后，2,000g离心5min以除去上清。重复该过程一次。再用生理盐水将其体积调至200?l。随后使用Qiagen公司的QIAamp DNA Mini and Blood Mini Kit进行DNA提取。
1.2.2 DNA的亚硫酸氢盐修饰 取20?l的DNA溶液，使用Qiagen公司的EpiTect Bisulfite Kit进行亚硫酸氢盐修饰。
1.2.3 DNA的PCR检测 选取家系中患者III3的DNA作为模板，上游引物5’-CTGGAAAAGCTGATGAAGGC-3’，下游引物5’-TGGGTTGCTGGGTCACTCT -3’。使用Takara Taq PCR试剂，反应体系为25?l：10X PCR Buffer 2.5?l，MgCl2（25mM） 3?l，dNTPs（10mM each）2?l，Taq 0.3?l，上下游引物（10?mol/L）各1?l，DNA 2?l。分别在体系中加入以下PCR添加剂：5%的DMSO、10%的DMSO、0.5M甜菜碱、1M甜菜碱。再分别使用Takra公司的GC Buffer I，GC Buffer II进行测试。使用ABI 9700PCR仪，反应条件为94℃ 4分钟，然后94℃ 30秒，56℃ 1分钟，72℃ 1分钟共40循环，72℃ 7分钟。PCR结束后，产物于2%琼脂糖凝胶进行电泳。
1.2.4修饰后DNA的BSP PCR检测 选取患者III3的亚硫酸氢盐修饰后DNA，上游引物5’-GGGACGGGTTTAAGATGG-3’，下游引物 5’-ACGACTCCTCAACCACAACC-3’。使用Takara Taq PCR试剂，反应体系和条件同上，不加入任何PCR添加剂。产物于2%琼脂糖凝胶进行电泳。同时将大片段产物进行克隆和测序。计算(CAG)n的重复次数。
1.2.5样品的BSP PCR检测 对散发病例和家系的样品进行BSP PCR，产物于2%琼脂糖凝胶进行电泳。根据电泳图估计其(CAG)n的重复次数。
2.结果
2.1 PCR检测结果比较
将正常体系、分别使用6种PCR添加剂的体系与BSP PCR体系在同一电泳图中进行比较（图2）。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆可看出，由于(CAG)n所在区域的GC%太高，DNA形成复杂二级结构，DNA模板难以打开，无法扩增出目的条带。而经过修饰后的DNA，(CAG)n变为(TAG)n，(CAG)n 下游的(CCG)n区域，依据其甲基化情况，变为(TTG)n或(TCG)n。GC%下降，患者III3的BSP PCR能顺利扩增出约600bp的目的条带。
2.2 患者BSP PCR产物的测序结果
患者III3的BSP PCR的600bp产物的克隆测序结果如下。经过EpiTect Bisulfite Kit修饰后，胞嘧啶（C）转换为鸟嘧啶（U），通过后续的PCR，变为胸腺嘧啶（T），即 (CAG)n转换为(TAG)n，而当修饰不完全时，(CAG)序列不改变。
2.3 散发病例、家系的BSP PCR结果
3名散发病例和家系中3名患者各出现约400bp的正常条带及450bp至600bp的异常条带。异常条带的(CAG)n的重复次数约为40至90次。家系内表型正常者仅出现一条约400bp的正常条带。正常条带的(CAG)n的重复次数约为20次。
3.讨论
本研究通过无创性的、甲基化PCR方法，建立一种对亨廷顿病患者HTT基因 (CAG)n片段长度进行检测的方法。
HTT外显子1中有(CAG)n的重复序列，正常人重复次数在11～34次范围，亨廷顿病患者一般大于40次。研究认为不同的CAG重复次数与发病严重程度是有关联的[7]。同时也对传代过程中是否发生扩展突变，导致后代患病具有指示作用。因此对CAG重复次数的检测非常重要。
亨廷顿病是一种遗传性疾病，多数亨廷顿病患者有家族史，其临床症状包括三方面，运动障碍、认知障碍和精神障碍[8] 。目前亨廷顿病的临床诊断存在以下问题。一是患者发病年龄晚，通常在30至50岁时发病，不能早诊断早预防。患者突然发病后将对其家庭和社会带来沉重的负担；二是亨廷顿病与家族性棘红细胞增多症等有类似临床症状。特别是没有家族史的散发型患者，难以进行精确辨别；三是HTT基因的(CAG)n存在传递不稳定现象，特别在父系传递过程中常常导致异常重复次数的明显增多。如有一种产前诊断的方法，可提前筛查出(CAG)n的重复次数，或可有效阻断(CAG)n的异常重复次数跨代增加。四是(CAG)n异常重复次数过大时，普通PCR难以对其进行扩增。容易导致误诊。
