周云[1]2004年在《VEGF_（165）基因转染预防移植静脉再狭窄》文中研究指明目的：探讨腺病毒介导VEGF_(165)基因转染对自体移植静脉术后再狭窄的预防作用。 方法：通过细胞内同源重组构建携带人VEGF_(165)基因重组腺病毒，转染体外培养的人脐静脉内皮细胞，经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化、酶联免疫吸附试验(ELISA)、噻唑蓝(MTT)比色法检测内皮细胞VEGF_(165)基因表达和细胞生长情况；进而，建立猪颈静脉移植模型，术中采用体外孵育方法将VEGF_(165)基因转染至移植静脉，经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化、病理组织学检查观察VEGF_(165)基因在移植静脉中的表达情况及其对移植静脉内皮细胞修复和内膜增生的影响。 结果：本研究通过脂质体介导细胞内基因重组技术成功构建pDC315-VEGF_(165)腺病毒，在HEK293细胞(转化腺病毒E1基因的人胚肾细胞系)中大量扩增、纯化后得到滴度为1.6×10~(12)pfu／ml(每博士学位论文VEGF165基因转染预防移植静脉再狭窄毫升空斑形成单位，Plaque forming unit/ml)，纯度为1.48的腺病毒液;通过腺病毒介导将VEGF，6。基因转染至体外培养的ECV304人脐静脉内皮细胞中RT一PCR检测表明内皮细胞VEGF165mRNA表达随MOI(感染复数，Multiplieity of infeetion)增加而增加，免疫组化检测显示转染组内皮细胞呈阳性表达，细胞生长明显加快，细胞倍增时间缩短为3.5天;在猪颈静脉移植模型中，转基因组术后VEGF，6。mRNA及VEGF16。蛋白表达明显增加，并维持至术后4周，移植静脉内皮细胞修复加快，较早完成内皮化血管平滑肌细胞增殖减少，内膜增厚明显减轻，最厚时为正常静脉的1.54倍，而对照组内膜增厚达正常静脉的2.23倍，两组比较有显着性差异(P=0.001)。结论:腺病毒介导VEGF165基因转染促进自体移植静脉内皮细胞修复，抑制内膜增生，减轻术后再狭窄。
余咏潮, 赵学维[2]2008年在《VEGF在血管外支架预防移植静脉再狭窄中的作用》文中指出冠状动脉旁路移植术后,自体大隐静脉桥的再狭窄是急需解决的问题,应用血管外支架是预防再狭窄的一种可行办法。血管内皮生长因子(VEGF)是一种特异性地直接作用于血管内皮细胞,促进新生血管形成,并能增强毛细血管通透性的细胞因子。本文就近年来VEGF在静脉桥血管
张健梅[3]2016年在《ePTFE套管对兔搭桥术后移植静脉渗流率的影响》文中指出目的:采用兔面前静脉重建颈总动脉,探讨膨体聚四氟乙烯(expanded poly tetra fluoro ethylene,ePTFE)血管外套管对血管搭桥术后不同时间段移植静脉渗流变化的影响,为提高移植静脉远期通畅率提供优化方案。方法:将36只体重为2.5±0.5 kg的健康新西兰大白兔随机分为2组:实验组移植静脉外加ePTFE套管,对照组移植静脉不加ePTFE套管。采用显微外科手术方法,切取长度为2 cm的右侧面前静脉,利用二定点端侧吻合法重建同侧颈总动脉。搭桥完毕后恢复血供,观察静脉桥吻合口是否通畅以及漏血。于术前1 d,术后1、5、14 d行耳缘静脉采血,测定血常规指标,检测内容为:白细胞总数(WBC)、淋巴细胞(LYM)、中性粒细胞(GRAN)和单核细胞(MONO);于术后2、4、8 w牺牲动物,从原切口处切开,暴露移植静脉,观察移植静脉血管搏动以及管腔变化情况。组装调试高位水槽灌流系统,并留取移植静脉和对侧未搭桥动脉,分别连接于高位水槽灌流系统中,测定跨壁压为100mm Hg时离体血管的外径和渗流率。将移植静脉制作病理切片,测定血管壁内膜厚度,比较不同时间段内膜增生程度。结果:1.