刘北东[1]2001年在《农杆菌介导几丁质酶基因转化大豆子叶节主要影响因素的研究》文中进行了进一步梳理本研究以10个东北主栽大豆品种（系）的子叶节为受体材料，研究了大豆子叶节高效再生体系的建立，以及农杆菌介导法遗传转化的主要影响因素。建立了稳定的遗传转化体系，获得7株PCR检测呈阳性植株。初步证实菜豆几丁质酶基因已经整合到大豆基因组中。 本研究主要结论如下： 1.再生体系的建立 a.在供试的10个大豆基因型中，3个高效再生基因型为合丰35、合丰25和黑农40，每个外植体分化出的丛生芽数量分别是：6.69、6.32和5.98。 b.不同基因型子叶节丛生芽分化适宜培养基为： 合丰35、合丰25：MSO+1.5mg/l BA+0.2mg/l IBA 黑农40： MSO+1.2mg/l BA+0.2mg/l IBA c.适宜的外植体大小为保留3/3子叶。合丰35、合丰25和黑农40保留3/3子叶时每个外植体分化出的丛生芽数量显着高于保留1/3子叶。 d.大豆丛生芽生根培养基确定为：MSO+2.0mg/l IBA；3个基因型的生根率分别是：合丰35为75.32％、合丰25为71.11％、黑农40为81.67％，显着高于对照。 2.选择压的确定 卡那霉素的筛选效果好于新霉素。浓度分别是：丛生芽分化阶段，合丰25为100mg/l，合丰35、黑农40为125mg/l；生根阶段，合丰25为10mg/l，合丰35、黑农40为15mg/l。 3.除菌剂的确定 除菌剂为头孢唑啉钠，适宜浓度为500mg/l。 4.遗传转化体系的建立 a.适宜的超声波处理时间范围为小于12s。在此范围内，对3个基因型每个子叶节分化丛生芽的数量及外植体的分化率均无显着影响； b.合丰35是遗传转化的理想的植物材料，每个子叶节产生抗性芽的数量为1.0，显着高于合丰25和黑农40。外植体的分化率为65.59％显着高于黑农40。 c.菌株EHA105的转化能力高于菌株LBA4404。用EHA105进行遗传转化每个外植体得到的抗性芽数为0.86，外植体分化率为77.42％。显着高于菌株LBA4404。 d.影响遗传转化的4个因素正交实验的较优组合是：预培养培养基蔗糖浓度6％、超声波处理时间12s、菌液浓度OD_(600)=0.5、共培养时间3天。影响程度依次为：共培养时间、蔗糖浓度、超声波处理时间、菌液浓度。 5.转化体的PCR检测 经PCR检测，获得7株阳性植株，合丰35为5株、合丰25为1株、黑农40为1株。通过对抗性苗和抗性芽分别进行PCR检测，结果表明经过两次筛选得到的抗性苗的阳性率为33％，高于只经一次筛选的抗性芽的阳性率。
杨晓凤[2]2011年在《大豆农杆菌介导转化体系的优化及Sporamin和Chitinase KDEL 基因转化研究》文中研究表明大豆是我国重要的油料作物和高蛋白粮饲兼用作物,也是植物蛋白质的主要来源。随着大豆基因组测序的完成和人们对转基因作物认同度的增加,进行大豆功能基因组和转基因大豆种质创新研究已越来越引起各国科学家的重视。尽管大豆对农杆菌较敏感,但由于组织培养再生性差与其它作物相比大豆难于转化且转化效率较低。较低的转化效率限制了大豆功能基因组的研究和转基因大豆新品种研发。本研究通过对外植体、基因型、农杆菌菌液、抗氧化剂、共培养条件等因素优化了大豆农杆菌介导子叶节转化体系,目前在本实验中采用特异的转化受体大豆转化效率平均可达1.5%左右,个别转化事件转化效率达到8.83%。所优化的适于大豆转化系为：以发芽一天的YC-1和YC-2二个品种子叶节为外植体,采用OD6500.8左右的农杆菌菌液共侵染外植体30 min,在含有25mg/L LA的共培养基光照培养4天然后在SI和SE培养基上诱导芽的再生,再在RM诱导生根,最快的可在80天左右得到大豆转基因苗。