张剑英[1]2004年在《酸性植酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达》文中进行了进一步梳理植酸酶是一种新型的可作为动物饲料添加剂的重要酶制剂，是一种能水解植酸的磷酸酶类。在动物饲料中富含磷的谷物、豆类和油料等作物中，磷的基本贮存形式是植酸磷，因单胃动物体内缺少能分解植酸的酶很难利用这些植酸中的磷，其利用率极低。植酸酶对提高饲料中磷的利用率以及减轻因动物高磷粪便所导致的环境污染有很大的作用。 植酸酶主要来自于植物和微生物，来源于植物的植酸酶均属于6—植酸酶，最适pH范围在5.0—7.5，不适合在单胃动物中起作用的，而且在植物中含量极低，因此植酸酶的研究方向转向最适pH值为酸性、酶含量较高的丝状真菌。 本实验成功从丝状真菌中提取出总DNA，通过PCR扩增，将此酸性植酸酶全基因通过pPIC9K vector转化酵母细胞，提取酵母转化子基因组进行PCR验证，结果表明外源基因整合到了酵母的染色体上。 提取未降解的、不含DNA与其他杂质的RNA是进行分子克隆和基因表达分析等研究的基础。由于复杂的细胞壁和内源酶活性的存在，所以要从丝状真菌中提取和纯化出有生物活性的RNA比较困难。为获得高质量的RNA，本实验比较了TRIZOL提总RNA、异硫氰酸胍法提取菌株总RNA、热硼酸法提取菌株总RNA叁种不同的提取方法，得出热硼酸法适合于富含Rnase和多糖的丝状真菌的RNA的提取，该方法可得到完整、均一的RNA样品，并且得到的RNA可用于RT-PCR等分子生物学实验操作。 本实验以丝状真菌黑曲霉的总cDNA为模板，通过PCR方法扩增到理想大小的DNA片段，分别将其与质粒pBV220连接，将正确构建的重组质粒pBV220-PhyB转化大肠杆菌D(?)5α，在温度诱导下，该基因在大肠杆菌中得到了表达，SDS-PAGE分析表达产生的蛋白约60kD，表达产生的植酸酶其最适反应PH为2.5，最适反应温度为55℃。
吴静[2]2004年在《Aspergillus niger N-2植酸酶phyA基因的克隆及其在Pichia Pastoris中的高效表达》文中认为植酸磷(肌醇六磷酸)是植物性饲料中磷的主要贮存形式,但单胃动物(如家禽、猪)因体内缺乏能分解植酸的酶而难以有效利用植酸磷,大部分植酸磷被动物直接排出体外,造成严重的磷污染。植酸磷还是一种抗营养因子,它能与多种金属离子如 Zn2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+等及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物,降低了这些营养物质的生物有效度及动物对营养物质的有效利用。 植 酸 酶 , 即 肌 醇 六 磷 酸 磷 酸 水 解 酶 ( phytase , myo-inositolhexakisphosphate phosphohydrolase,EC 3.1.3.8),是催化植酸(肌醇六磷酸)及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称,属于组氨酸酸性磷酸酶家族。作为一种新型的单胃动物饲料添加剂,植酸酶可有效提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收,并减轻动物排泄物中磷对环境的污染。多种微生物如细菌、丝状真菌、酵母等都能产生植酸酶,但天然材料中植酸酶含量太低,难以获得大量产品。利用基因工程技术构建植酸酶基因工程菌可实现植酸酶的异源高效表达;在分子水平上对植酸酶基因进行遗传操作,改善植酸酶的酶学性质如耐热性、pH适性、催化活性,提高其在动物体内的有效性,特别是植酸酶的稳定性等,将为植酸酶的大规模发酵生产和推广应用开辟广阔的前景。 本文以 Aspergillus niger N-2 为出发菌株,利用 Pichia pastoris 表达系统构建植酸酶酵母工程菌株,高效表达了有活性的胞外植酸酶 PHYA。具体结果如下: 本文以 Aspergillus niger N-2 基因组 DNA 为模板,通过 PCR 扩增出大小约为 1.4kb 的植酸酶 phyA 基因片段,扩增产物去除了黑曲霉中植酸酶基因自身的信号肽及内含子序列,包含植酸酶成熟蛋白的编码序列。