大体观察血管搭桥完毕后恢复血供,吻合口无漏血现象,移植静脉膨胀,产生搏动。动物术中及术后无意外死亡,全部存活。术后留取血管,移植静脉搏动良好,血管红润,管腔扩张,弹性较好,高通畅率,管壁不同程度增厚。ePTFE套管的外壁与其周围组织有轻微的粘连,而内壁与移植静脉几乎无粘连。2.血常规参数变化术后1 d,无论是对照组还是实验组,WBC和GRAN均高于术前1 d,差异极显着(P<0.01),分别为19.84±2.69×109/L、20.65±3.14×109/L、5.94±1.12×109/L和6.18±1.13×109/L;抗生素治疗5 d,对照组WBC和GRAN均恢复正常,而实验组WBC仍偏高且高于对照组,差异显着(P<0.05)。术后14 d实验组WBC恢复正常。术后5 d对照组与实验组MONO高于术前1 d,差异显着(P<0.05)。LYM变化无显着性差异(P>0.05)。3.移植静脉外径变化随搭桥术后时间的延长,对照组移植静脉外径逐渐降低,且差异极显着(P<0.01);与2 w相比:4,8 w实验组移植静脉外径显着或者极显着降低,分别为0.46±0.03 cm,0.39±0.01 cm。与对照组相比:实验组2 w时移植静脉外径极显着减小(P<0.01)。4 w和8 w时,两组移植静脉外径变化差异不显着(P>0.05)。4.移植静脉渗流率变化移植静脉离体血管渗流率随搭桥术后时间的延长,各搭桥组渗流率逐渐降低。搭桥术后2 w和4 w,移植静脉不加血管外套的离体血管渗流率均比加血管外套的高,差异极显着(P<0.01),分别为13.35±0.67×10-6 cm/s、13.57±0.32×10-6cm/s、24.95±1.15×10-6 cm/s和19.96±0.92×10-6 cm/s;搭桥术后8 w,移植静脉不加血管外套的离体血管渗流率比加血管外套的低,差异显着(P<0.05),7.19±0.22×10-6 cm/s和7.95±0.15×10-6 cm/s;搭桥术后2,4,8 w,无论是否加血管套管,移植静脉离体血管渗流率均比对侧动脉高,差异极显着(P<0.01)。5.移植静脉内膜厚度变化各时间点对照组和实验组移植静脉内膜与正常静脉相比,均显着增厚。静脉移植后2 w时,对照组内膜增厚为49.47±7.43μm,实验组增厚为43.82±6.25μm。当移植后4 w时,对照组内膜严重增厚,与2 w相比,差异极显着(P<0.01),同时,实验组也有所增厚,与2 w相比,差异显着(P<0.05);当移植后8 w时,对照组内膜厚度较2 w时有所减小,差异显着(P<0.05),而实验组膜厚度较2w时无明显变化。与对照组相比,静脉移植后4 w时,实验组内膜厚度明显减小,差异极显着(P<0.01),其余时间点,均无显着性差异。结论:ePTFE套管能够通过阻止静脉桥过度膨胀,从而降低静脉桥管壁的渗流率,进而提高移植血管的远期通畅率。
王蕾艳[4]2011年在《联合转染VEGF和PCNA-ASODN对实验兔血管成形术后再狭窄的影响》文中研究指明目的：探讨联合转染血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)基因和增殖细胞核抗原反义寡核苷酸(proliferating cell nuclear antigen antisense oligodeoxynucleotide, PCNA-ASODN)对实验大白兔血管成形术后再狭窄的影响。方法：挑选健康新西兰纯种大白兔32只,随机分为四组：对照组、转染VEGF组、转染PCNA-ASODN组和联合转染组(联合转染VEGF和PCNA-ASODN组)。所有实验大白兔均采用股-髂动脉球囊损伤术构建血管成形术后再狭窄动物模型,然后将各转染组以医用生物蛋白胶作为缓释载体,分别用300μgVEGF或/和PCNA-ASODN均匀喷布于损伤区血管段外膜。