李彦锋[1]2001年在《重组鼠精子抗原疫苗株的构建及其避孕效应研究》文中研究指明开发有效的免疫性避孕疫苗可能成为控制人口过度增长的理想措施。其主要机理是应用在受精过程中发挥关键作用的分子作为靶抗原用于免疫目标人群使之产生相应免疫反应，从而阻断受精过程，达到避孕目的。近年来的研究显示基于精子抗原开发避孕疫苗是极具现实可行性和应用前景的避孕途径。 精子与卵透明带和与卵子质膜的相互作用是受精过程的关键环节，阻断精-卵作用的这两个环节成为免疫性避孕研究的主要着眼点。精子表面蛋白受精素β亚单位（F_β）定位于精-卵融合的特定区域即精子头部表面赤道区域或头后部区域，它作为一种细胞粘附分子介导了哺乳动物精子与卵ZP的结合及精-卵膜的结合和融合。Cyritestin是一种精子顶体膜蛋白，在IVF条件下，应用其去整合素结构域的合成多肽或单抗可明显抑制精-卵的结合和融合。丧失Cyritestin基因的纯合子雄鼠无生育能力，且缺乏Cyritestin的精子不能与卵ZP结合。可见F_β和Cyritestin在精子与ZP结合及精-卵膜的结合和融合过程中均发挥重要作用，是具有重要潜在价值的睾丸特异性疫苗靶抗原。但国内外至今未见应用可口服的沙门氏菌疫苗株表达该两种蛋白作为疫苗靶抗原诱发免疫性避孕的研究报道。 本研究首次将F_β和Cyritestin作为靶抗原，应用基因重组技术将编码鼠精子F_β蛋白胞外区（含去整合素样结构域）和编码成熟Cyritestin蛋白的cDNA序列插入表达载体pYA3149，并利用沙门氏菌染色体/质粒平衡致死体系，成功地构建了能在沙门氏伤寒杆菌减毒疫苗株X4550、X4632中稳定传代并表达的重组质粒pFEC、pCFL。将分别表达两种精子抗原的四种重组菌口服免疫雌雄小鼠，观察了重组菌在小鼠体内传代的稳定性，雌鼠血清、生殖道内的抗体滴度变化和对其生殖能力的影响，以及雄鼠睾丸、附睾的病理改变。同时为进一步了解精子抗原F产 Cyritestin在受精过程中的重要作用，应用体外受精技术和免疫细胞化学技术分别观察了F，、Cyritestin单抗、抗血清对精平相互作用的影响及该两种精子抗原的特异性定位。本研究的主要结果和结论如下： 一、采用PCR方法，以含F吓DNA的质粒为模板，扩增其胞外区CDNA序列，将该段基因插入表达载体 pYA3 149，构建了重组质粒 pFEC；应用酶切方法从含有Cyritestin cDNA序列的质粒中获得编码成熟Cyritestin蛋白的全基因序列，同法插入上述表达载体，构建了重组质粒pCFL。 二、首次分别将含有鼠精子抗原F卜Cyritestin的两种重组表达质粒pFEC、pCFL转入两种减毒沙门 氏菌疫苗株X4632和 X4550中，成功筛选了四种重组疫苗株。Western blot证实四种重组菌均可成功表达鼠精子 F卜Cyritestin蛋白，其分子量分别为 30KDa和 55KDa大小，且与鼠、人睾丸特异性天然F卜Cyritestin蛋白的抗原性具有相似性。 叁、应用四种重组沙门氏菌疫苗株分别口服兔疫雌性昆明小鼠后，显示均可较稳定地侵入并定居于Peyer’s结，诱导小鼠在产生抗LPS抗体的同时产生抗重组抗原的高滴度血清IgG抗体，其滴度水平从免疫后2周开始逐渐升高，12周时最高可达1：7600；而且可诱导产生阴道粘膜分泌性抗重组抗原屹A抗体，其滴度水平从免疫后 4周开始逐渐升高，12周时最高可达1：35O：＊4632菌株定居于深部组织的能力较＊巧SO菌株明显减弱，但仍可激发与后者相似水平的抗体反应。同时重组疫苗株可诱导雌鼠产生显着免疫性避孕效应，实验组雌鼠妊娠率平均降低30＊0％，每胎产仔数平均降低64．76J0．480。其中以重组X4550（pCFL）组小鼠妊娠率及每胎产仔量降低最为显着，分别为 40％和 70．48％。