将PCR 扩增产物与克隆载体 pMD 18-T 连接,筛选出阳性克隆质粒pMD-T/phyA。序列分析表明 phyA 基因长度为 1347bp,包含编码 448 个氨基酸的植酸酶成熟肽的完整序列;其核苷酸序列与 A. niger(ficuum)NRRL3135 phyA 基因(GenBank Accession No. Z16414)的同源性为 92.5%,推导的氨基酸序列同源性为 95.3%。在 phyA 编码的氨基酸序列中,存在10 个潜在的 N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr,X 为任意氨基酸),与 A. niger 1
陈伟伟[3]2015年在《碱性植酸酶的定向进化及其在不同宿主中的表达》文中研究指明植酸酶能水解植酸及植酸盐,被广泛应用于饲料添加剂。碱性植酸酶具有较高的热稳定性、底物特异性及抗蛋白酶降解能力,不仅能够满足工业化生产要求,而且能适应动物肠道环境,是一种理想的饲料添加剂。但是,相对酸性植酸酶而言,碱性植酸酶最大的缺点是酶活较低,且在酸性环境中酶活受到严重抑制。因此,本研究首先通过定向进化的方法提高碱性植酸酶在酸性及中性条件下的酶活；然后通过比较正向突变体在叁种不同宿主茵(大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌)中的定向进化规律及酶学性质,从而获得具有工业化应用潜力的重组菌株。通过分子克隆的手段从枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)中获得一个碱性植酸酶,并在大肠杆菌BL21中实现其异源表达。通过比较不同的表达方式,最终确定了用于下一步定向进化的重组菌构建和诱导条件,即以pET30a为表达载体、酶切位点为BglⅡ和XhoⅠ、去除植酸酶基因中的信号肽序列、诱导表达温度为25℃。然后以野生型碱性植酸酶基因为模板、以大肠杆菌BL21为表达宿主,通过两轮的定向进化、组合突变及饱和突变,获得了D24G、D24G/K70R/K111E/N121S、 D24G/K265N等正向突变体。在37℃、pH 7.0反应条件下,上述叁株突变体的酶活比野生型分别提高了40.35%、52.06%、55.22%；在37℃、pH 4.5反应条件下,则分别提高了76.61%、121.05%、84.21%。本研究考察了上述叁种突变体的酶学性质,包括最适pH、最适温度、pH稳定性、温度稳定性及动力学参数,结果显示突变体和野生型具有相同的最适反应温度、最适反应pH及pH稳定性,但叁种突变体的温度稳定性均高于野生型；37℃、pH 7.0反应条件下的总催化效率(Keat/Km)依次为野生型的2.32、2.31、2.10倍；而37℃、pH 4.5反应条件下则分别是1.98、2.63、2.15倍。最后将酶活差距较大的突变体D24G、S51A、K265E、S51A/K265E、 D24G/K70R/K111E/N121S及野生型在毕赤酵母GS115和枯草芽孢杆菌WB800N中实现分泌性表达。通过比较该碱性植酸酶的不同突变体在叁种表达体系中的催化特性与酶学性质,发现叁种表达体系的定向进化规律基本一致,在大肠杆菌中表达时酶活高的突变体在毕赤酵母GS115和枯草芽孢杆菌WB800N中一般也相应较高。与大肠杆菌相比,在毕赤酵母中表达的野生型和突变体的酶活及最适反应温度均有所降低,D24G的最适反应温度从60℃降到55℃,而S51A则从60℃降到50℃,推测是由毕赤酵母中的糖基化现象引起。可能由于本研究中的碱性植酸酶基因来源于枯草芽孢杆菌,在枯草芽孢杆菌WB800N中表达时,突变体及野生型的酶活均有一定幅度的增加,37℃、pH 7.0反应条件下,枯草芽孢杆菌表达的突变体D24G酶活比在大肠杆菌中表达时提高了68.32%；而且D24G的最适反应温度从60℃上升到65℃。综上所述,枯草芽孢杆菌更适合用于此碱性植酸酶突变体的表达及工业化生产。本文通过定向进化方法得到了在酸性及中性条件下酶活提高的突变株,并通过叁种表达体系之间的比较,确定了最优的碱性植酸酶表达宿主菌,为进一步探索和提高碱性植酸酶酶活使其更适用于工业化生产奠定了一定的基础。
