李文玲[1]2002年在《猪囊尾蚴一种蛋白抗原的分子克隆》文中研究说明目的：为了从分子水平研究猪囊尾蚴的基因结构，本研究构建了猪囊尾蚴的cDNA文库从中筛选出编码某种蛋白抗原的基因。 方祛：用异硫氰酸胍一步法提取猪囊尾蚴总RNA，经反转录合成cDNA片段后，将其与Uni—ZAP XR载体连接、包装成噬菌体构建猪囊尾蚴cDNA文库。以免抗猪囊尾蚴多克隆抗体筛选cDNA文库，得到一个阳性克隆(命名为pTS)。将此阳性克隆亚克隆到pBluescript SK质粒中，以载体臂上的通用引物采用双脱氧末端终止法测定插入片段的核苷酸序列，GENETYX软件分析核苷酸序列编码的氨基酸序列，并在GeneBank中进行核苷酸与氨基酸序列同源性检索。 结果：从cDNA文库中筛选出的基因片断，其长度为1358bp，含有一个开放读码框，编码434个氨基酸，分子量为50785Da，5′端未发坝启动子，3′端未发现poly(A)信号，但有PolyA尾巴。开放读码框末端有由TAA组成的终止密码子。氨基酸序列中疏水性残基占40.09％(174／434)、亲水性残基占41.24％(179／434)、中性残基占17.74％(77／434)，有两个糖基结合位点。同源性检索表明pTS片段的部分核苷酸序列与恶性疟原虫红细胞表面抗原(ESA)同源性达100％，部分序列与D.melanogaster的弹性蛋白酶抑制素同源性达97％。其编码的434个氨基酸中的30—423个氨基酸与人、D.melanogaster、新杆状线虫和小鼠的α—血影蛋白同源性分 中文摘要别为 49O／、58％、47％禾 49O／，其中 3＊05之间的一与人类pj影蛋白有3Th的同源性。 e：ph cDNA片段的核昔酸部分序列与 D．melanowt弹性蛋白酬制素基因的部分序列驱同源，部颁列与珊疟原虫红细胞表面抗原基因相关。其氨基酸序列与人、D．melmpaste、新杆状线虫、小鼠的。一血影蛋白有同源性，与人p血影蛋白同源性较低。
刘殿武, 李文玲, 张丽梅[2]2004年在《猪囊尾蚴一种蛋白抗原基因的分子克隆》文中研究指明目的 从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选出编码某种蛋白抗原的基因。 方法 提取猪囊尾蚴mRNA ,经反转录合成cDNA ,构建cDNA文库。以兔抗猪囊尾蚴多克隆抗体筛选cDNA文库 ,得到阳性克隆后 ,将其亚克隆到pBlue scriptSK质粒中 ,以载体臂上的通用引物采用双脱氧末端终止法测定插入片段的核苷酸序列 ,GENETYX软件分析核苷酸序列编码的氨基酸序列 ,在GenBank中进行核苷酸序列同源性检索。 结果与结论 经过 3次筛选 ,从cDNA文库中筛选出一个长度为 13 2 0bp的基因片段。此克隆的开放阅读框为 12 60bp ,编码 42 0个氨基酸 ,含有两个糖基结合位点。与GenBank中的基因进行同源性分析 ,其部分核苷酸序列与秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditiselegans)红细胞膜内蛋白和恶性疟原虫 (Plasmodiumfalciparum )红细胞表面抗原高度同源
杨洁, 张丽梅, 刘殿武[3]2004年在《猪囊尾蚴一种蛋白抗原的cDNA分子克隆》文中进行了进一步梳理目的 从猪囊尾蚴 c DNA文库中克隆某种编码蛋白抗原的基因。方法 用脑囊尾蚴病人血清筛选猪囊尾蚴 c DNA文库 ,获得阳性克隆后 ,经 PCR技术扩增噬菌体载体中插入的 c DNA片段 ,并将其亚克隆入 p U C18质粒载体中 ,用双脱氧核苷酸末端终止法测定插入片段的核苷酸序列。测序后与 Gen Bank中的核苷酸序列进行同源性分析。结果 经 3次筛选 ,从 c DNA文库中克隆出一个阳性克隆 ,测序后其长度为 5 4 6 bp,含有一个开放读码框 ,编码 15 8个氨基酸。同源序列分析结果表明此基因片段与编码猪囊尾蚴的一种免疫原性蛋白基因 (NC- 9)同源性高达 99%。结论 本研究克隆出一种编码猪囊尾蚴蛋白抗原的基因