初步证明以 F。和 Cyritestin为抗原，沙门氏菌为载体的重组疫苗具有显着免疫性避孕效应。目前的疫苗株尚未达到完全避孕的效果，但为研制新型避孕基因疫苗奠定了基础。 四、应用四种重组沙门氏菌疫苗株分别口服兔疫雄性昆明小鼠后，仅部分雄鼠擎丸组织曲细精管管腔中可见散在淋巴细胞浸润，无典型自体免疫性睾丸炎表现，大部分小鼠附睾管腔内精子数无明显减少。表明表 x达精子抗原Fg、Cyritestin的减毒沙门氏菌疫苗株所诱导的自体兔疫效应对机体晕丸附睾组织影响轻微，对其生殖细胞的发育影响不大，具有良好的安全性，支持采用该类减毒沙门氏菌疫茵株用于开发避孕疫苗。 五、F。单抗及抗血清预孵育不同浓度精子后，可使精4的结合指数平均降低了 56．050和 53．260，受精指数平均降低了 52．180和 57．890，受精率平均降低了 41．56％和 47．39％；Cyritestin单抗及抗血清预孵育不同浓度精子后，可使精平的结合指数平均降低了 60．33％和 56二0％，受精指数平均降低了 66．90％和 59．70％，受精率平均降低了 57．41％和45．79％；两者单抗及抗血清均可显着降低体外精柳的结合和融合，从而降低卵细胞的受精率。其中以Cyritestin单抗的作用最为显着。而且F卜Cyritestin均特异性定位于顶体反应前后精子头?
孙中义[2]2007年在《鼠避孕DNA疫苗受精素β_（.ECD）-C3d3的制备及其避孕效应的实验研究》文中研究表明背景与目的:目前虽然己有多种药物、工具及手术用于控制生育,但仍缺乏能为两性所普遍接受的理想避孕措施,随着基因重组技术的发展和人们对受精过程的分子基础和详细机理认识的深入,免疫性避孕疫苗将可能成为控制生育的理想措施。阻断精-卵结合是免疫性避孕研究的热点,精子抗原受精素(fertilin)在精子与卵子透明带(zona pellucida,ZP)结合及与精-卵膜的结合和融合过程中发挥重要作用,是具有重要潜在价值的睾丸组织特异性抗原,受精素单克隆抗体PH-30可抑制体外受精时精卵质膜融合过程,并且PH-30能够抑制豚鼠无透明带卵细胞与精子结合。受精素是由α和β两个亚单位组成的异质二聚体,其中β亚单位(F_β)是重要的功能单位。血清补体蛋白C3是宿主先天性免疫防御补体系统(complement system,CS)的中心分子,在补体活化的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集途径中均发挥枢纽作用。C3d是C3的裂解产物之一,可通过特异性补体受体2(CR2/CD21)将抗原信号提供给免疫细胞,增强特异性免疫应答,降低免疫系统的活化阈,使无免疫原性或免疫原性弱的抗原亦能产生较强的免疫反应,从而发挥极强的免疫佐剂效应,且由于是自身成分,不会出现完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant, CFA)等引起的毒性作用。本研究选择F_β胞外段(F_βextracellular domain, F_β. ECD)作为靶抗原,将F_βcDNA中编码胞外段部分的1168bp-2058bp片段分别插入真核表达质粒pSG.SS.C3d3.YL及pSG.SS.YL中,构建可在真核细胞表达分泌型融合蛋白F_(β.ECD)-C3d3及F_(β.ECD)蛋白的质粒pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD)及pSG.SS.YL-F_(β.ECD),用作免疫接种的DNA避孕疫苗,观察其避孕效果。方法:1.