农友业[4]2005年在《植酸酶基因的克隆及转化玉米的研究》文中研究说明玉米(Zea mays L.)是世界上第叁大粮食作物,是饲料的主要原材料之一。中国是世界上第二大玉米生产国。在玉米等植物的籽粒中,植酸(myo-inositol hexakisphosphate)是磷的主要贮存形式,植酸磷占总磷50%～80%以上。种子萌发时,植酸被植酸酶分解产生肌醇和游离的磷酸盐,作为植物幼苗生长的营养来源。动物所需要的镁、钙、铁、锌等阳离子也因与植酸结合成植酸盐而被固定,使动物不能吸收镁、钙、铁、锌等阳离子,因此,植酸盐是磷营养和矿质营养的关键因素。理论上,玉米及大豆中所含的磷能满足猪的需要,但由于植酸的存在侵饲料中约2/3的磷不能被猪利用。近20年的研究证明,猪只能利用玉米中磷的10%～20%,豆饼中磷的25%～35%,这意味着在猪生长和育肥曰粮中,由玉米和豆粕提供的磷只有约15%被利用。 由于在非反刍动物(如猪、家禽等)的消化道内缺少植酸酶而不能利用食物中的植酸,使植酸磷随粪便排出。因此高植酸粪便造成土壤及水体中磷的含量增高,从而也对环境造成影响。在饲料中添加植酸酶或将植酸酶基因转到玉米等饲料原料中,使其表达后产生植酸酶在动物的胃肠中起作用,分解饲料中的植酸,释放出磷,提高饲料中磷的利用率,提高饲料的营养价值。同时,减少磷随粪便的排出量,对提高企业经济效益及减少饲养业对环境的影响都有非常重要的意义。 基于上述原因,我们根据已发表的植酸酶基因序列设计引物,选用生长速度快,且在国内外还没有报道的米曲霉,提取其总DNA并纯化后,以此DNA为模板,首次利用PCR从米曲霉中克隆得到植酸酶基因,并将植酸酶基因序列的第一个碱基“C”改为“A”。对克隆到的植酸酶基因序列进行测序,然后将其在GeneBank里进行对比,结果我们克隆得到的植酸酶基因与植酸酶基因:GI:22901877、GI:4185609、GI:11992744、GI:17043775的同源性分别为98.7%、88.8%、84.5%和66.4%。我们将其在GeneBank进行注册(注册号为GI:47176935)。 为了证明克隆得到的植酸酶基因的有效性,我们构建了毕赤酵母(Pichia pastoris)的表达载
赵述淼[5]2004年在《烟熏曲霉植酸酶基因phyA的克隆及其在毕赤酵母中的表达》文中研究说明植酸酶是一种能将植酸磷(六磷酸肌醇)降解为肌醇和无机磷酸的酸性磷酸酶类。在饲料中添加植酸酶不但可以提高动物对磷的吸收，降低环境中磷的污染，而且能解除植酸对金属离子、氨基酸的螯合作用，大大提高饲料的利用效率。 自然界中大量高活性的植酸酶主要存在于真菌中，大多数是丝状真菌。国内外科技工作者对植酸酶基因克隆及其表达的研究已有许多成功的报道，大幅度提高了植酸酶的产量，并且实现了工业化的生产。一般认为黑曲霉(Aspergillus niger)产生的植酸酶活性最强，因此工业化生产的工程菌中的植酸酶基因大都来自于黑曲霉，但是这种来源于黑曲霉的植酸酶不能耐受较高的温度，在干燥和制粒加工过程中酶活大量丧失。而烟熏曲霉(A．fumigatus)中分离的植酸酶能够耐受90℃～100℃的高温，并且能在较宽的pH范围内降解植酸，具有较大的市场潜力。 本研究根据已发表的植酸酶phyA基因全序列设计一对引物，用PCR方法从烟熏曲霉(A．fumigatus)CCTCC AF93024总DNA中扩增到去除信号肽和内含子后约1.3kb的phyA基因编码区片段，对该片段进行了克隆及序列测定。以此片段成功构建了pPIC9K-phyA表达载体，并转化毕赤酵母GS115(Pichia pastoris)。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE电泳分析，重组转化子中植酸酶得到了有效分泌和高效表达。摇瓶诱导发酵48h发酵液中植酸酶的活性可以达到113u／mL；表达产物在pH2.0～8.0均有活性，最适作用pH为6.0，最适作用温度为60℃，并且具有较好的耐热性，90℃处理10min后仍有74％的活性。