杨洁[4]2003年在《猪囊尾蚴特异性抗原基因的cDNA的分子克隆》文中研究指明目的：囊虫病是由囊尾蚴引起的人兽共患病，是一种世界上分布较广的寄生虫病。囊尾蚴常在脑、眼、心脏等重要器官寄生，其中以寄生于神经系统的脑囊虫病引起的临床症状最为严重，极大危害了人类健康。然而目前临床上对该病的诊断仍以CT或磁共振（MR）作为最主要的客观指标。但鉴于CT或MR高昂费用，因此单凭CT或MR作为标准进行疗效评价及大规模的流行病学普查是很不现实的。研制简便、快速、准确的诊断方法及诊断试剂已成为当前国内外医学专家攻克该病的工作的重点。随着基因工程技术手段不断完善，分离出特异性高、敏感性好的蛋白抗原已成为可能。本研究采用基因重组技术，以开发囊虫病特异性诊断用融合抗原和预防用疫苗为目的，从已构建的猪囊尾蚴cDNA文库中拟筛选出囊尾蚴特异性抗原基因，从而为进一步研究其蛋白质功能、结构奠定基础。 方法：1、病人血清的预处理：将经CT或磁共振（MR）确诊的脑囊虫病人血清按1：10比例稀释于TBS缓冲液中，稀释后血清与液氮反复冻融后的XL1-Blue-MRF'菌裂解液充分混合，室温放置4小时，500g离心10 min，取上清收获吸附后抗血清。2、cDNA文库免疫学筛选：用此血清作为一抗，以辣根过氧化酶标记的羊抗人抗体作为二抗，筛选已构建的猪囊尾蚴cDNA文库，获得含阳性cDNA的噬菌体，经液体培养后提取噬菌体DNA。3、阳性cDNA片<WP=4>段的PCR扩增：以筛选出的噬菌体DNA为模板，利用cDNA插入片段两端的通用引物T3 和T7进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，56℃退火1min，72℃延伸1 min, 30个循环结束72℃延伸10 min。4、cDNA片段的亚克隆：PCR扩增产物经低熔点琼脂糖凝胶回收纯化后，经EcoR I及Kpn I末端修饰与含相应粘性末端的PUC18质粒载体进行体外定向重组，连接产物转化感受态E.coli JM 109，在含氨苄青霉素、IPTG以及x-gal的LB培养基培养，根据β-半乳糖甘酶的α互补原则筛选重组子挑选白色菌落，按碱裂解法提取质粒后进行双酶切，鉴定是否含有插入片段，5、序列测定及同源性比较：用Sanger双脱氧末端终止法测定插入片段的核苷酸序列，用GENETYX软件分析推导核苷酸序列编码的氨基酸序列，并在NCBI中经过BLASTN及BLASTP进行核苷酸及氨基酸序列同源性检索，寻找同源片段。6、进行Northern 杂交分析确定该阳性片段mRNA大小：利用异硫氰酸胍一步法提取猪囊尾蚴总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法测定其完整性、纯度以及含量；走RNA变性电泳（甲醛变性凝胶电泳）分离RNA，以20 x SSC作为转移液经毛细管虹吸作用将变性凝胶中RNA转移至尼龙膜上，80℃干烤2小时固定RNA，以筛选出的阳性cDNA片段为模板按照随机引物标记法对其进行同位素标记制备杂交用探针，与尼龙膜上已经过预杂交的RNA进行杂交反应，洗膜后进行放射自显影，确定杂交信号大小。结果：从cDNA文库中筛选出长度为553bp的cDNA片段（命名为cYI），Northern 杂交结果也显示在0.6 kb 处<WP=5>有一杂交带。该基因片段含有一个开放读码框，位于2-484bp处，编码160个氨基酸，分子量为18.34kDa。序列5'端未发现起始密码子，末端有TAA组成的终止密码子位于第481 bp处； 3'端有poly（A）信号及poly（A）尾巴；其核苷酸序列中（A+T）%=56%，（G+C）%=44%；该片段含有限制性内切酶位点：第38位含有Pst I、83位中含有Sph I、74、283位中含有Rsa I限制性内切酶酶切位点。其氨基酸序列中疏水性残基占33.75%(54/160)、亲水性残基占46.88%(75/160)、中性残基占19.38%(31/160)。