以质粒pYA3149-F_β为模板,PCR扩增得到编码F_β胞外段(1168bp-2058bp)的cDNA片段,再通过限制性内切酶酶切等步骤,分别将该片段定向克隆入真核表达质粒pSG. SS.C3d3.YL和pSG.SS.YL中,构建分别编码F_(β.ECD)-C3d3融合蛋白基因及F_(β.ECD)蛋白基因的质粒pSG.SS. C3d3.YL- F_(β.ECD)和pSG.SS.YL-F_(β.ECD)。2.经酶切及测序证实构建的真核表达质粒pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD)和pSG.SS.YL- F_(β.ECD)符合设计要求。3.采用Western blot、免疫细胞化学染色等技术验证质粒pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD)和pSG.SS.YL- F_(β.ECD)转染真核细胞后能表达F_(β.ECD)-C3d3融合蛋白和F_(β.ECD)蛋白。4.将pSG. SS.C3d3.YL-F_(β.ECD) DNA疫苗接种雌性昆明小鼠,观察雌鼠免疫避孕效应,检测免疫小鼠血清中抗F_(β.ECD) IgG及阴道分泌物IgA抗体滴度变化,同时观察雌鼠血清IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10水平的变化。5.将pSG. SS.C3d3.YL-F_(β.ECD) DNA疫苗接种雄性昆明小鼠,观察免疫避孕效应,检测免疫小鼠血清中抗F_(β.ECD) IgG抗体滴度变化,同时观察免疫鼠血清IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10水平的变化。结果:1.以质粒pYA3149-F_β为模板,PCR扩增获取了编码F_β胞外段的cDNA片段,再通过限制性内切酶酶切等步骤,将该片段定向克隆入真核表达质粒pSG.SS.C3d3.YL和pSG.SS.YL中,构建了编码F_(β.ECD)-C3d3融合蛋白基因及F_(β.ECD)蛋白基因的质粒pSG.SS. C3d3.YL- F_(β.ECD)和pSG.SS.YL-F_(β.ECD)。2.构建获得的真核表达质粒pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD)和pSG.SS.YL-F_(β.ECD)经酶切及测序证实符合设计要求。3. Western blot、免疫细胞化学染色等实验验证,质粒pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD)和pSG.SS.YL-F_(β.ECD)转染真核细胞后能表达F_(β.ECD)-C3d3融合蛋白和F_(β.ECD)蛋白,融合蛋白中的F_(β.ECD)未因其后串联了C3d3而影响特异性单抗对其进行识别,C3d3也未因与F_(β.ECD)的耦联而丧失与受体结合的生物学活性。4. DNA疫苗免疫雌鼠避孕实验结果显示:pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD) DNA疫苗免疫雌鼠后,雌鼠妊娠率降低,一胎产仔数量显着降低,其避孕效应较pSG.SS.YL-F_(β.ECD)显着。特异性抗体在未加强免疫时即已产生,而且滴度高,维持时间长,抗体生成远远强于单独的pSG.SS.YL-F_(β.ECD) DNA免疫。血清IL-2和INF-γ浓度呈降低趋势,IL-4和IL-10浓度呈升高趋势。5. DNA疫苗免疫雄鼠避孕实验结果显示:pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD) DNA疫苗免疫雄鼠后,雌鼠受孕率降低,一胎产仔数量显着降低,血清IL-2和INF-γ浓度呈降低趋势,IL-4和IL-10浓度呈升高趋势,其避孕效应较pSG.SS.YL-F_(β.ECD)显着。