伍洛夫[6]2005年在《土曲霉和枯草芽孢杆菌植酸酶基因的克隆及异源表达》文中指出植酸及其盐类是植物性食品和饲料中磷的主要贮存方式,植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成低磷酸化的肌醇衍生物和磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称。在饲料中添加植酸酶不但可以提高动物对磷的吸收,降低环境中磷的污染,而且能解除植酸对金属离子、氨基酸的螯合作用,大大提高饲料的利用效率,因而在国内外饲料工业中有着广泛的应用前景。 由于微生物野生菌株的产酶水平较低,制约了微生物植酸酶在生产上的广泛应用,因此提高菌株植酸酶的产酶水平是实现其产业化应用的关键。本研究的目的是克隆植酸酶基因并实现其在酵母和大肠杆菌中的异源表达。主要实验结果如下: 1.参照已发表的植酸酶基因phyA全序列设计一对引物,用PCR方法从土曲霉(Aspergillus terreus)总DNA中扩增到去除信号肽和内含子后约1.4 kb的phyA基因编码区片段。对该片段进行了亚克隆与序列测定。进一步用该基因构建了pPIC9K-phyA分泌型表达载体,并转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。以重组酵母总DNA为模板进行PCR扩增以及采用含有植酸钙的选择性培养基的初步检测结果表明:植酸酶基因(phyA)在毕赤酵母中得到了表达。重组酵母摇瓶诱导发酵132 h发酵液中的植酸酶活性可达167 u/mL;表达植酸酶在pH 2.0～8.0均有活性,最适pH为5.5,最适温度为55℃。 2.参照已发表B.subtilsi的植酸酶基因序列设计了一对引物。采用PCR法,获得不含有信号肽序列的植酸酶基因phyC的非融合表达片段,并构建成带有T7启动子的大肠杆菌植酸酶基因表达载体pET17b—phyC,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)后,以重组菌株总DNA为模板进行PCR扩增以及采用含有植酸钙的选择性培养基的验证试验结果表明:植酸酶基因phyC在重组大肠杆菌中得到了表达,表达产物具有正常的植酸酶生物活性。
陆益新[7]2016年在《隔孢伏革菌植酸酶在毕赤酵母中的高效表达研究》文中指出植酸酶作为在饲料添加剂添加于单胃动物饲料中,可提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收率,并减轻动物粪便中磷对环境的污染,植酸酶的喂养效果已得到了确认,因此具有极高的应用价值,但植酸酶在天然材料中含量太低,难以获得大量产品,价格昂贵；同时酶的热稳定性难以完全满足饲料加工的要求。因此,提高植酸酶基因的表达水平,改善植酸酶的稳定性是一个函待解决的问题。本研究按照毕赤酵母对遗传密码子的偏好性,利用重迭PCR方法人工合成6-phyA,将其插入到pPIC9K载体,构建成6-phyA整合型毕赤酵母表达载体,通过电转化转入GS115酵母细胞,并筛选出Mur高拷贝转化子,建立了隔孢伏革菌植酸酶分泌表达量高的毕赤酵母株。主要结果如下：1.根据GenBank隔孢伏革菌植酸酶编码序列成功合成34条引物,并利用重迭延伸PCR技术合成了6-PhyA基因。对合成的植酸酶序列进行了毕赤酵母密码子嗜好性分析,结果较为理想,经软件分析,其翻译为氨基酸序列与野生型100%同源。2-通过对信号肽的选择开展研究,试图通过6-PhyA本身的信号肽与仪信号肽相融合,以促进植酸酶的表达,但是效果不理想,通过用酿酒酵母细胞研究6-PhyA野生型信号肽作用,发现在强启动子GPD的驱动下,未发现其能介导6-PhyA在酿酒酵母细胞中的表达,由此证明,野生型信号肽的存在并不能促进植酸酶的表达。3.将植酸酶基因克隆到表达载体pPIC9K中,电击化转入毕赤酵母GS115,获得重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K/L6ph。经甲醇诱导72h后,产酶量达到最高峰,酶活力达到23.7U/mL,实现了植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达。4.对植酸酶酶学性质的研究表明,SDS-PAGE分析表明表达植酸酶的分子量为50 kD左右。PhyA植酸酶最适温度为37-C,最适pH值为5.5,适合单胃动物的消化道环境；在55℃作用60min后,残余酶活是味保温处理的样品活性的44%,超过55℃保温处理,酶活急剧下降；金属离子对植酸酶的活性没有影响。