4周后,在光学显微镜下观察各组血管内膜、中层结构和局部血栓形成情况；用电子显微镜观察新生内膜内皮细胞、内膜、中膜,并计算内膜/中膜(intima/media, I/M)面积比和厚度比；采用RT-PCR技术从mRNA水平检测VEGF与PCNA基因的表达,采用免疫组化法从蛋白质水平检测’VEGF与PCNA的表达。结果：①光镜下对照组管腔面内皮细胞大部分缺失,内膜增生明显,增生厚度不一,缺失区内膜增厚更着,中层平滑肌细胞增多,排列紊乱,形态不一；转染VEGF组和转染PCNA-ASODN组血管内皮细胞部分修复,内膜增生较轻,中层平滑肌细胞轻度增生；联合转染组血管内皮较完整、光滑,内膜轻度增生,平滑肌细胞排列规则,外膜未见明显变化。②电镜下测定发现,转染VEGF组和转染PCNA-ASODN组I/M面积比、I/M厚度比均明显低于对照组(P<0.01)；转染PCNA-ASODN组低于VEGF组,但未达到统计学差异(P>0.05)；联合转染组I/M面积比、I/M厚度比均明显低于转染VEGF组(P<0.01)和转染PCNA-ASODN组(P＜0.01)。③RT-PCR检测结果显示,转染VEGF组的VEGF表达水平明显高于对照组(P<0.01)及转染PCNA-ASODN组(P<0.01)；联合转染组的VEGF表达明显高于对照组(P<0.01)及转染PCNA-ASODN组(P<0.01)；但转染VEGF组与联合转染组比较无明显差异(P>0.05)；转染PCNA-ASODN组和联合转染组的PCNA表达水平明显低于对照组(P<0.01)及转染VEGF组(P<0.01),但两组之间差异不显着(P>0.05)。④免疫组化检测结果显示,转染VEGF组及联合转染组的VEGF阳性率均显着高于对照组(P<0.01)及转染PCNA-ASODN组(P<0.01),但两组间无明显差别(P>0.05)；转染PCNA-ASODN组及联合转染组的PCNA阳性率均明显低于对照组(P<0.01)及转染VEGF组(P<0.01),但两组阳性率相似(P>0.05)。结论：联合转染VEGF和PCNA-ASODN能更有效地抑制球囊损伤术后的血管内膜增生和再狭窄的发生。
刘华[5]2006年在《穿心室壁内支架联合血管内皮生长因子治疗冠心病的研究》文中研究表明目的:对于传统技术不能治疗的冠心病目前发展了很多不同的治疗手段,包括激光心肌血运重建术和治疗性血管生成治疗。本研究的目的在于确定穿心室壁内支架联合血管内皮生长因子基因治疗在猪急性心肌梗死模型中的治疗作用,为晚期冠心病患者开辟新的治疗途径。方法:中国小型猪43头随机分为4组,心肌梗死组(MI组,n_1=14),支架治疗组(ST组,n_2=10),基因治疗组(VEGF组,n_3=10)和支架+基因治疗组(ST+VEGF组,n_4=9)。MI组采用结扎冠状动脉左前降支形成急性心肌梗死模型;ST组在形成心肌梗死后在梗死的左室前壁处植入3个心室壁内支架,间隔1cm;VEGF组分6个位点直接心肌内注射pcDNA3.1/VEGF_(165)300μg,每点间距1cm;ST+VEGF组则在形成梗死模型后采用穿心室壁内支架植入和注射携带hVEGF_(165)的质粒载体联合治疗。4周后行心脏超声、RT-PCR、心肌血管密度检测和免疫组化染色等检查。结果:4周后每组各有6只动物存活。超声心动图显示:ST组EF为62.17±3.43%、FS为33.00±2.45%、WMSI为1.58±0.58,较MI组均有明显提高(P＜0.05),而VEGF组和ST+VEGF组WMSI分别为1.30±0.45和1.60±0.55,较MI组有显着提高(P＜0.05)。病理学分析ST组、VEGF组、ST+VEGF组的血管密度(条/400倍视野)分别为6.47±1.35、5.01±1.33和9.47±1.52,均明显多于MI组(P＜0.05),其中ST组同时促进毛细血管和小动脉的生长,ST+VEGF组与单独治疗组比较在促进血管生长包括小动脉生长方面有明显优势。RT-PCR和VEGF免疫组织化学染色结果表示VEGF组和ST+VEGF组较MI组在VEGFmRNA和VEGF蛋白表达方面有明显提高。结论:我们认为在小型猪急性心肌梗死模型上植入穿心室壁内支架是可行并且安全的,虽然支架所形成的通道不能保持长期通畅,但由于支架长期的刺激作用产生中重度的炎症反应和显着的血管生成作用,并通过改善缺血心肌灌注提高左心室壁运动功能。穿心室壁内支架联合VEGF治疗综合了支架形成通道、机械刺激促进血管生成以及携带促血管生成因子基因的载体的输送作用,提供了一种比任何单独治疗技术更有效的手段。