结论:1.成功构建了编码F_(β.ECD)-C3d3融合蛋白基因及F_(β.ECD)蛋白基因的质粒pSG.SS. C3d3.YL- F_(β.ECD)和pSG.SS.YL-F_(β.ECD)。2.质粒pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD)和pSG.SS.YL-F_(β.ECD)转染真核细胞后能表达F_(β.ECD)- C3d3融合蛋白和F_(β.ECD)蛋白。3. pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD) DNA疫苗可有效免疫雌鼠,使其妊娠率及一胎产仔数量显着降低,其避孕效应较pSG.SS.YL-F_(β.ECD)显着。pSG.SS.C3d3.YL-F_(β.ECD) DNA疫苗可有效免疫雄鼠,使雌鼠受孕率及一胎产仔数量显着降低,其避孕效应较pSG.SS.YL -F_(β.ECD)显着。4. C3d分子佐剂能升高体液免疫相关细胞因子的表达。综上所述,本研究成功构建了F_(β.ECD)-C3d3 DNA疫苗,可诱导小鼠产生针对F_β的主动免疫反应,产生有效的雌鼠和雄鼠的避孕效应,从而为通过主动免疫方式进行生育控制所需的DNA疫苗的开发和应用奠定了理论和实验基础。
张军[3]2003年在《表达人受精素β去整合素结构域的重组沙门菌疫苗株的构建》文中进行了进一步梳理理想的避孕措施应该具有高效、廉价、安全且可逆的特点，基于精子抗原的避孕疫苗就是符合这一要求的极具潜力的免疫避孕方法。事实上，随着人们在这一领域内认识的不断深入，开发这样的疫苗已经逐渐成为可能，并且天然存在的人类免疫不育的模型也为此项研究提供了研究对象和理论依据。免疫避孕将成为二十一世纪最有应用潜力的避孕途径。精子与卵透明带和卵细胞膜的相互作用是受精过程的两个重要环节，能够阻断这两个过程的精子抗原可能成为用于免疫避孕研究的候选抗原。目前已经筛选出了许多具有较强免疫原性的精子特异性抗原，受精素β作为其中最早定性的ADAM蛋白家族成员得到深入研究。人精子膜蛋白受精素β在精子发生顶体反应后定位于精子头后部区域，即精-卵融合的特定区域，它主要作为一种粘附分子介导了精子与卵透明带的结合以及与精-卵膜的结合和融合。该蛋白由多个保守性结构域构成。IVF试验发现含有去整合素结构域的重组受精素β(βDCE)能够抑制精-卵结合，而去除了去整合素结构域的受精素β(βCE)则不能够抑制精-卵结合。缺乏去整合素结构域的受精素β也丧失了在精-卵相互作用中的生理功能，所以去整合素结构域是其最重要的功能区。目前国内外对于受精素β的研究主要集中于基因-功能关系上，尚无应用减毒沙门菌构建重组疫苗株表达人受精素β去整合素结构域蛋白的报道。传统的免疫方法是将完整抗原直接注射免疫人体，此种免疫方法用于免疫避孕的主要缺陷为难以诱导生殖道内的特异性分泌型抗体产生，且应用不便。为此，近年来有部分学者正致力于开发可口服的免疫避孕疫苗。已有研究发现，沙门菌疫苗株可诱导机体产生高水平的粘膜免疫、细胞免疫和体液免疫应答，是疫苗开发中具有突出应用前景的载运系统。在该疫苗株中，利用沙门菌的平衡致死系统进行营养选择，既保证了外源抗原的稳定表达，又可避免应用在活疫苗中有潜在危险的常用抗生素抗性基因，这对人用疫苗研究非常重要。本研究将人受精素β作为外源性抗原，通过基因重组技术将编码受精素β去整合素结构域的cDNA序列插入表达载体高拷贝质粒pYA3339中，构建重组质粒pYA3339/hf279，并利用沙门氏菌asd＋/asd－平衡致死系统，成功地构建了能稳定表达<WP=8>受精素β去整合素结构域蛋白的重组沙门菌减毒疫苗株X4550(pYA3339/hf279)。