李承[8]2018年在《高表达植酸酶毕赤酵母内质网稳态的形成及Wsc1p的调控》文中进行了进一步梳理毕赤酵母是重组蛋白分泌表达常用的宿主之一,目前已有超过5000种的重组蛋白在其中成功表达。当重组蛋白高表达时,内质网加工通量不足导致未折迭蛋白增加而造成内质网压力,对整个细胞的蛋白合成与生长有着不良的影响。共表达编码未折迭蛋白响应转录因子的基因HAC1~i可以增强内质网蛋白加工水平和提高重组蛋白的表达量,但同时会导致内质网负荷增加。因此,细胞会通过相关途径的自调控,减轻内质网负荷和维护内质网稳态。但目前高表达重组蛋白时细胞维护内质网稳态而进行的调控还没有得到详细的解析。本研究利用动态蛋白质组学对高表达植酸酶及共表达HAC1~i引起的毕赤酵母细胞的主要调控途径进行分析,并通过实验验证,探讨高效表达重组蛋白时细胞内质网稳态形成的机制及调控模式。具体研究内容及结果如下:(1)高表达植酸酶重组毕赤酵母菌株的构建通过优化表达载体的AOX1启动子与α信号肽序列、增加基因表达盒拷贝数至六拷贝和共表达HAC1~i,构建了高效表达来源于柠檬酸杆菌CGMCC 1696的植酸酶的重组菌株。该菌株在甲醇诱导96 h时植酸酶酶活达到2119 U/mL,比原出发菌株的植酸酶酶活提高了312%。在10 L发酵罐高密度发酵中,该菌株在甲醇诱导120 h时植酸酶的酶活达到35032 U/mL,胞外蛋白浓度为9.58 g/L。(2)高表达植酸酶重组菌株的蛋白合成网络分析使用iTRAQ技术对共表达HAC1~i高表达植酸酶的菌株与对照菌株在甲醇诱导24 h、72 h和96 h时的胞内蛋白进行分析,发现随着植酸酶表达量增加,内质网膜上的分子伴侣与酶的表达量和内质网蛋白加工水平逐渐增加,而核糖体相对水平逐渐下降。植酸酶表达量增加时,内质网的膜蛋白表达量和蛋白加工水平的增加可能需要更大的内质网空间,推测内质网发生扩张。(3)高表达植酸酶对内质网扩张的影响通过观察内质网膜形状的变化对内质网扩张进行相对定量分析,发现高表达植酸酶菌株的内质网发生扩张,而且内质网的扩张程度随着植酸酶表达量的增加而增加。推测内质网的扩张可以为增加的内质网膜上的分子伴侣与酶和内质网中的蛋白折迭提供更大的空间,而促进蛋白糖基化与折迭,减轻内质网负荷及维护内质网稳态。(4)高表达植酸酶重组菌株核糖体相对水平的调控高表达植酸酶时核糖体相对水平的下调可以减轻内质网的负荷,从而维护内质网的稳态。为解析其调控机制,通过敲除信号蛋白Wsc1p的基因WSC1,发现在高表达植酸酶菌株中下调的核糖体相对水平得到修复,并进一步提高植酸酶的表达量(甲醇诱导96h时提高31%),并且这些结果在高表达木聚糖酶的菌株中得到验证,说明高效表达重组蛋白时核糖体相对水平的下调是由Wsc1p参与调控的。本研究揭示了重组蛋白合成与内质网稳态调控的规律,并通过敲除WSC1减少高效表达重组蛋白对核糖体合成的抑制,进一步提高重组蛋白的表达量。本研究为在毕赤酵母和其它酵母中通过途径重构提高重组蛋白表达量提供理论基础。
彭远义[9]2004年在《植酸酶产生菌的选育及高表达工程菌的构建研究》文中认为植酸酶是一类能催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐的酶，它具有解除植物性饲料(或食品)中植酸的抗营养作用、提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率、促进生长发育、提高动物生产性能、减少粪便中磷的排放量、降低磷对环境的污染等多种功能，因而受到国内外的广泛关注。植酸酶主要存在于植物和微生物中，其中以微生物产生的植酸酶具有良好的开发前景，但微生物天然菌株产酶水平较低，加上天然植酸酶的某些性质不能完全适合饲料加工和养殖业的要求，从而限制了植酸酶在生产中的推广应用。通过植酸酶产生菌的筛选和基因克隆，并利用分子生物学技术构建基因工程菌，或在分子水平上改造植酸酶基因，以提高植酸酶产量或改变植酸酶酶学性质，从而降低生产成本，提高其使用有效性，己成为世界性的研究热点之一。 本研究的目的旨在通过从土壤中筛选酸性植酸酶高产菌株，并进一步通过诱变选育提高其产量，对高产突变菌株植酸酶基因进行克隆和分析，在此基础上，构建植酸酶高产基因工程菌，从而为植酸酶产品的工业化生产奠定基础。