（宜昌市中心人民医院药学部 湖北 宜昌 443003）
【摘要】目前，5-氟尿嘧啶（5-FU）广泛应用于结肠癌的术后化学治疗。然而，单独应用5-FU的治疗效果并不十分理想，因此，其他药物（和/或营养物质）辅助5-FU治疗结肠癌成为研究热点。B族维生素积极参与了核苷酸的合成、DNA 的甲基化、基因修复等生化过程，因此与癌症的发生和发展具有密切的联系。
本实验应用小鼠结肠癌CT26皮下移植瘤模型，探究维生素B2（Vb2）的 癌前预防作用，以及其术后联合5-FU对结肠癌术后转移倾向的影响。实验结 果表明，在肿瘤细胞存在的前提下，单独应用预防剂量Vb2能够促进肿瘤生长，其机制可能是通过影响细胞能量代谢以及影响肿瘤细胞核因子ki-67的表达从而促进肿瘤细胞增殖。而在肿瘤切除手术后，联合应用Vb2与5-FU能够显著降低ki-67的表达、降低血清血管内皮生长因子（VEGF）含量，且显著提升E钙黏蛋白（E-cad）表达量。
【关键词】维生素B2；结肠癌；5-氟尿嘧啶；手术预后；肿瘤转移
【中图分类号】R735.35 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）22-0145-03
前言
癌症的治疗多种多样，如化疗、辐射、能量限制以及手术切除。目前常用的治疗方案为手术后联合辐射（放疗）与化疗，但是患者往往受到治疗所引起的严重副作用（如肾毒性、肝毒性、神经毒性、骨髓抑制等）以及耐药性）的困扰，从而导致中途放弃治疗以至于寿命缩短。因此，寻找到长期有效并且毒副作用相对较小的癌症疗法是目前亟待解决的难题。
1.探究维生素B2对于小鼠结肠癌的预防以及手术预后的影响
1.1 引言
维生素B2的抗肿瘤作用国内外已经有所报道，但是目前的研究结果仍然存在不一致性与局限性。同时，以往研究缺少对于维生素B2术后联合化疗药物治疗结肠癌的讨论，因此本实验希望弥补这个不足，为优化结肠癌的临床治疗提供可靠的理论依据。
1.2 实验材料
1.2.1实验动物 健康Balb/c小鼠，雄性，4～6周龄，体重18-20g，SPF级。医院医学部实验动物科学部提供，许可证号：SCXK（京）2006-0008。实验前适应性饲养3天。
环境温度控制为22～25℃，湿度>60%，自然光照（12小时/天），自由进水，标准颗粒饲料喂养。
1.2.2肿瘤细胞株 小鼠结肠癌CT26细胞，购自医院基础所细胞中心。
1.2.3受试药物 维生素B2，黄色片剂，规格5mg/片，国药准字
1.3 实验方法
1.3.1造模方法
（1）小鼠结肠癌CT26细胞培养
将购买的小鼠结肠癌CT26细胞进行复苏。将冻存管迅速放入38℃～40℃水浴中，并不停摇动使其在30s内全部融化，500℃～800r/min离心5min，弃上清，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，转入培养瓶内培养。次日更换培养液，以后按常规培养。小鼠结肠癌CT26细胞在37℃，5%CO2，95%湿度条件下的孵箱中贴壁生长，以0.25%的胰蛋白酶消化，2～4天传代一次。待细胞生 长至对数期，冻存一部分备用。其余细胞继续传代培养，供本实验造模接种用。
（2）小鼠结肠癌移植瘤模型的建立
单细胞悬液配置：荷瘤当日取培养皿，弃培养基并用PBS润洗平皿，加入3ml0.25%胰蛋白酶消化。待细胞基本脱离皿底，加等量培养基终止消化，并将 悬液置于15ml离心管内，1000r/min离心8min，弃上清。0.9%生理盐水吹散细 胞沉淀，调整浓度为1×107个/mL于小号广口瓶中，置于冰上保存。
荷瘤：移液器将细胞悬液吹打均匀，用1ml注射器取0.2mL细胞悬液接种 于所有小鼠右前肢皮下，形成小鼠结肠癌皮下移植瘤模型。细胞要求在30min内全部接种完毕。