采用已优化的大豆转基因体系,采用农杆菌介导法将Sporamin和Chitinase KDEL两个基因导入大豆中,得到经过草丁膦抗性鉴定和PCR技术鉴定的阳性苗25株。田间观察试验表明这二个基因具有抗红蜘蛛的功能,但棉铃虫喂饲试验表现为不抗。’关于这二个基因的功能,Southern杂交和RNA表达分析还有待于进一步的研究。
崔欣[3]2002年在《大豆子叶节受体系统的建立及农杆菌转化的研究》文中研究说明大豆是公认的难转化的作物之一，这是由于大豆组织培养再生困难，可重复性差，基因型之间差异大，遗传转化体系还不完善等原因造成的。本试验通过大豆子叶节器官发生途径的再生系统，筛选到再生频率较高的叁个基因型，并对影响再生频率和农杆菌介导的遗传转化系统的主要因素进行了优化，建立了一个适于农杆菌遗传转化的高效受体系统，并在此基础上进行了Bt基因和chi基因的遗传转化，得到PCR检测呈阳性的转Bt基因和chi基因的植株。主要研究结果如下： 1．大豆基因型的筛选 12个不同基因型的大豆在培养条件相同的情况下，再生频率在基因型之间差异较大，其中筛选到黑农35、合丰25和合丰35再生频率相对较高，分别为64.02％、65.04％和60.82％。 2．激素浓度的筛选 (1)试验在子叶节不定芽诱导分化阶段设计了BA和IBA浓度梯度交互配比的方案，筛选到对于不同基因型的大豆BA和IBA的最适配比浓度，其中黑农35在BA为1.50mg/L、IBA为0.20mg/L时，不定芽分化率最高，为78.57％，且每外植体上的芽的个数为5-8个；合丰25选择不定芽分化率为48.57％时的BA和IBA浓度，分别为1.30mg/L和0.25mg/L，这是因为在此BA和IBA的配比浓度下，海外植体上芽的个数为7-10，不超过10个，利于不定芽抽茎。合丰35也选择分化率为74.07％时的BA和IBA浓度配比，分别为1.20mg/L和0.25mg/L，且每外植体上芽的个数为4-9。 (2)大豆生根阶段施加IBA可以显着提高生根率，生根基本培养基为1/2MSB，蔗糖浓度为2％，筛选得到黑农35和合丰25在IBA为2.0mg/L时，生根率较高，分别为71.88％和72.41％，合丰35在IBA为1.5mg/L时，生根率较高，为68.97％。 3．影响农杆菌遗传转化效率的因素 (1)Bt基因和chi基因所携带的选择标记基因皆为nptⅡ，使用的选择剂为Kan。由于大豆子叶节经农杆菌转化后，不定芽的诱导分化和生根较困难，所以采用延迟选择的一步筛选程序，即仅在芽长到0.3-1cm时至转入生根培养基之前用Kan进行筛选。试验结果表明，叁个基因型大豆的Kan筛选浓度皆为125mg/L。硕士学位论文 摘 要2002年5月一 门）杀菌剂选用头抱唆躬钠，浓度在小刀0＊叭之间对大豆子叶节不定芽的分化率 无明显影响，且浓度为500mg／L时才可完全抑制农杆菌的生长，因此，头抱 ＄fo钠的杀菌浓度定为 500InglL。 （3）农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化中，用 GUS瞬时表达率来衡量预培养、侵 染和共培养的最适时间，黑农乃、合丰35和合丰25在预培养24h，侵染时间 分别为20min、25min和20min，共培养时间分别为70h、80h和70h时，GUS 的瞬时表达率最高，分别为2500％、ZIBO％和23．sl％，所以，对于不同基因 型大豆来说，预培养、侵染和共培养的最佳配比时间也不同。4．PCR检测 获得转Bt和 Chi基因的 PCR检测阳性植株，其中 PCR检测呈阳性的转 Bt基因的抗性植株为5株，黑农35和合丰25各为2株，合丰35为1株，转化频率为0．79％；获得PCR检测呈阳性的植株4株，黑农35和合丰35各为1株，合丰35为2株，转化频率为0．60％。