丁蓉蓉[6]2016年在《携人血栓调节蛋白基因内皮祖细胞预防动脉成形术后再狭窄》文中研究表明目的 探讨携人血栓调节蛋白(human thrombomodulin, hTM)基因的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)局部移植预防动脉成形术后再狭窄的可行性。方法 应用密度梯度离心法分离兔外周血EPCs；慢病毒载体plenti6.3-hTM-IRES-EGFP感染EPCs,并以超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记；利用双腔Fogarty球囊制作兔右侧颈总动脉损伤模型共36只(随机平均分为叁组),利用Fogarty球囊阻断损伤段近心端血流后、分别将hTM-EPCs、单纯EPCs或等量生理盐水定向移植至血管损伤处；术后1周每组随机选取4只兔取损伤血管段行Western blot检测及普鲁士蓝染色,观察血管损伤处有无外源性EPCs定植：术后4、8周行MR扫描,评估血管腔狭窄程度；术后8周末取所有剩余兔损伤血管段行HE、弹力纤维及PCNA染色,观察损伤段血管壁结构、平滑肌及内膜增生程度。结果 术后1周,普鲁士蓝染色显示损伤处血管内膜有外源性含铁EPCs附着；Westernblot检测示hTM-EPCs组损伤血管段高表达血栓调节蛋白(thrombomodulin, TM)。MR显示hTM-EPCs组损伤血管段管腔狭窄程度低于单纯EPC s组及对照组。HE、弹力纤维及PCNA染色结果显示,术后8周,hTM-EPCs组、单纯EPCs组及对照组内膜/中膜比(N/M)分别为0.35±0.04、0.70±.06和1.30±0.05(P<0.05)；管腔狭窄率分别为0.11±0.02、0.24±0.05和0.35±0.09 (P<0.05); PCNA阳性细胞指数分别为0.12±1：0.04、0.23±0.04和0.49±0.07(P<0.05)。结论 应用双腔Fogarty球囊构建兔颈总动脉损伤模型并阻断局部血流后,可使hTM基因修饰的EPCs定植于血管损伤段,并能有效抑制术后再狭窄。
周忠江[7]2002年在《超声介导微泡空化靶向传输系统促血管新生作用的初探》文中指出一．前言 1．研究背景 冠心病是世界范围内公认的威胁人类身心健康及引起死亡的第一杀手，冠心病的实质是缺血和缺氧。近二十年来，人们不断努力，取得了许多成就，循证医学指导下的新的更为合理的心血管药物以及以冠状动脉旁路搭桥术(CABG)和血管成形术(PTCA)为代表的血运重建心肌再灌注疗法，使冠心病尤其是急性心肌梗死的治疗和预后取得了长足的进步。然而，仍有诸多重要问题未予解决。例如，对于一些由于自身冠状动脉病变复杂、严重、弥散、终末小分枝病变、以及合并其它不适合介入治疗的全身性疾病如糖尿病、肿瘤等，则不能进行PTCA和CABG冠脉重建；有些病人虽可进行冠脉重建，但重建后血供仍不充分，缺血心肌濒临坏死、凋亡、纤维化；另外PTCA和CABG术后再狭窄问题，使心肌再灌注疗法面临挑战。因此，寻求其它血运重建策略迫在眉睫，人们寄厚望于称为“分子搭桥”的治疗性血管新生(Therapeutic angiogensis)以及心肌干细胞移植。 缺氧心肌微循环的代偿包括微血管扩张、征募储备血管、微血管新生及动、静脉侧支形成，严重冠心病患者即使在合并使用硝酸酯和钙拮抗剂等药物治疗基础上，内源性的促血管生长调节下的微循环代偿已达极限。