经过NCBI中的BLASTN及BLASTP同源序列分析表明cYI片段与编码猪囊尾蚴的一种免疫原性蛋白基因（命名为NC-9）同源性较高，对cYI基因与NC-9基因进行核苷酸序列及氨基酸序列比较发现：cYI基因序列从第8位开始包含了全部NC-9基因，其中仅有8个位点的碱基发生了改变，同源性高达98%；cYI编码的160个氨基酸残基，从第30位的氨基酸开始直到编码序列结束，共有130个氨基酸残基，仅有3个位点的氨基酸残基不同，同源性高达97%。同源序列分析中未发现大片段高同源性的其他物种的基因片段。结论：本实验从猪囊尾蚴cDNA文库筛选出一长553 bp的基因，此基因片段编码的蛋白质能与病人血清发生特异性反应。
余招锋[5]2004年在《猪带绦虫45W-4B基因在大肠杆菌和家蚕中的表达及45W蛋白结构和功能的初步研究》文中研究表明猪带绦虫 ４５Ｗ 基因家族是由一群结构和功能相似的基因组成的。４５Ｗ 基因在反式剪接作用下产生 Ａ、Ｂ 和 Ｃ 叁型转录本，其中 Ａ 型转录本是由外显子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组成；Ｂ 型转录本由Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ组成；Ｃ 型转录本由Ⅰ和Ⅳ组成，在不同的转录本中的同一外显子有高度的同源性，也存在变异。 ４５Ｗ 基因已被认为是预防猪囊尾蚴病的基因工程疫苗侯选基因之一。本试验成功地从六钩蚴中克隆到 ４Ｂ 基因。通过对 ４Ｂ 基因序列的比较，发现 ４Ｂ 基因是 ４５Ｗ 基因中较为特殊的一个基因，该基因与 ４５Ｗ 其他相关基因之间变异范围为 １７．８％－２０．６％，但该基因在不同虫株间和不同克隆间高度保守。为了研究 ４Ｂ 蛋白的结构和功能，并为研制和开发有效的猪带绦虫基因工程疫苗打下基础，本研究将 ４Ｂ 基因及其 ３′－端的剪切片段克隆到 ｐＥＴ－２８ａ 载体中，并在大肠杆菌 ＢＬ２１ 中成功地表达，与预期分子大小一致，为 １８ ｋＤａ，经 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测，表达的重组蛋白能被猪囊尾蚴病人血清识别，为开发高效猪囊尾蚴基因工程疫苗打下了基础。 ４５Ｗ 基因的这独特的交替剪接形式引起了寄生虫学家们的广泛兴趣。为了研究４Ｂ 蛋白在猪囊尾蚴组织中的结构和功能，试验中利用大肠杆菌表达系统表达的 ４Ｂ 重组蛋白，分子量约为 １８ ｋＤａ，腹腔注射免疫小白鼠，经两次免疫后，采血，并用该血清与猪囊尾蚴组织匀浆蛋白做免疫印迹，发现在 ５０ ｋＤａ 处有一明显的印迹条带，而 １８ ｋＤａ 处没有。表明在猪囊尾蚴组织蛋白中 ４５Ｗ 蛋白各型蛋白可能以同型或异型寡聚体形式存在。用计算机软件分析发现 ４Ｂ 蛋白的抗原性很好，用蛋白质结构数据库 （Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ， ＰＤＢ）比较，发现 ４Ｂ 蛋白（包括 ４５Ｗ 其他型）存在纤连蛋白（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ， ＦＮ）结构域。４５Ｗ 蛋白寡聚体形式组成与纤链蛋白的组织构成十分相似，推测 ４５Ｗ 蛋白与猪囊尾蚴囊壁的形成有关。 家蚕表达系统通过将外源目的基因插入家蚕核多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）多角体启动子（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）的下游，外源基因利用多角体启动子进行转录表达，并分泌到细胞外，从而在细胞上清获得重组目的蛋白。家蚕表达系统（ｓｉｌｋｗｏｒｍ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ， ＢＥＶＳ）表达的目的蛋白能够进行正确的加工、修饰，使目的蛋白更接近于天然蛋白。