蒋红，杨明辉，张梦云，雷佳红，赵明才
(川北医学院附属医院 四川南充 637000)
【摘要】目的：探讨奥沙利铂(Oxaliplatin，L-OHP)对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响。方法：应用MTT方法检测L-OHP对肝癌细胞HepG2生长的抑制作用；RT-PCR法观察L-OHP对细胞增殖的影响。结果：L-OHP可显著抑制HepG2细胞的增殖，使细胞阻滞于S期；随着作用时间及药物浓度的增加，L-OHP对HepG2细胞的抑制作用就越明显。结论：L-OHP能够使HepG2细胞阻滞在S期，明显抑制肝癌细胞HepG2的增殖。
【关键词】奥沙利铂；肝癌；细胞增殖
The effects of oxaliplatin on the cell proliferation of hepatoma cell line HepG2
Jiang Hong, Yang Ming-hui, Zhang Meng-yun, Lei Jia-hong, Zhao Ming-cai,
(The Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College Nanchong Sichuan, 637000, China)
[Abstract] Objective：Investigate the effects of oxaliplatin (Oxaliplatin, L-OHP) on the cell proliferation of human hepatoma cell line HepG2 cells. Methods：Inhibitory effect of L-OHP on the proliferation of HepG2 cells was determined by MTT assay; cell proliferation level was detected by RT-PCR. Results：L-OHP can significantly inhibit the proliferation of HepG2 cells; the cells were blocked at S phase; with the increase of treatment time and drug concentration, effect of L-OHP on HepG2 cells grew more obvious in vitro. Conclusion：L-OHP can block HepG2 cells at S phase therefore significantly inhibit the proliferation of HepG2 cells.
[keyword] oxaliplatin; liver cancer; cell proliferation
原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma HCC)是我国常见的恶性肿瘤，发病率较高，早期无症状或症状不明显，但其进展迅速，确诊时大多数患者已经到局部晚期或发生远处转移，治疗困难，预后很差[1]。奥沙利铂(Oxaliplatin，L-OHP) 属于新的铂类抗癌药，化学名为左旋反式二氨环己烷草酸铂, 国际通用名为草酸铂，是第三代铂类抗癌化合物。已有研究表明，该药对人和鼠多种肿瘤细胞均有抑制作用，L-OHP通过产生水化衍生物作用于DNA，形成链内和链间交联，从而抑制DNA 的合成，产生细胞毒作用和抗肿瘤活性[2]。临床资料还表明，L-OHP治疗多种类型肿瘤时无论单用或联合应用都有较好的疗效，不良反应小，化疗指数高，安全范围广。因此本研究通过抗肿瘤药物L-OHP对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响，为进一步探索L-OHP治疗应用于原发性肝癌的临床治疗提供依据[3-4]。
1 材料与方法
1．1 细胞株及细胞培养 人肝癌细胞系HepG2由川北医学院分子生物研究所提供，用含10％胎牛血清的1640培养液培养，在37℃、5%CO2培养箱中进行培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况。达传代要求时，去掉培养液，用PBS洗涤细胞三次，吸干瓶内液体，即加0.25％的胰酶溶液（以覆满瓶底为限）将贴壁细胞消化分离，后加入完全培养液，轻轻吹打均匀，使细胞彻底从培养瓶底壁脱落，按1：3比例进行传代培养。取对数生长期的细胞用于实验。
1．2主要试剂与仪器 L-OHP由江苏恒瑞医药股份有限公司生产，-20℃保存（实验时配用）；胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）（均购自美国Gibco公司)；胎牛血清、1640培养液(均购自HyClone公司)；甲基偶氮唑蓝 (MTT，美国sigma公司)，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7．2)配制成5 mg/ml的溶液，- 20℃避光保存。生物安全柜[HFSafe 1200,CO.,Ltd.(Hong kong)]；CO2培养箱（Heal ForceHF90)；倒置显微镜（OLYMPUS IX71）；酶标仪（美国Bio-RAD）；定量PCR仪（ABI公司）。
1．3细胞增殖的测定选