刘银[4]2013年在《农杆菌介导大豆转化体系的建立及植酸酶基因的导入》文中指出大豆是我国重要的油料作物和粮饲兼用作物,是植物蛋白的重要来源。近年来,随着生物技术的发展,许多学者通过基因工程的手段来改良大豆品质、提高大豆产量。本研究以大豆的子叶节为外植体,探讨了影响大豆再生效率的主要因素,建立了子叶节的再生体系；通过农杆菌介导的转化方法将植酸酶(Phy)基因导入小粒豆中,研究影响其转化的主要因素,初步建立大豆遗传转化体系,并获得了经PCR检测为阳性的转基因植株。主要工作和结果如下：1、大豆子叶节再生体系的建立(1)种子消毒方法的确定：比较了3种不同种子消毒方法,氯气消毒法对种子的伤害比较小,污染率低,适合大豆种子的消毒。(2)最适苗龄的筛选：不同苗龄的大豆子叶节诱导丛生芽能力存在显着差异,无菌苗萌发4d时,丛生芽诱导率最高,为88.9%,因此子叶节转化的最适苗龄为4d。(3)大豆基因型的筛选：不同基因型的大豆再生能力差异较大,供试的5个不同基因型大豆,芽诱导率在24%-84%之间,其中小粒豆芽诱导率最高,因此将小粒豆作为进一步转化的实验材料。(4)6-BA浓度的确定：6-BA浓度直接影响无菌苗的萌发及丛生芽的诱导,萌发培养基中添加1mg/L6-BA时无菌苗长势最佳,芽诱导阶段最适6-BA诱导丛生芽浓度为1.67mg/L。(5)生根阶段IBA或NAA浓度的确定：生根阶段添加ⅠBA、NAA均可以显着提高生根率,添加1mg/L的IBA最适合小粒豆不定芽的生根。2、Phy基因转化大豆(1)确定了农杆菌菌液浓度OD600为0.8,与子叶节外植体侵染30min,在含有25mg/L LA共培养基中暗培养3d。(2)确定了草丁膦筛选的适宜浓度为5mg/L,并根据大豆子叶节农杆菌转化特点,采用延迟筛选方法。(3)通过筛选,得到抗性苗345棵,经PCR检测有5株为阳性,转化率为1.45%。
郭秋云[5]2013年在《大豆下胚轴再生体系的优化及HaBADH转化的初步研究》文中提出大豆是重要的油料作物之一,也是植物蛋白的重要来源,已在全国广泛种植。在农业生产中,大豆常受到非生物胁迫因子的影响,如干旱、高盐、低温等,导致质量下降与产量降低。作为对盐分中度敏感的作物,大豆耐盐性较差,因此,通过转基因方法,提高大豆耐盐性,获得耐盐大豆品种,以充分利用沿海地区不断扩大的盐碱化土地具有重大的意义。然而,与其他作物相比,大豆组织培养体系存在着植株再生频率较低、基因型依赖性强、重复性差等的诸多缺陷,导致其在遗传转化操作技术上难度大,遗传转化率低,这些问题都亟待解决与提高。本文研究大豆基因型、植物激素、诱导时间等因素对大豆下胚轴不定芽形成的影响,以优化大豆下胚轴再生体系；利用农杆菌介导法转化HaBADH(向日葵甜菜碱醛脱氢酶基因),探讨大豆基因型、抗性筛选剂种类等对大豆下胚轴遗传转化的影响,进一步优化大豆下胚轴农杆菌介导遗传转化体系,以期为用转基因技术改良大豆品种抗逆性奠定实验基础。甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是合成甜菜碱的关键酶,在受到盐胁迫时,甜菜碱不仅起着无毒渗透保护剂的作用,而且它能保护细胞内蛋白质和酶类的活性,从而提高植物的抗旱、耐盐能力。