同时家蚕细胞能识别哺乳动物的分泌蛋白的信号肽序列。４Ｂ 基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体 ｐＶＬ１３９３ 中，通过与家蚕杆状病毒（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ， ＢｍＮＰＶ）在家蚕 Ｂｍ 细胞中共转染，重组到 ＢｍＮＰＶ 中，通过筛选纯化，获得重组病毒。重组病毒感染家蚕细胞和 ５龄家蚕，表达 ４Ｂ 蛋白，分子量约为 １６ ｋＤａ， 与预测的大小相吻合。并用 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ<WP=6>鉴定该重组蛋白能识别猪囊虫病人（猪）阳性血清。４Ｂ 基因在家蚕细胞中的表达对进一步研究 ４５Ｗ 基因的结构功能，并开发出更可行、方便的基因工程疫苗打下基础。
陈晓宇[6]2008年在《表达TsoL18抗原的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗的构建》文中研究表明囊尾蚴病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫囊尾蚴(Cysticercus cellulose)寄生于人或猪等而引起的人畜共患寄生虫病,是公认的世界经济病之一。囊尾蚴病在中国大部分地区尤其在少数民族地区是一个重要的公共卫生问题,严重威胁着人体健康,不仅如此,猪囊尾蚴病的广泛存在极大影响了我国畜产品在国际市场上的竞争力,给畜牧业造成重大经济损失,猪囊尾蚴病的免疫防治势在必行,然而在猪囊尾蚴病疫苗研究中,疫苗抗原的选择和来源一直困扰着兽医工作者。Tsol18是猪带绦虫六钩蚴(T. solium oncosphere)阶段特异性表达的抗原,主要在六钩蚴感染中间宿主的早期阶段分泌,其免疫血清在体外试验中能杀死六钩蚴,是猪囊尾蚴病疫苗研制的主要候选抗原之一。在已有的研究中,Tsol18重组蛋白在原核系统中多以包涵体形式表达,给蛋白质的复性和纯化带来许多困难,并且包涵体活性较低、保存期短、降解快,因而限制了Tsol18在猪囊尾蚴病疫苗研制上的应用。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种常见的侵袭性胞内菌,通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显着降低,但仍保留良好的侵袭力,可将免疫抗原直接递呈给免疫细胞而诱导特异性的免疫应答反应,减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫苗载体是目前疫苗免疫研究的热点之一。为了优化猪囊尾蚴病疫苗候选抗原Tsol18重组蛋白,探索猪囊尾蚴病口服重组活载体疫苗的免疫机制,研究其在猪囊尾蚴病免疫预防上的作用,进行了本项研究。收集成熟的猪带绦虫虫卵,经孵化和激活后,提取六钩蚴总RNA,设计特异性引物RT-PCR扩增Tsol18基因片段,并同义突变Tsol18基因片段中四个大肠杆菌低利用率密码子,截去其N端的16个氨基酸的信号肽编码序列,构建原核表达载体pGEX-4T-Tsol18并表达,进行GST-Tsol18重组蛋白的SDS-PAGE、Western-blot及稳定性分析,并以GST-Tsol18重组蛋白为抗原制备兔高免血清;将改造的Tsol18基因片段插入Asd+的组成型表达载体pYA3341,构建重组载体pYA3341-Tsol18,将重组载体电转化入缺失腺苷酸环化酶(Δcya)、环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp)以及天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(Δasd)的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,研究重组活载体疫苗X4550(pYA3341-Tsol18)表达Tsol18重组蛋白的免疫原性、生长稳定性、口服安全性及ELISA检测免疫小鼠血清中抗Tsol18抗体的产生情况,评价重组疫苗X4550(pYA3341-Tsol18)的免疫效果。