应用标准化MTT比色法，取对数生长期的HepG2细胞，用含10%胎牛血清的1640培养液配制成5×103个/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔150μl。培养24h后加入不同浓度的L-OHP，使其终浓度分别为0、4、32、64、128μg /ml，每个浓度设8个复孔。加药后分别培养24 h、48 h、72 h，吸去原培养液，每孔加200μl无血清1640培养液及MTT 20μl，继续培养4 h。吸出各孔原液，每孔加入150μl DMSO，混匀10 min后，在酶标仪上测定各孔490 nm处的吸光度A值，最后计算细胞抑制率。
1．4 RT-PCR法检测细胞周期相关蛋白mRNA的表达
收集对数生长期的HepG2细胞，按5×104个／ml的浓度，1.5ml／孔接种于6孔培养板内，培养24h后，对照组不加药物，实验组加入L-OHP，使其终浓度分别为4、32ug／ml，作用24、48、72h后收集细胞。加Trizol提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，建立25ul总反应体系，按照说明书进行实时荧光定量PCR。
1．5统计学分析
所有数据以均数±标准差表示，采用SPSS 19．0软件处理，进行方差分析。样本均数两两比较采用q检验(Newman—Keuls法)，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2．1 L-OHP对HepG2细胞增殖的影响 经MTT检测对照组细胞生长良好，随着药物浓度及作用时间的增加，L-OHP对HepG2细胞的抑制作用就越明显。见表1 。
表1 不同浓度、时间的抑制率
2.2 RT-PCR法检测细胞增殖及相关蛋白mRNA表达的变化，HepG2细胞随L-OHP作用时间延长和浓度的增加，cDK4、CyclinD1 mRNA的表达逐渐减少，p53、p21 mRNA的表达逐渐上升，差异具有统计学意义(P<0.05)；CDK2和p16mRNA的表达则无明显变化。
3讨论
肝癌起病隐匿，早期常无症状，发现时多数属于晚期患者，手术切除率较低，预后差，严重威胁人类的生命健康[5]。寻求高效低毒的抗肿瘤药物及治疗方法一直是当前肝癌治疗的研究热点[6]。
本文探讨L-OHP对肝癌细胞增殖的影响，结果显示L-OHP明显抑制肝癌HepG2 细胞的生长，其作用具有时间和浓度依赖性。L-OHP作用HepG2细胞后，S期细胞增加，说明L-OHP能够诱导肝癌细胞阻滞在S期，抑制细胞生长代谢，减少蛋白质合成与细胞有丝分裂，导致细胞数目减少[2-4]。在CyclinD的亚型中，CyclinD1的研究最多，在正常细胞周期中CyclinD1与CDK4结合形成复合物，该复合物使pRb蛋白磷酸化，调控细胞进入S期，从而完成细胞增殖。
本研究还发现，用RT-PCR法检测细胞增殖及相关蛋白mRNA表达的变化，发现HepG2细胞随L-OHP作用时间延长和浓度的增加，cDK4、CyclinD1 mRNA的表达逐渐减少，p53、p21 mRNA的表达逐渐上升；CDK2和p16mRNA的表达则无明显变化。说明L-OHP对CyclinD1和cDK4有一定的抑制作用，并呈时间剂量依赖性，但对CDK2表达没有影响，L-OHP的抗肿瘤机制可能与cyclinD1的生成减少和CyclinD-CDK4复合体活性降低有关，使细胞阻滞于s期，抑制细胞增殖。
在本实验中，L-OHP作用HepG2后，p53的变化与p2l是一致的，表达都有所增加。p16表达并无明显改变，可能是由多方面原因造成的，L-OHP对某些基因表达本来无调节作用，所以观察不到改变；L-OHP不能够改变某些基因的表达总量，但是可以改变其磷酸化水平，从而影响其生物学活性。因此，L-OHP对CDK2和p16是否有调节作用，还需要更多的实验加以证实。
综上所述，L-OHP可能通过影响CDK4、CyclinDl及p2l的活性使HepG2细胞阻滞在s期，从而抑制肝癌细胞HepG2的增殖。可以作为一种有效的药物，进行更多的临床推广，但是其更多具体的机制和临床效应及毒副作用，还需要我们进行实验，进一步研究与探讨。
参考文献：
[1] 恶性肿瘤研究专题[J].川北医学院学报,2015,(4):423-423.
[2]曾文胜,张阳德.奥沙利铂对人肝癌HepG2 细胞周期、凋亡及侵袭能力的影响[J].中国现代医学杂志,2011,21(14):1565-1567 1571.
[3]张燕,左国庆,汤为学.奥沙利铂诱导人肝癌细胞株HepG2 凋亡及其机制探讨[J]. 重庆医科大学学报,2004,29(6):745-748.
[4] 郭曼,赵园园,何信佳等.异甘草酸镁对奥沙利铂在人胃癌裸鼠模型中抗肿瘤作用的影响研究[J].川北医学院学报,2015,(4):429-434.
[5]周丽,李青山.表柔比星+ 5-氟尿嘧啶、奥沙利铂对人肝癌HepG2 细胞增殖及凋亡的影响[J]. 肝胆外科杂志,2014,22(6):474-476.
[6] 管海涛,马小斌,刁岩等.纳米碳混悬注射液用于乳腺癌前哨淋巴结活检的临床研究[J].川北医学院学报,2015,(4):439-441,446.
论文作者:蒋红，杨明辉，张梦云，雷佳红，赵明才
论文发表刊物:《医师在线》2015年11月第23期供稿
论文发表时间:2016/4/19
标签：细胞论文; 肝癌论文; 抑制论文; 培养液论文; 作用论文; 浓度论文; 细胞株论文; 《医师在线》2015年11月第23期供稿论文;