本研究的主要结果和结论如下：一、以含人精子膜蛋白受精素β cDNA序列的质粒pT7-7/hf为模板，通过PCR扩增编码其去整合素结构域的cDNA序列，将该段基因插入表达载体pYA3339，成功构建了重组质粒pYA3339/hf279；二、将含人受精素β去整合素结构域cDNA序列的重组质粒pYA3339/hf279最终转化入减毒沙门氏鼠伤寒菌X4550中，成功构建了重组减毒沙门菌疫苗株X4550(pYA3339/hf279)；叁、免疫印迹分析显示重组疫苗株X4550(pYA3339/hf279)可成功表达能被抗人受精素β多克隆抗体识别的重组蛋白HF93。重组蛋白分子量约为16KDa，薄层扫描分析该蛋白约占菌体总蛋白的6％；四、本研究为开发可能应用于人类的口服免疫性避孕疫苗提供重要的靶抗原和载运系统选择依据，并为进一步进行蛋白质功能鉴定和动物试验研究奠定了基础。
李彦锋, 靳风烁, 何畏, 江军, 王洛夫[4]2002年在《表达精子抗原受精素β的重组沙门氏菌疫苗株的免疫性避孕效应研究》文中提出目的 :探讨表达精子抗原受精素β胞外区的重组沙门氏菌疫苗株用作避孕疫苗的可行性。方法 :应用表达精子抗原受精素β胞外区的两种重组沙门氏菌疫苗株 X46 3 2 (p FEC)和 X45 5 0(p FEC)口服接种雌鼠 ,通过 ELISA方法检测其激发雌鼠产生抗重组受精素 β蛋白的血清 Ig G抗体和阴道分泌物 Ig A抗体滴度变化 ,并观察其诱导的雌鼠免疫性避孕效应情况。结果 :重组 X46 3 2(p FEC)和 X45 5 0 (p FEC)疫苗株不但可激发雌鼠产生高水平血清抗重组受精素 β蛋白和抗菌体LPS Ig G抗体 ,而且在阴道分泌物中可出现一定程度抗重组受精素 β蛋白和抗菌体 LPS Ig A抗体。同时 ,口服免疫后的雌鼠生育能力明显降低 ,两实验组雌鼠妊娠率降低 3 0～ 3 5 %,一胎产仔数量平均降低 6 4 .76～ 6 5 .6 4 %。结论 :表达精子抗原受精素β的重组沙门氏菌疫苗株可在小鼠中诱导免疫避孕效应。
李彦锋, 靳风烁, 何畏, 江军, 王洛夫[5]2002年在《表达鼠精子Cyritestin蛋白的减毒沙门氏菌疫苗株的构建及其鉴定》文中认为目的 构建表达鼠精子cyritestin蛋白的可口服减毒沙门氏菌活疫苗株。方法 应用质粒TAZ83/ 13,将之进行双酶切获得含有成熟cyritestin蛋白cDNA序列的酶切片段。将其插入表达载体 pYA314 9中 ,构建重组质粒pCFL。将该重组质粒转入鼠沙门氏伤寒杆菌疫苗株X4 6 32和X4 5 5 0中 ,以获得重组菌株X4 6 32 (pCFL)和X4 5 5 0 (pCFL)。结果 该两种无抗药性的重组菌株在体外营养选择压力下 ,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖。X4 5 5 0 (pCFL)在体内可较稳定地定居于Peyer’s结、肠系膜淋巴结和脾脏 ;X4 6 32(pCFL)可较稳定地定居于Peyer’s结。二者均可表达被抗cyritestin单抗 (mAb)识别的重组cyritestin蛋白。口服该疫苗菌株无明显的毒性作用。结论 X4 6 32 (pCFL)、X4 5 5 0(pCFL)疫苗株的构建 ,为研究以cyritestin为靶抗原的精子抗原避孕疫苗打下了基础