1.3.2动物分组 接种后24h称量小鼠体重并随机分为八组，每组10只，用苦味酸对每组实 验动物进行标记。各组实验操作方式如表1所示。
1.3.3手术
（1）手术方案
戊巴比妥钠注射液按照50mg/kg体重（0.1ml/10g体重）给药。待麻醉完全起效，将小鼠置于白色托盘内，用碘伏消毒待手术部位。刀片切开肿瘤上方皮肤，游标卡尺测量移植瘤长短径，记录于肿瘤记录表中，用于计算造模后肿瘤体积（V模型）。按照分组要求，分别切除瘤体的30%或80%，并再次测量剩余移植瘤长短径，计算术后移植瘤体积（V术后）。以缝合线缝合皮肤，并表面涂上碘伏以防感染。
（2）术后
小鼠置于铺有脱脂棉的加热垫上，并以脱脂棉覆盖，保证温度。待小鼠苏醒以及恢复正常活力，移回原饲养笼内继续常规饲养并进行后续实验操作。
1.3.4实验指标检测
（1）肿瘤体积变化率（注：预防给药组的V术后引用各组V模型的平均值）；
（2）胸腺指数、脾脏指数；
（3）血清中总超氧化岐化酶（T-SOD）以及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）含量。
2.结论
通过对：（1）小鼠体质量变化率以及胸腺、脾脏指数；（2）术后肿瘤体积变化率、最终肿瘤体积、最终瘤重；（3）肿瘤组织HE染色结果；（4）肿瘤转移指标；（5）血清中氧化应激指标的检测。五项指标的分析，可以得出以下结论。
①肿瘤的生长在一定时间范围内不会引起患者体重的显著下降，同时体内瘤负荷会对机体形成免疫刺激。手术本身以及术后化疗均会导致患者体重下降，并且引发免疫抑制；维生素B2辅助化疗能够在一定程度上改善低免疫状态。
②手术对于肿瘤生长具有刺激作用，且肿瘤切除比例越大，刺激作用越显著。
③在肿瘤细胞存在的前提下，单独应用维生素B2可能潜在的促进肿瘤生长，其机制可能是：通过影响细胞能量代谢；影响肿瘤细胞核因子ki-67的表达从而促进肿瘤细胞增殖。
④术后联合应用维生素B2与化疗药物5-氟尿嘧啶能够显著降低ki-67的表达。然而由于单独使用5-氟尿嘧啶也能够降低ki-67的表达量，且本实验结果并 未体现出二者影响ki-67表达量的显著差异性，因而不能体现出联合用药对于降 低ki-67表达的优越性。
⑤维生素B2与化疗药物5-氟尿嘧啶术后联合应用（相比于术后单独使用5- 氟尿嘧啶）能够降低血清VEGF含量，从而抑制血管生成，抑制肿瘤细胞的迀移。
⑥在肿瘤细胞存在的前提下，单独使用维生素B2能够显著提高E-cad的表达；术后联合应用维生素B2与化疗药物5-氟尿嘧啶也能够显著提升E-cad的表达，且以80%手术组效果最为显著，暗示维生素B2的应用一定程度上可以增强细胞粘附，降低肿瘤细胞扩散和转移的风险。
⑦维生素B2术后辅助化疗不能显著提升机体抗氧化能力，其应用对于血清 中T-SOD，iNOS的浓度无显著影响。
⑧维生素B2辅助5-氟尿嘧啶术后化疗或许能够在保证肿瘤体积以及质量得 到良好控制的前提下改善单独使用5-氟尿嘧啶所引起的肿瘤细胞坏死，因而能 够降低治疗带来的炎症风险，从而一定程度上降低肿瘤复发率。但是该结论有 待进一步验证与阐释。
本课题得到的实验结论提示我们，对于已存在的结肠腺瘤或者癌前病变， 维生素B2的补充是不适当的，因为其潜在的“营养”肿瘤细胞，加快其生长速率。面对于结肠癌患者，应用手术尽可能的将瘤体移除完全，并且术后联合应用维生素B2进行化疗是可取的。因为该方案可以降低再次手术的风险，缓解化疗药物带来的机体免疫抑制，控制肿瘤的血管生成，有效抑制肿瘤细胞的扩散与转移。
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论文作者:张峰
论文发表刊物:《医药前沿》2017年8月第22期
论文发表时间:2017/8/29
标签：肿瘤论文; 小鼠论文; 术后论文; 细胞论文; 维生素论文; 结肠癌论文; 手术论文; 《医药前沿》2017年8月第22期论文;