本研究主要结果如下：1.大豆下胚轴的不定芽诱导率在8个不同基因型(黑农44、黑农37、黑农35、合丰35、吉育91、淮豆4号、淮豆9号、绥农28)之间的差异较大,变幅为15.63%～87.50%,其中淮豆9号和合丰35的不定芽诱导率相对较高,分别为87.50%和84.72%,其均极显着地高于大豆下胚轴研究常用的基因型黑农44(对照基因型),后续试验将以合丰35、淮豆9号和黑农44为试验材料。2.培养基中IBA和6-BA的浓度及两者比值直接影响着不定芽的诱导和生长,试验以黑农44为试验材料,筛选结果为,萌发培养基6-BA浓度为1.0mg/L,诱导培养基IBA浓度为0.1mg/L时,其不定芽诱导率最快达到100.00%,且芽数(≥0.5cm)和芽长也较好,分别为2.53个和2.61cm。此激素浓度条件下,诱导9d和11d的芽长均极显着地高于其他3个诱导时间(3、5、7d)下的芽长。3.本试验农杆菌转化后采用的筛选剂为卡那霉素和NaCl,脱菌剂为头孢霉素,研究3个基因型大豆下胚轴卡那霉素敏感浓度分别是淮豆9号和黑农44为100mg/L合丰35为150mg/L;下胚轴NaCl耐性分别是黑农44和合丰35为100mmol/L,淮豆9号为75mmol/L;敏感浓度下大豆下胚轴的不定芽诱导率、芽数及芽长均显着性地低于对照,以上筛选出的卡那霉素和NaCl浓度是大豆下胚轴遗传转化时的筛选浓度。4.以合丰35、淮豆9号和黑农44为试验材料,利用农杆菌介导法进行HaBADH基因的遗传转化,合丰35和黑农44的不定芽诱导率均显着性地高于淮豆9号。因此,大豆下胚轴遗传转化时,合丰35和黑农44比淮豆9号更适于作为转化的受体材料。5.合丰35和黑农44下胚轴转化后,分别经100mg/L和150mg/L卡那霉素或75mmol/L NaCl筛选,获得的抗性苗PCR阳性率在29.75%～61.76%之间。比较两种筛选剂的筛选效果,发现以NaCl为筛选剂时的PCR阳性率(黑农44：47.37%、合丰35：61.76%)均高于以卡那霉素为筛选剂时的PCR阳性率(黑农44：36.26%、合丰35：29.75%)。因此,NaCl可能更适于作为大豆下胚轴遗传转化时的筛选剂,但本试验中NaCl筛选浓度可能过高,严重抑制下胚轴不定芽的生长,导致抗性不定芽难以存活,后期研究中可以适当降低NaCl的筛选浓度。
田巍[6]2011年在《大豆子叶节再生体系的建立及转化GAFP基因的研究》文中进行了进一步梳理大豆是我国的主要农作物之一,真菌性病害对大豆的危害最为广泛。传统的育种方法周期长、效率低,且容易污染环境,不是理想的抗病育种方法。随着植物基因工程技术的发展,根癌农杆菌介导的遗传转化成为新型抗病育种的主要技术手段。天麻抗真菌蛋白(Gastrodia antifungal protein,GAFP)是一种广谱的抗真菌蛋白,将编码GAFP的基因导入大豆中,有望培育出抗病的转基因大豆新材料。本研究以大豆的子叶节为外植体,探讨影响大豆再生频率的主要因素,建立并优化了子叶节再生体系；利用农杆菌介导法将GAFP基因导入小粒豆,研究了影响大豆遗传转化的主要因素,初步建立了遗传转化体系,并获得了经PCR检测为阳性的转基因植株。主要研究结果如下：1建立并优化了大豆子叶节再生体系(1)确定了适宜的种子灭菌方法：比较了叁种不同的常用灭菌方法,氯气灭菌法污染率低且对种子的伤害较小,是大豆种子适宜的灭菌方法。(2)筛选适宜的大豆基因型：不同基因型大豆的再生能力差异较大,供试的7个不同基因型大豆中,芽诱导率在7.27%-69.09%之间,其中小粒豆芽诱导率最高,所以将小粒豆作为进一步转化实验材料。