因此，在药物治疗、血运重建基础上，通过输入外源性的促血管生长因子，促进心肌血管新生(Therapeutic Angiogenesis)、改善心肌缺血即心肌血管分子搭桥，是人们正在努力探索的研究热点。研究证实，Angiogenesis是由多种有丝分裂原相互作用、调控的瀑布式生物反应，一系列血管生长的促进和拮抗因子，如VEGF(血管内皮生因子)、FGF(纤维生长因子)、Angiopoietin(血管生长素)、Ephrins、Thrombospondin-1(凝血栓蛋白)等，通过血管内皮高亲合力受体及信号传导途径参与血管生成。分子生物学在心血管领域的应用及心肌分子搭桥基因治疗的飞速发展，使分子搭桥已进入临床进行初步实践；如开胸心肌注射VEGF_(121)重组腺病毒、经心内膜和心包注射重组VEGF_(165)和VEGF_(121)真核表达质粒、冠脉内注射bFGF、VEGF16。进行血运重建的临床试验等。这些研究虽然取得了一些令人振奋的效果，但有创、高风险的基因传输方式明显限制了分子搭桥疗法的深入开展。 超声在基因和活性药物靶向传输中的应用是正在兴起的研究热点，。其核心是应用超声波及声学造影剂微气泡发展基因和药物定向释放技术，即超声介导微泡空化靶向传输系统。该系统的原理是将声学造影剂微气泡耦连或包载靶向药物或基因，使载药微泡在显影心肌的同时，利用声学造影剂微气泡在超声场内发生的空化效应，将基因和药物运载和释放到特定的组织和器官，使局部组织达到有效的治疗浓度。己有充分研究证实该系统的可行性和应用前景，其全身给药少、局部浓度高、无创、简便、并可在床边进行等优点，赋予当前靶向性差、正处于低迷状态的基因疗法以新的希望。2．目的和意义 本研究拟以上述理论、研究背景为依据，利用分子生物学、细胞生物学及声学造影技术，以蛋白质靶向微泡在组织水平探索超声介导微泡空化靶向传输放射性核素标记的大分子物质BSA的可行性，以蛋白质微泡。脂质体微泡在细胞水平初步探索超声介导微泡空化效应促内皮细胞报告基因转染、表达的可能性；以自制脂质体靶向微泡向大鼠梗塞心肌靶向传输自行构建、克隆的血管内皮生长因子基因VEGF165，并在心肌梗塞动物模型评价VEGF16；分子搭桥血管新生的效果：为超声介导微泡空化靶向传输系统的深入研究以及冠心病分子搭桥基因治疗服务于临床，奠定理论基础和提供实践经验。 第一军医大学南方医院率先研制的第一。二代造影剂填补了国内心肌声学造影的一项空白，如果研制成功能进行心肌靶向传输的第叁代造影剂，则能紧跟国际前沿，进一步丰富超声介导微泡空化靶向传输系统这一涉及多个学科的复杂理论体系。未来超声介导微泡空化靶向传输系统的成功实践，不但会给心肌血管新生的分子搭桥基因治疗提供有效的基因靶向投送手段，而且还有助于攻克目前基因治疗靶向性差的世界难题。同时，靶向微泡的成功研制还将用于诸如肿瘤、外用血栓病的治疗，因此本研究具有重要的经济和社会意义。3．研究内容 一6－ 本课题主要进行以下几个方面的的研究： ＊）在国内应用超声介导微泡空化靶向传输的动物及细胞模型，首次进行 靶向传输研究； 。c）向大鼠心肌传输放射性核素标记的牛血清白蛋白，取得预期心肌靶向 一传输效果； m 向培养的人血管内皮细胞传输LacZ报告基因，证明脂质体靶向微泡 有良好的靶向传输及促基因转染、表达效果； O） 向大鼠梗塞心肌传输自行构建的血管内皮生长因子基因VEGF165；取 得一定的促血管生成效应： 门在血管内皮生长因于基因表达载体的构建过程中，发现一新的血管内 皮生长因子基因的剪接形式