主要结果如下： 1 植酸酶高产菌株的筛选 利用植酸钙选择性子板培养基从土样中筛选出102株酸性植酸酶产生菌，从中挑选出透明圈较大的菌株32株，经分离纯化后分别进行摇瓶复筛，28℃、220r/min发酵5天后，在37℃、pH2.5或pH5.5条件下用钒钼酸铵法检测其酶活，结果发现有3株菌产酶活性较高且产酶性能较为稳定。其中编号为03214号的菌株在37℃、pH2.5时酶活性最高，达345U/mL发酵液；编号为041和0324号的菌株在37℃、pH5.5时酶活性最高，分别达285U/mL和250U/mL发酵液。根据产酶活性情况，选取03214号菌株作进一步鉴定和诱变选育的出发菌株。经初步鉴定，03214号菌为黑曲霉，编号为Aspergillus niger03214。 2 植酸酶高产菌株黑曲霉N14的诱变选育 以Aspergillus niger03214为出发菌株，通过紫外线诱变处理不同时间，经平板初筛和摇瓶复筛，获得一株产酶活性较高的突变株03214-3，酶活为373U/mL发酵液，比出发菌株提高了8％左右。以突变株03214-3为出发菌，经0.8mg/mL的亚硝基胍诱变处理不同时间，最终获得了产酶活性较原始菌株Aspergillus niger03214提高了22.3％，达422.3U/mL发酵液的突变菌株，编号为Aspergillus nigerN14。 将黑曲霉N14在PDA斜面上连续传7代，分别测定各代菌株酶活，结果其酶活稳定在410～430U/mL发酵液之间，说明突变株黑曲霉N14具有良好的遗传稳定性，可作为下一步基因工程研究的出发菌株。 3 黑曲霉N14基因组DNA的提取及植酸酶phyA基因的克隆，，画.‘，，妇..圈.翻‘通~ 以A，e啥1111”nigerN14为出发菌，采用改良氯化节法和斑迹抽提法提取基因组DNA，经紫外分光光度计测得DNA的ODZ曰心D翔均在1.80左右，表明这两种方法均适合提取黑曲霉基因组DNA。但在所用菌丝体重量相同的条件下，以氯化节法提取的pNA浓度较高。 根据曲霉菌属植酸酶基因具有高度同源性的特点，结合已报道植酸酶神州基因序列，自行设计一对特异性引物(上游引物:5，月队GGG叼℃八TGGGCG子巳n刃口，;下游引物:5，CAGC以六GCA阳心咙火CTCCGC3，)，采用乃仰七。t DNA聚合酶(高保真DNA聚合酶)，通过PCR方法从黑曲霉N14基因组DNA中扩增出了预期的约1.skb的特异性产物，将其与pMD18.T载体连接后，转化大肠杆菌Dll5Q，.经质粒抽提、五之口月111、tl双酶切鉴定和PcR鉴定，确认该目的基因已得到成功克隆。4黑曲霉N14植酸酶夕句以基因序列分析 DNA序列测定表明，本试验所克隆的目的基因片段含有植酸酶户州基因的完整序列(GeneBank AcceSSIOn:AY4269”)，夕句讨基因全长15仅无p，其中包含一段长102bp的内含子序列，编码467个氨基酸，5’端有拼编码19个氨基酸的信号肤序列。植酸酶活性位点序列CRvTEAQvLsRHGA即n红DsKCK位于氨基酸序列的+71~+93。黑曲霉N14植酸酶夕勺讨基因中G+仁含量达54.7%，密码子第叁位碱基的G+C含量高达67%。黑曲霉N14植酸酶助州基因与报道的产植酸酶活性最高的天然黑曲霉标准株N刊心乃135(来源于孟，己心iuus niger介uum夕va:a~ori)的尸句“基因(GeneBankA以尤SSion:M94550)及A.nigerN25PhyA基因(GeneBankA。戈SSion:AF21如13)、A.nigervar~夕句“基因(枷eBank Aa笼ssfon:ID2421)、A.niger5K-57夕hJ讨基因(G闭eBaDk八口戈SSion:川叨227(X))同源性分别为%.7%、%.8%、%.4%和91.7%，而编码的氨基酸序列同源性分别为98%、97.8%、%.7%和95.7%。进一步采用公pa叮IProtParam等软件对黑曲霉N14植酸酶夕句“基因编码氨基酸序列及编码的蛋白质二级结构预测进行分析，结果表明，黑曲霉Nl助h)“基因所编码氨基酸序列存在10个潜在的N-糖基化位点，与黑曲霉NRRU 135和黑曲霉N25的p勺讨基因所编码氨基酸序列上的N-糖基化位点个数及位置完全相同，而糖基化对微生物表达的植酸酶的生物合成和热稳定性至关重要;理论PI为4.95，分子量为5 n42.0，分子式为q6eH蝴3Ns990，消。;负电荷氨基酸残基 (As尹Glu)有51个，正电荷氨基酸残基(A犯+切s)有34个。实验结?