(3)确定适宜的6-BA浓度：6-BA浓度直接影响着丛生芽的诱导和分化,当浓度为0mg/L时,无法诱导丛生芽；当浓度为1.67mg/L时,芽诱导率最高,为84.6%；当浓度为2.5mg/L时,丛生芽个体最大,但是芽的个数过多不利于芽的伸长。(4)生根阶段适宜的IBA浓度：生根阶段施加IBA可以显着提高生根率,在IBA浓度为1mg/L,生根率最高,为79%。2研究了影响GAFP转化大豆的影响因素(1)确定了抗生素筛选的适宜浓度为Hyg10mg/L,抑菌剂为Cef500mg/L,并根据大豆子叶节农杆菌转化特点,采用延迟筛选法。(2)确定了子叶节与农杆菌侵染及共培养的最佳组合为侵染30min,共培养3d。3转GAFP基因植株的获得通过筛选,得到抗性苗204棵,经PCR检测有2株为阳性,转化率为1.96%。
李海燕[7]2002年在《双价抗真菌病基因对大豆遗传转化的研究》文中进行了进一步梳理大豆是重要的粮食和油料作物，但容易受多种真菌病的危害，导致大豆的产量和品质下降。由于传统的抗病途径存在诸多缺点，并不是理想的防治措施，而利用基因工程技术可望为大豆育种及品质改良开辟一条新途径。但大豆抗真菌病基因遗传转化中仍存在单个抗病基因的抑菌谱窄、缺乏合适的再生体系和遗传转化效率低等问题。 针对以上问题，本研究选用东北地区4个主栽大豆品种为试材，通过基因工程手段，构建带有菜豆几丁质酶基因(chi)和大麦核糖体失活蛋白基因(rip)的植物表达载体，利用农杆菌介导法和基因枪法，首次将两个抗真菌病基因同时导入大豆。并系统优化植株再生和遗传转化条件，建立了高效的植株再生和遗传转化体系，获得同时整合两个抗真菌病基因的转基因大豆：本研究为大豆以及其它豆科植物抗病分子育种奠定基础，并为有性杂交育种提供基因资源。主要研究结果如下： 1．构建了抗真菌病基因植物表达载体 a 共构建5个载体，包括1个中间克隆载体pURO1、1个中间表达载体pARIP、2个单基因植物表达载体pBIRIP和pBchE、1个双价基因植物表达载体pBRC。 b．pBRC含有chi基因和rip基因，其联合表达有望扩大植物抗菌谱。 c．pARIP带有rip基因，与含有NPTⅡ和chi基因的pBch作为基因枪转化材料。 d．pBIRIP和pBchE都含有各自的抗真菌病基因和NPTⅡ选择标记基因，pBIRIP还含有Gus基因，均可作为抗真菌病遗传转化研究的目的基因材料。 二．改造了启动子 将pARIP、pBIRIP、pBchE和pBRC中的目的基因启动子均改造成双35S启动子，可显着增强目的基因在双子叶植物中的表达效率。 3．建立了大豆子叶节器官发生再生系统 a．最佳丛生芽分化培养基为MSB+1.5mg／LBA+0.2mg／LIBA，0.8％琼脂粉，pH5.8。 b．不同基因型的丛生芽分化率和每个外植体出芽数不同。在供试的4个大豆基因型中，黑农35、合丰35、东农42和吉林30的丛生芽分化率分别为98.5％、99.3％、73.4％和40.6％，每个外植体平均出芽数为4.9、5.0、3.0和3.0。黑农35和合丰35是子叶节发生途径的高效再生基因型。 c．最佳丛生芽生根培养基为1／2MSB+1.5mg／LIBA+2％蔗糖，0.8％琼脂粉，pH5.8。 d．基因型之间有生根率和启动时间上的差异。合丰35生根率最高，为95.1％，启动时间最短，为2天；黑农35、东农42和吉林30次之，生根率分别为62.2％、 博士学位论文 摘 要 芋海燕 60．8O和79．80，启动时间分别为4、4和3天。4．建立了大豆幼胚子叶体细胞胚发生再生系统 。