结果显示改造后的GST-Tsol18重组蛋白多以可溶性形式表达,蛋白表达量占菌体总蛋白的24%,Western-blot证明GST-Tsol18重组蛋白具有良好的抗原性,4℃保存120d只有20.1%降解,显示重组蛋白稳定性有很大改善。重组疫苗X4550(pYA3341-Tsol18)在没有选择压力的情况下连续培养100代后,随机挑选的重组疫苗株全部都能生长和表达Tsol18重组蛋白,表明重组疫苗生长稳定;BALB/c鼠口服重组疫苗株2.0×1012cfu30天后,存活率100%,证实重组疫苗口服安全可靠。ELISA检测显示在二免后四周小鼠血清中抗Tsol18IgG抗体的OD值达到0.645,表明重组疫苗能激发机体产生免疫应答反应。本研究获得了具有高效表达、良好免疫原性和稳定性的猪囊尾蚴病疫苗候选抗原GST-Tsol18重组蛋白,构建了携带Tsol18重组蛋白的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗X4550(pYA3341-Tsol18),初步评价了重组疫苗的免疫效果,为猪囊尾蚴病基因工程疫苗的研制开拓了新的思路。
种法政[7]2008年在《抗猪囊尾蚴单克隆抗体轻重链可变区基因扩增和序列分析》文中研究说明猪囊尾蚴病是由猪带绦虫的幼虫(囊尾蚴)引起的一种人畜共患病。我国人体囊尾蚴病分布广泛,严重威胁着广大人民健康。多年来防治本病主要是以药物防治为主,但是由于抗药性的不断出现及药物残留等问题的严重性,限制了其在临床上的应用。进入20世纪80年代后,分子生物学技术的快速发展促进了抗体研究的进展,基因工程抗体应运而生。其中单链抗体是目前应用最为广泛的重组抗体,在各个领域均有大量研究报道。但在寄生虫研究中尤其是猪囊尾蚴领域没有单链抗体的报道。本实验克隆出抗猪囊尾蚴单克隆抗体轻重链可变区基因片段,为抗猪囊尾蚴单链抗体的构建奠定了基础。方法:首先,复苏分泌抗猪囊尾蚴单克隆抗体杂交瘤细胞,培养至最佳生长状态,琼脂糖扩散试验检测分泌抗猪囊尾蚴单克隆抗体杂交瘤细胞的活性。取活性高的杂交瘤细胞,用Trizol一步法提取分泌抗猪囊尾蚴单克隆抗体杂交瘤细胞总RNA。然后,根据genebank公布的相关序列,合成两对特异性引物,以提取的总RNA为模板,经一步法RT-PCR反应扩增抗体轻重链可变区基因。最后,将扩增抗体轻重链可变区基因与克隆载体pMD18-T连接,琼脂糖电泳检测后,转化于感受态细胞JM109。蓝白斑法筛选出阳性重组子进行菌落PCR鉴定。取含有阳性重组子的菌液送至生物公司测序。结果:提取分泌抗猪囊尾蚴单克隆抗体的杂交瘤细胞总RNA后,应用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测提取得总RNA。结果显示:A_(260/280)值=1.96;RNA琼脂糖凝胶电泳可以清晰地看到28sRNA,18sRNA的条带。证明得到了能够分泌抗猪囊尾蚴特异性单克隆抗体杂交瘤细胞总RNA。以提取的总RNA为模板,一步法RT-PCR反应扩增抗体轻重链可变区基因。经琼脂糖凝胶电泳检测,轻链可变区基因和重链可变区基因长度在400bp左右,符合鼠抗体特征,表明得到了抗猪囊尾蚴单克隆抗体轻重链可变区基因片段。经琼脂糖凝胶电泳检测回收后连接克隆载体pMD18-T,转化感受态细胞JM109,蓝白斑法筛选出阳性重组子,以通用引物对阳性重组子进行鉴定,菌落-PCR检测证明重组子为阳性。测序结果显示:重链可变区基因全长为357bp,编码119个氨基酸;轻链可变区基因全长315bp,编码105个氨基酸。同源性比较结果显示:重链的同源性为94%,轻链的同源性为96%,符合鼠抗体轻链可变区和重链可变区基因特征。抗原表位互补结合的互补决定区(CDR)基因有多数发生改变,且在重链可变区基因的CDR2中有基因缺失现象,轻链可变区基因的CDR3中有基因缺失现象。