翟立公[10]2011年在《Spinigerin a抗菌肽基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达》文中认为抗菌肽是生物细胞特定基因编码产生的一类小分子多肽,是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障。具有广谱杀菌、水溶性好和热稳定性好等特点,且对较大的离子强度和较低或较高的pH都有较强的抗性,而对真核细胞几乎无作用,仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞,并且与抗生素通过阻断大分子生物合成的作用机制完全不同。目前抗菌肽的制备主要是通过提取法、化学合成法及基因工程法,然而根据其各种的特点来说,基因工程表达是大量获得抗菌肽的有效途径。Spinigerin抗菌肽是一种来源于白蚁(Pseudacanthotermes Spiniger)的线性抗菌肽,包括25个氨基酸,不含半胱氨酸,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有较好的裂解性,但对人类的红细胞无溶血特性。Spinigerin抗菌肽包含一个稳定的a-螺旋结构(Lys4和Leu21),该结构也保留了抗菌活性。其抑菌机制是该a-螺旋结构和强静电吸引力与细胞膜表面的负极磷脂头部有重要作用。本研究根据GenBank(ID:GI:13959577)中注册的Spinigerin抗菌肽的氨基酸序列,选取其具有a-螺旋结构的18个氨基酸片段,作为目的片段。利用毕赤酵母偏爱密码子原则设计合成目的片段的基因序列及其引物。并将其连接到pPICZa A质粒上,构建成外分泌型重组表达载体pPICZa A-Spinigerin a。通过质粒载体大小的对比、双酶切的鉴定及PCR扩增的鉴定,可证实获得的表达载体即为目的重组载体,为重组表达奠定了基础。在表达的过程中,选择毕赤酵母GS115为目的蛋白的表达系统。酵母转化需要大量的DNA,所以需要大量制备表达载体pPICZa A-Spinigerin a,并用Sac I单酶切使重组质粒pPICZa A-Spinigerin a线性化,通过电转的方法将其转入GS115酵母菌体内。利用具有梯度浓度的Zeocin抗生素筛选高拷贝,且高抗性的转化子。28-30℃培养2-7d,挑取重组菌GS115-S a单菌落提取该酵母基因组,进行PCR鉴定。通过紫外线观察,成功获得目的条带。通过筛选获得转化子GS115-S a进行甲醇诱导表达,得到的发酵上清液进行细菌的抑菌试验。通过对抑菌圈的测定,发现获得的表达上清液对革兰氏阴性及阳性细菌均有较好的抑菌效果。综上所述,本研究成功的构建出表达载体pPICZa A-Spinigerin a,并将其转化到宿主毕赤酵母细胞GS115,获得重组菌GS115-S a。在甲醇诱导表达过程中得到的表达上清液已被证实具有一定抗菌活性,该研究为Spinigerin a抗菌肽的进一步研究奠定了一定基础。
参考文献：
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[8]. 高表达植酸酶毕赤酵母内质网稳态的形成及Wsc1p的调控[D]. 李承. 华南理工大学. 2018
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[10]. Spinigerin a抗菌肽基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[D]. 翟立公. 吉林农业大学. 2011