用正交试验探讨氮源、生长素和蔗糖对体细胞胚诱导的影响。结果表明，最佳 体细胞胚诱导培养基为MSB＋40rngh 2，4LH6％蔗糖，08％琼脂粉，pHS．8 此时，体细胞胚诱导率和诱导效率最高，分别达49％和2．94％。蔗糖浓度是影 响体细胞胚诱导的首要因素，其次是生长素浓度，而有机氮素不是大豆体细胞 胚诱导所必需的。2，4－D的诱导效果好于NAA。 b 首次证明，高pH值与接种前的低温预处理可显着提高大豆体细胞胚诱导效军。 经4℃预处理、在pH70的培养基上获得的诱导效率最高，为4460／／0，与…．8。 不进行低温处理的结果（29％）差异极显着。这一结果将对大豆幼胚子叶体绍 胞胚发生影响因素的研究有重大参考价值c C 低温预处理的最适时间因基因型不同而有所差异．合丰35、黑农35为二大． 吉林30为1天，东农42为3天，其变动幅度为l～3天。 d 最佳体细胞胚成熟培养基为MSBed％蔗糖十0．3％活性炭，0．8％琼B旨扮，pHS．8。 此时，胚成熟宰最高，达87．5％c活性炭可减少畸形胚比率，提高胚成熟氧 e 干燥处理能显着提高子叶形胚萌发率c采用滤纸干燥法，在幻％相对湿度V失 水 72h，当鲜重损失率达 50o时，体细胞胚萌发率最高，为 92．10。5．忧化了农杆菌介导的子叶节遗传转化体系 a 首次构建并利用双价抗真菌病基因植物表达载体进行大豆子叶节遗传转化c b．合丰35是农杆菌转化理想的植物材料，其抗性芽率最高，为40．3％，显着高于 其它基因型。 c 正交试验结果表明，农杆菌介导转化的较优组合为：侵染时在0．06Mpa真空强 度下负压处理5分钟。共培养3天、预培养1天、共培养培养基的叫二，此 时抗性芽率最高，为55．8％c各因素影响的主次顺序为：共培养pH值＞负压处 理时间＞共培养时间＞预培养时间c d．丛生芽分化阶段卡那霉素的筛选压力确定为 130mg／Lc丛生芽生根阶段卡那霉 素的筛选压力确定为：黑农35、东农42和吉林30为lop，合丰35为15mgh。 e．采取分步筛选法，即在丛生芽分化和生根阶段都进行筛选。而在分化阶段，采 用延迟选择法，即共培养一周后再筛选，效果好于传统的一步筛选法。6．优化了基因枪法对幼胚子叶的遗传转化体系 a－ 首次将携带不同抗真菌病基因的两个质粒馄合轰击大豆幼胚子叶诱导的初生 胚
卢涛[8]2012年在《农杆菌介导大豆胚尖转化体系的优化及Sporamin和Chitinase KDEL转化后代分析》文中认为大豆(Glycine max L.)是我国主要的粮食作物,也是食用油和植物蛋白质的主要来源。从1996年起,我国大豆进出口形势发生了根本性的逆转,成为大豆净进口国,其中绝大部分是转基因大豆及其产品。在耕地日益紧张,粮食安全问题日益凸显的情况下,发展转基因技术显得尤为重要。但目前我国大豆转基因技术存在转化效率低和实验重复性差的特点,如何提高大豆转化效率是转基因大豆产业化迫切需要解决的问题。本论文主要通过大豆基因型、农杆菌菌液浓度、农杆菌侵染方法、芽诱导阶段植物激素处理等因素优化大豆成熟胚尖为外植体的农杆菌介导转化体系；同时还研究了Sporamin和Chitinase KDEL大豆转基因后代的鉴定和分离以及转基因植株农艺性状和产量的分析。