李海龙[8]2006年在《猪囊尾蚴T24基因的克隆、表达与免疫原性分析》文中认为从猪囊尾蚴中提取总RNA,用Oligo软件设计T24基因特异性引物,通过RT-PCR扩增出716bp的片段,扩增产物连接到pGEM-T Easy载体中,经酶切鉴定、PCR分析和测序后证明,所克隆的716bp片段含T24蛋白基因完整的开放阅读框(ORF),其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与Genbank登录的T24基因相应序列的同源性分别是98%和100%。将重组质粒pGEM-T24和原核表达载体pGEX-4T-1分别用EcoRⅠ和SalⅠ酶切,亚克隆T24基因至原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,经酶切、PCR和测序鉴定证明,T24基因正确插入到pGEX-4T-1载体。用ITPG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE和Western-blotting分析证实T24基因在大肠杆菌中成功表达,目的蛋白与GST形成融合形式,分子量大小为40ku左右,能被猪囊尾蚴阳性血清所识别;将表达产物免疫小鼠,进行间接ELISA检测,其抗血清能与猪囊虫粗抗原及纯化的T24重组融合蛋白产物发生免疫学反应。将重组质粒pGEM-T24和真核表达载体pPIC9K分别用EcoRⅠ和NotⅠ酶切,亚克隆T24基因至真核表达载体pPIC9K中,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆提取pPIC9K-T24。用SalⅠ内切酶线性化重组质粒pPIC9K-T24,然后电转化毕赤酵母GS115。采用G418浓度梯度法对所有在营养缺陷型选择培养基MD上生长出的转化子进行筛选,获得的高拷贝重组菌株。用PCR检测表明有目的基因整合。用1%甲醇诱导表达重组菌株,通过SDS-PAGE、Western-blotting对表达产物进行分析,结果表明T24基因在毕赤酵母中成功表达,表达产物的分子量为21ku左右,能被人囊虫阳性血清所识别。本研究克隆了猪囊尾蚴T24基因,分别在原核和真核表达系统中进行了表达,证实其表达产物具有免疫原性,从而为研制猪囊尾蚴基因工程疫苗提供了理论依据和实验材料。
王娜[9]2009年在《膜联蛋白B2的结构与功能研究》文中提出膜联蛋白(annexin)家族是在真核生物中广泛存在,具有重要生理功能的一类钙依赖性磷脂结合蛋白。因其在Ca2+存在的情况下能够和酸性磷脂结合,所以又称为钙依赖性磷脂结合蛋白。膜联蛋白B2 (AnxB2)是本实验室从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选得到的一个新的膜联蛋白B家族成员。它具有四个典型的annexin重复结构域,每个结构域包含一个“G-X-G-T-(38 residues)-D/E”基序,形成4个type II型Ca2+结合位点;经生物信息学分析可知,AnxB2分子结构中包含15个抗原表位;AnxB2在II和III结构域之间存在2个独特的“插入片段”和一个“赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(KGD)”序列并且AnxB2还具有一个独特的粘多糖附着位点(G-AS)。我们根据AnxB2已有的结构特征来研究AnxB2的生物功能,为AnxB2功能的进一步研究奠定基础。本课题的研究分为叁个方面:1、从猪带绦虫六钩蚴中克隆出AnxB2基因,证明AnxB2在六钩蚴阶段表达。接着借助计算机同源模建技术构建了4个AnxB2突变体M234,M134,M124,M123。用基因重组技术将AnxB2及其突变体分别构建到真核表达载体pcDNA3.1中,并用阳离子脂质体介导的方法转染真核细胞,检测结果表明构建的真核质粒能够表达相应的目的蛋白;同时也构建了AnxB2突变体的原核表达载体并用亲和层析技术纯化相关蛋白。