HTT基因(CAG)n和下游的(CCG)n重复序列的CG%太大，分别为66.7%和100%。导致DNA形成复杂二级结构，TM值过大，双链难以打开，PCR不能进行。为了降低TM值，过往研究会使用DMSO，甜菜碱，GC buffer，甚至昂贵的7 deaza-dGTP等PCR添加剂。但本研究发现，当(CAG)n异常重复序列过大时，加入PCR添加剂并不能改善其扩增效果。即使对反应条件和Mg离子进行优化（数据未列出），目的条带依然扩增不出来。
本研究利用亚硫酸氢盐试剂对DNA进行修饰，非甲基化状态下的胞嘧啶（C）转换为鸟嘧啶（U），通过后续的PCR，变为胸腺嘧啶（T）。甲基化的胞嘧啶（C）则不发生改变。从而使 (CAG)n转换为(TAG)n，CG%从66.7%降低至33.3%；而其下游的(CCG)n根据其甲基化状态，转换为(TTG)n或(TCG)n，CG%从100%降低至33.3%或66.7%。后续在正常PCR条件下，即可将重复次数为91的(CAG)n的DNA扩增出来并顺利测序。同时使用该方法，对其家系和若干散发病例进行检测，都得到预期结果。
本研究建立了一种简便、适合临床应用的亨廷顿病分子检测方法。采用唾液取样的无创性DNA获取方式，可有效增加病人及其家属的依从性。使用亚硫酸氢盐的修饰方法可有效降低目的基因的TM值，无需优化PCR条件下，即可扩增出高重复次数的(CAG)n。该方法对亨廷顿病的确诊、未发病的有亨廷顿病家族史的人群和疑似患病的散发患者进行早期基因诊断和鉴别诊断都具有重要意义。也对HD家系中HD携带者进行产前诊断提供了指示作用。
【参考文献】
[1] The Huntingtons disease collaborative research group. A novel gene containing a trinueleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes[J]. Cell. 1993, 72(6): 971-983.
[2] Gusella JF, Wexler NS, Lonneall y PM, et al. A polymorphic DNA marker genetically linked to Huntington’s disease[J]. Nature.1983,306(5940):234-238.
[3] Trottier Y, Biancalana V, Mandel J L.Instability of CAG repeats in Huntington’s disease relation to parental transmission and age of onset[J]. J Med Genet. 1994, 31(5):377－382．
[4] Andre SE, Goldberg YP,Krem er B, et al. The relationship between trinuceotide (CAG) repeat length and clinical features of Huntington’s disease[J]. Nature Genet.1993, 4(4): 398-403.
[5] Harper PS. A specific mutation on Huntington’s disease[J]. J Med Genet.1993, 30(12): 975-977.
[6] 陈嘉昌,张红宇,彭瑾瑜等.从唾液获取人体DNA的简易方法与应用[J].中山大学学报(医学科学版).2006,z2：171-173.
[7] 宋兴旺,王玉良,曾涛等. Huntington舞蹈病的临床及IT15基因三核苷酸重复突变特征[J].实用医学杂志.2009, 25(23): 3459-3461.
[8] Gambardella A, Muglia M, Labate A, et al. Juvenile Huntington's disease presenting as progressive myoclonic epilepsy[J]. Neurology. 2001,57(4):708-711.
论文作者:任丛勉1,路林2,尹以婷2,陈嘉昌3(通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2016年2月第6期
论文发表时间:2016/5/23
标签：患者论文; 家系论文; 亚硫酸论文; 基因论文; 次数论文; 条带论文; 方法论文; 《医药前沿》2016年2月第6期论文;