以大豆成熟种子胚尖为外植体,以含有GUS报告基因和筛选标记bar基因的pTF102为载体,研究了不同基因型黑农37、中豆32、中黄10、中黄30、YC03-3和YC04-5六个大豆栽培品种对农杆菌介导的GUS瞬时表达率和芽诱导的影响,结果表明不同基因型表现为GUS瞬时表达率和芽诱导率最高的基因型为YC03-3；不同农杆菌菌液浓度(OD6500.4、0.6、0.8、1.0和1.2)侵染大豆胚尖外植体表明OD650为0.6-0.8共培养3d后GUS瞬时表达率最高；常规侵染与超声波辅助侵染相比,超声波辅助侵染有助于提高胚尖外植体的GUS瞬时表达率；不同植物生长激素(6-BA和IBA)浓度梯度组合与芽诱导密切相关,其中以0.4mg/l6-BA和0.04mg/l IBA组合丛生芽诱导率最高达72.33%；此外还初步探讨了胚尖外植体液体培养与固体培养对芽诱导的影响,液体培养比固体培养芽伸长得更快,有利于缩短转基因苗的再生周期。综上所述,优化后适于农杆菌介导大豆胚尖转化体系为以YC03-3大豆胚尖为外植体,采用OD650值0.6-0.8的农杆菌菌液以超声波辅助农杆菌法共侵染外植体30min,光照共培养3天后转入含有6-BA0.4mg/l和IBA0.04mg-L’的SI诱导培养基上诱导芽的再生,转入WPM培养基上诱导丛生芽的伸长,然后转入RM上诱导生根从而获得转基因苗。比较了PCR法、bar试纸条法和草丁膦叶片涂抹法对大豆转sporamin和chitinase KDEL基因后代进行了鉴定,结果表明：叁种方法鉴定TO和T1代转基因植株,如草丁膦叶片涂抹法为阳性植株则bar试纸条法和PCR法鉴定法也为阳性,反之亦然,因此采用135mg/1草丁膦涂抹叶片方法可作为草丁膦筛选标记转基因大豆植株的大规模筛选。在得到的45株TO代阳性植株中只有4个独立的株系外源基因在T1代遗传,其中2个株系呈现3：1的遗传分离比例符合孟德尔遗传分离比,在T2代转化植株中阳性植株为165株,占总株数的47.97%。此外研究了外源基因对转化后代生育期和农艺性状的影响,所得到的转基因后代与野生型相比,生育期和产量性状方面无显着性差异且都是可育的。
郭兵福[9]2012年在《农杆菌介导的大豆遗传转化体系优化与应用》文中研究说明大豆(Glycine max(L.)Merr)是食用植物油和植物蛋白质的主要来源,也是重要的饲料和工业原料。主要实验结果如下：1.明确了转化受体品种对草铵膦和百草枯的耐受性。四个不同大豆品种用不同浓度草铵膦和百草枯处理,结果表明,中豆32对百草枯耐受浓度最高为0.24mg/L,中黄10号次之为0.18mg/L,东农50和小粒豆最低为0.12mg/L。草铵膦耐受浓度最高品种为中豆32(6mg/L),吉林小粒豆1号次之为4mg/L,中黄10号和东农50的耐受浓度均为3mg/L2.建立了简便易操作的根癌农杆菌介导大豆幼苗顶芽原位遗传转化方法。利用该方法分别将除草剂抗性基因EPSPS和Bar转入大豆,结合临界筛选和PCR测序等方法,鉴定出T1代转基因植株6株,遗传转化效率为0.14%；经T2代PCR分子检测,证明方法已成功将外源基因整合到大豆的基因组。3.利用根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化,创制了农艺性状改变的转ZmAP2、AtLSH9、GmN1基因大豆新种质。共获得PCR阳性植株25株,遗传转化效率范围为1.14%-8.97%。其中12个T1代株系的株高、百粒重、粗蛋白含量、粗脂肪含量等性状与对照存在显着或明显的变化。选择10株系种植T2代并进行PCR测序,证明外源基因已整合到大豆基因组。