李彦锋, 靳风烁, 何畏, 王洛夫, 靳文生[6]2001年在《表达小鼠精子受精素β胞外区减毒沙门菌疫苗株的构建》文中提出目的 :构建表达鼠精子抗原受精素 β亚单位 (Fβ)胞外区的可口服减毒沙门菌活疫苗株。 方法 :设计一对引物 ,应用PCR方法获得Fβ 胞外区cDNA片断 ,将其插入表达载体pYA3 14 9中 ,构建重组质粒pFEC ,将该重组质粒转入鼠沙门菌疫苗株X4 63 2 ,获得杂合菌株X4 63 2 (pFEC)。该重组菌口服免疫雌鼠 ,通过ELISA方法检测其诱导雌鼠血清IgG抗体和阴道分泌物IgA抗体滴度变化。 结果 :此疫苗株X4 63 2 (pFEC)可稳定表达被Fβ 抗体识别的重组Fβ 胞外区蛋白 ,口服该菌株不但可激发雌鼠产生高水平血清抗重组Fβ 蛋白IgG抗体 ,而且在阴道分泌物中可出现一定程度抗重组Fβ 蛋白IgA抗体 ,无明显毒性作用。 结论 :X4 63 2 (pFEC)疫苗株的构建为研究以Fβ 为靶抗原的精子抗原避孕疫苗打下了基础。
李彦锋, 靳凤烁, 何畏, 江军, 王洛夫[7]2001年在《鼠精子表面蛋白cyritestin在沙门氏菌平衡致死系统中的高效表达》文中认为目的构建表达鼠精子 cyritestin蛋白的可口服减毒沙门氏菌活疫苗株。方法将编码成熟 cyritestin蛋白c DNA序列的酶切片段插入含 p UC复制子的表达载体 p YA3 3 3 9中 ,构建重组质粒 p MCY,将该重组质粒转入鼠沙门氏伤寒杆菌疫苗株 X4 5 5 0 ,获得杂合菌株 X4 5 5 0 ( p MCY)。应用 western blot对重组菌所表达的重组 cyritestin蛋白进行免疫分析。结果该无抗药性的杂合菌株在体外营养选择压力下可较稳定携带重组质粒传代繁殖 ,在体内可较稳定地定居于 Peyer’s结、肠系膜淋巴结和脾脏。该重组菌可高水平表达重组 cyritestin蛋白。结论高效表达 cyritestin蛋白的 X4 5 5 0 ( p MCY)疫苗株可用于免疫性避孕研究
李彦锋, 靳风烁, 何畏, 江军, 王洛夫[8]2003年在《两种表达鼠精子受精素β蛋白的减毒沙门氏菌疫苗株的稳定性分析》文中指出目的 了解表达鼠精子抗原受精素 β亚单位 (Fertilinβsubunit,Fβ)的两种重组减毒沙门氏菌疫苗株X463 2(pFEC)和X45 5 0 (pFEC)的生长特性和体内外携带重组质粒的稳定性。方法 将两种重组沙门氏菌疫苗株X463 2 (pFEC)和X45 5 0 (pFEC)体外传代培养 ,观察比较其生长特性和所含重组质粒的稳定性 ;将该两种重组菌口服免疫BALB c雄性小鼠 ,观察重组菌侵入小鼠Peyer结、肠系膜淋巴结和脾脏等组织内繁殖生长情况和所回收重组菌携带质粒的阳性率。结果 该两种无抗药性的重组菌株在体内、外营养选择压力下均可较稳定携带重组质粒传代繁殖 ,X45 5 0 (pCFL)在体内可较稳定地定植于Peyer结、肠系膜淋巴结和脾脏 ;X463 2 (pCFL)可较稳定地定植于Peyer结 ,均可稳定表达被Fβ单抗识别的重组Fβ蛋白。结论 X463 2 (pFEC)、X45 5 0 (pFEC)疫苗株可作为递呈精子抗原的活菌载体。
丽娜[9]2009年在《绵羊受精素β去整合素结构域的表达及其特异性抗体的制备》文中研究说明精卵结合机制的研究,一方面是动物受精生理的一个重要理论问题,另一方面在免疫避孕及免疫不孕等实际应用中也具有重要意义。受精素β作为少数几种在精卵质膜结合与融合中发挥重要作用的精子膜表面蛋白之一,是多种哺乳动物精子膜均具有的重要蛋白。它属于ADAMs家族,具有ADAMs家族的完整结构域。在受精素β的多个保守性结构域中,去整合素区域作为卵细胞上整合素的配体是其发挥重要生理功能的最主要的功能区。本研究将绵羊受精素β作为外源性抗原,通过基因重组技术将编码受精素β去整合素结构域的cDNA序列插入表达载体高拷贝质粒PGEX-4T-1中,构建重组质粒PGEX-4T-sf279并转化大肠杆菌BL21(DH3)中,成功地构建了能够稳定表达绵羊受精素β去整合素结构域蛋白的重组大肠杆菌疫苗株。