另外,利用膜联蛋白的钙依赖性磷脂结合活性构建的pJLA503-AnxB2表达载体使AnxB2在大肠杆菌中实现了高表达;接着采用钙离子介导的沉淀反应来初步纯化重组蛋白;随后用离子交换层析技术进一步纯化蛋白。用改良的纯化方法,我们制备出高纯度和高生物活性的AnxB2。2、对AnxB2进行免疫学方面的研究。将真核表达质粒分别免疫BALB/c纯系鼠,以间接ELISA检测免疫小鼠血清的抗体应答水平;淋巴细胞增殖实验检测免疫动物CD4+T细胞的活化状态;淋巴细胞细胞因子试验检测免疫小鼠的细胞免疫应答水平。结果表明,免疫注射的DNA疫苗虽然均能诱导Th1型免疫应答反应,但是它们诱导机体产生的免疫应答水平不同:pcDNA3.1-M234组诱导的抗体水平最低和pcDNA3.1-M123组分泌的IFN-γ水平最低;“DNA prime-protein boost”组诱导的抗体水平和分泌的IFN-γ水平最高。根据结果,我们可以推断:M234缺失的抗原表位为B细胞表位,而M123缺失的表位是T细胞表位;“DNA prime-protein boost”策略可有效增强机体的特异性免疫应答。3、对AnxB2进行抗凝血活性方面的研究。结果表明:AnxB2具有外源性抗凝血活性;与活化血小板结合的能力更强(versus AnxB1)。从结果我们可知,用改良的纯化方法制备的AnxB2保留了原来的生物活性,验证了这种纯化方法的可行性。随后对AnxB2突变体M123、M234进行抗凝血活性和免疫原性研究。结果表明,M234不仅较好的保留了野生型AnxB2的抗凝血活性,而且免疫原性降低,这为进一步研究膜联蛋白AnxB2的抗凝血功能和研制高效、低免疫原性的靶向溶栓剂奠定了基础。
刘英丽[10]2006年在《猪囊尾蚴cYI基因重组子的建立及表达》文中认为目的:本研究采用基因重组技术,构建猪囊尾蚴cYI基因原核表达载体,观察其在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究cYI基因的蛋白质结构和功能,从而为开发囊虫病特异性诊断抗原和基因疫苗提供理论依据。方法:1目的基因的获得:以本室保存的猪囊尾蚴进行RNA的提取,根据已知基因序列设计引物,进行RT-PCR,条件为:37℃50 min ,94℃预变性5min,按94℃1min,56℃1min,72℃1min进行30个循环,最后72℃延伸10min,4℃保存备用。2重组质粒转化感受态菌DE3:RT-PCR扩增产物经低熔点琼脂糖凝胶回收纯化,用NdeI及XhoI末端修饰后与经相同酶消化、回收的原核高效表达载体pET28b进行体外定向重组,连接产物转化感受态菌DE3,同时设立对照组,在含卡那霉素的LB固体培养基中培养,挑选白色单一菌落,按碱裂解法提取质粒后进行双酶切,鉴定是否含有插入片段。3重组表达:将含有目的基因的阳性菌于37°C活化后转种到LB(含卡那)液体培养基中。次日按1:100的比例转种到LB(含卡那)液体培养基中继续在37°C振荡培养至对数生长中期,分别于诱导前,诱导后1h、2h、3h、4 h取菌液1ml,离心,收集菌体并用TE Buffer悬浮。
参考文献：
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[5]. 猪带绦虫45W-4B基因在大肠杆菌和家蚕中的表达及45W蛋白结构和功能的初步研究[D]. 余招锋. 西北农林科技大学. 2004
[6]. 表达TsoL18抗原的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗的构建[D]. 陈晓宇. 甘肃农业大学. 2008
[7]. 抗猪囊尾蚴单克隆抗体轻重链可变区基因扩增和序列分析[D]. 种法政. 吉林农业大学. 2008
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