孔凡江[10]2002年在《大豆遗传转化系统的建立与农杆菌介导Bt基因转移的研究》文中研究表明本研究以10个东北主栽大豆品种(系)的子叶节为受体材料，研究了大豆子叶节高效再生体系的建立，以及农杆菌介导法遗传转化的主要影响因素。建立了稳定的遗传转化体系，获得4株PCR检测呈阳性植株。Southern杂交证明Bt基因已经整合到大豆基因组中。本研究主要结论如下： 1．再生频率在不同基因型大豆之间的差异较大，在供试的10个不同基因型的大豆中，再生频率在0-65.04％之间，其中黑农35、合丰25和合丰35再生频率相对较高，分别为65.04％、64.02％和60.82％，所以将这叁个基因型的大豆作为试验材料。 2．BA和IBA的浓度配比直接影响着不定芽的诱导分化和生根，对于不同基因型，芽诱导分化的最适BA和IBA配比不同，试验筛选得到的结果为，黑农35在BA浓度为1.50mg/L，IBA浓度为0.25mg/L时，分化率最高，达78.57％，且每外植体上的芽的个数为5-8个，不超过10个，利于抽茎；合丰25选择BA浓度为1.30mg/L，IBA浓度为0.25mg/L，此条件下分化率为48.57％；合丰35也选择分化率为74.07％时的BA和IBA浓度配比，分别为1.20mg/L和0.25mg/L，且每外植体上芽的个数为利于抽茎的4-9个。 3．生根阶段施加IBA可以显着提高生根率，筛选得到的结果是在基本培养基为1/2MSB，蔗糖浓度为2％时，黑农35和合丰25在IBA为2.0mg/L时，生根率较高，分别为71.88％和72.41％。合丰35在IBA为1.5mg/L时，生根率较高，为68.97％。 4．选择剂为卡那霉素，黑农35、合丰35和合丰25叁个基因型的筛选浓度皆为100mg/L。根据大豆子叶节农杆菌转化体系的特点，采用延迟选择的筛选方式，即共培养后不立即筛选，待不定芽长到0.3-1cm至生根前进行筛选。 5．杀菌剂选用头孢唑啉钠，在综合考虑头孢唑啉钠对大豆子叶节不定芽诱导分化的影响和抑制农杆菌效果两方面后，确定头孢唑啉钠的适宜浓度为500mg/L。 6．用GUS瞬时表达率来衡量预培养、侵染和共培养的最适时间，对于不同基因型的大豆来说，预培养、侵染和共培养叁者配比时间不同，黑农35在预培养24h，浸染时间分别为20min，共培养时间为70h时，GUS的瞬时表达率最高，分别为25.00％。 7．获得4株转Bt基因PCR检测阳性植株，其中黑农35为2株，合丰25和合丰35各为1株。转化频率为0.52。用地高辛标记的Bt基因探针进行Southern杂交，结果4个PCR阳性株系均呈现与质粒DNA相同的杂交带，证明Bt基因已经整合到受体大豆的基因组中。
参考文献：
[1]. 农杆菌介导几丁质酶基因转化大豆子叶节主要影响因素的研究[D]. 刘北东. 东北农业大学. 2001
[2]. 大豆农杆菌介导转化体系的优化及Sporamin和Chitinase KDEL 基因转化研究[D]. 杨晓凤. 浙江大学. 2011
[3]. 大豆子叶节受体系统的建立及农杆菌转化的研究[D]. 崔欣. 东北农业大学. 2002
[4]. 农杆菌介导大豆转化体系的建立及植酸酶基因的导入[D]. 刘银. 扬州大学. 2013
[5]. 大豆下胚轴再生体系的优化及HaBADH转化的初步研究[D]. 郭秋云. 南京农业大学. 2013
[6]. 大豆子叶节再生体系的建立及转化GAFP基因的研究[D]. 田巍. 扬州大学. 2011
[7]. 双价抗真菌病基因对大豆遗传转化的研究[D]. 李海燕. 东北农业大学. 2002
[8]. 农杆菌介导大豆胚尖转化体系的优化及Sporamin和Chitinase KDEL转化后代分析[D]. 卢涛. 浙江大学. 2012
[9]. 农杆菌介导的大豆遗传转化体系优化与应用[D]. 郭兵福. 南昌大学. 2012
[10]. 大豆遗传转化系统的建立与农杆菌介导Bt基因转移的研究[D]. 孔凡江. 东北农业大学. 2002