本研究的主要结果和结论如下:1、根据绵羊受精素βcDNA全序列设计其去整合素结构域上下游引物,利用PCR方法扩增编码该区域的cDNA片段,将其插入原核表达载体PGEX-4T-1中,构建重组质粒PGEX-4T-sf279;2、将含绵羊受精素β去整合素结构域cDNA序列的重组质粒PGEX-4T-sf279转化入大肠杆菌BL21(DH3)中,用IPTG诱导成功表达了大量融合蛋白,然后利用GST亲和树脂层析纯化,制备了纯度很高的蛋白抗原。3、免疫6-8周龄昆明小鼠,制备了小鼠抗羊多克隆抗血清。经Western Blot分析显示,多克隆抗血清可与纯化的绵羊重组蛋白发生特异性反应,说明重组蛋白具有抗原活性。.4、本研究为进一步进行绵羊受精素β蛋白在精卵结合和融合过程中的功能研究奠定了基础。
杨树洪[10]2004年在《抗牛精子膜蛋白单链抗体基因的克隆与表达》文中进行了进一步梳理由于精子膜蛋白结构上的多形性、功能上的复杂性，加之缺乏有效的分离纯化手段，有关精子膜蛋白的研究一直是一个难点。sp18是由本实验室首次发现的一组牛精子膜蛋白，由于尚未纯化得到sp18，有关sp18的研究难以突破。为此，本研究从分泌抗sp18单抗的杂交瘤细胞入手，欲克隆其抗体基因并分析其序列特征，以此推测其针对的抗原性质。 应用重组噬菌体抗体库技术，从分泌小鼠抗牛精子sp18抗体的杂交瘤细胞系中分离总RNA，克隆抗体重链和轻链可变区基因，加入连接肽引物(Linker primer)组装成单链抗体ScFv(single chain fragment variable)基因并用RS引物进行扩增，Sfi Ⅰ、Not Ⅰ酶切，回收后与pCANTAB5E载体相连，转化E.coli TG1宿主菌，构建单链抗体文库。经辅助噬菌体M13K07超感染，将ScFv展示于噬菌体表面。以牛精子作为包被抗原，经过叁轮“亲和吸附-洗脱-扩增”的淘选后，进行phage-ELISA筛选和鉴定，在波长450nm处测定吸光值，吸光值在阴性对照两倍以上的视为阳性克隆。取阳性重组噬菌体抗体克隆株pCSA1，PCR扩增其ScFv基因，筛选重组子进行序列测定，发现其序列符合小鼠抗体基因的一般特征，并且与几株抗磷酸胆碱的抗体重链和轻链可变区序列的同源性达80％以上；推测pCSA1 ScFv针对的抗原是磷酸胆碱类物质。将pCSA1 ScFv基因克隆到pET-30a(+)载体上，用IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE蛋白电泳分析，发现重组蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30％。这些结果表明，本研究成功获得了杂交瘤细胞的单链抗体基因，并且在大肠杆菌细胞中得到了高表达；推测抗sp18单抗针对的抗原可能是磷酸胆碱类物质。 精子蛋白种类繁多，为了进一步研究牛精子蛋白功能，本研究欲构建一个针对牛精子的噬菌体抗体文库。首先用牛精子免疫雌性四周龄BALB／c小鼠，从其脾脏组织分离总RNA，应用重组噬菌体抗体库技术，构建了一个针对牛精子的噬菌体抗体文库。经PCR检测，计算文库的有效库容为1.2×10~4TFU。用phage-ELISA从文库中筛选并鉴定出一个针对牛精子的阳性克隆，序列分析发现，该单链抗体克隆的序列符合小鼠抗体可变区的一般特征，这说明构建的针对牛精子的噬菌体抗体文库是成功的。 本研究成功获得了杂交瘤细胞的单链抗体基因，并且推测抗sp18单抗针对的抗原可能是磷酸胆碱类物质；成功构建了针对牛精子的噬菌体抗体文库，为日后牛精子蛋白的功能研究与应用研究奠定了一定的基础。
参考文献：
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