唐军建[8]2012年在《转染VEGF165基因内皮祖细胞移植预防血栓后综合症实验研究》文中研究说明目的观察携带血管内皮生长因子165基因(vascular endothelialGrowth factor165gene,VEGF165)的腺病毒转染的血管内皮祖细胞(endothelialprogenitor cell，EPCs)移植治疗深静脉血栓后综合征（Post-thrombosis syndrome，PTS）的效果。方法：1、Ficoll梯度密度离心法（density gradient centrifugation）分离SD大鼠的骨髓单个核细胞，EBM-2培养基诱导、培养、扩增骨髓源性EPCs。2、人胚肾细胞293A(HEK293A)扩增腺病毒后转染EPCs。3、缩窄大鼠(300g左右)肾下段下腔静脉，以叁氯化铁(ferric chloride)浸润建立下腔静脉血栓模型，随机分成四组，即：A组、B组、C组和D组，每组12只动物。4、术后3到5天取栓，经大鼠下腔静脉注射细胞，行移植实验：A组：注射lml×10~6/ml Ad．GFP．VEGFl65转染后EPCs细胞悬液；B组：注射lml×10~6/ml Ad．GFP转染后EPCs细胞悬液；C组：注射lml×10~6/ml单纯EPCs细胞悬液；D组：注射lml培养基。5、不同时间段取出血栓段下腔静脉，应用HE染色及vWF免疫组化染色CD34、VEGFR2、MMP-2、SMA等指标观察新生血栓机化、血管内膜修复情况；扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM）观测内膜修复状况。结果：1、EPCs可自骨髓单个核细胞诱导分化生成，传代后可成为晚期内皮祖细胞（late EPCs）；2、以HEK293A细胞为载体扩增可以获得高滴度的腺病毒，并且转染EPCs效率高；3、叁氯化铁构建大鼠下腔静脉血栓模型方法简便易行：4、基因修饰的EPCs移植能明显促进血栓后静脉内膜修复。结论：经VEGFl65转染的EPCs移植后明显促进静脉内膜的修复，从而改善了取栓后静脉内皮损伤。
夏爽[9]2010年在《低氧启动子调控下VEGF_（165）基因修饰的EPCs诱导大鼠急性心肌梗死后血管新生》文中研究说明目的:目前的研究发现外源性VEGF165基因可以促进缺血组织血管新生,而多拷贝缺氧反应元件(Hypoxic Response Element,HRE)可以对VEGF165基因的表达进行调控减少其副作用;此外,多种形式的干/祖细胞也可以改善缺血组织的功能;然而多拷贝HRE调控VEGF165基因修饰的干细胞对缺血心肌中治疗性血管新生的作用目前仍不清楚。本研究通过把6HRE调控的VEGF165基因转染入内皮祖细胞中,来研究这种新的基因修饰的内皮祖细胞对心肌梗死后缺血心肌中血管发生以及对心肌梗死后心脏功能的治疗作用。方法:首先用分子生物学技术成功构建r6HRE-CMV-VEGF165重组质粒和rCMV-VEGF165重组质粒,并对体外分离培养的大鼠骨髓来源内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells, EPCs)进行免疫荧光法鉴定;然后用阳离子脂质体法将重组质粒转染到EPCs中,并构建体外细胞缺氧模型鉴定低氧启动子的调控作用;随后把基因修饰的EPCs通过尾静脉注射法移植入成功建立的急性心肌梗死(Acute Myocardial Infraction ,AMI)模型的Sprague- Dawley (SD)大鼠中,通过RT-PCR和Western 1blot法检测AMI后1w缺血心肌中VEGF165 mRNA和蛋白质的表达水平,用免疫组化法和超声心动图检测AMI 4w后大鼠缺血心肌中毛细血管密度和心脏功能。结果:1)阳离子脂质体法可有效的将重组质粒转染入体外分离培养的骨髓来源大鼠EPCs;2)6HRE-CMV低氧启动子诱导VEGF165基因在体内外缺氧时表达增强,而非缺氧下仅呈现低水平表达;3)r6HRE-CMV-VEGF165质粒转染EPCs移植组中大鼠AMI后1w VEGF165基因的表达水平以及4w缺血心肌中毛细血管密度明显高于rCMV-VEGF165质粒转染EPCs移植组和EPCs移植组(P<0.05);4) r6HRE-CMV-VEGF165质粒转染EPCs移植组大鼠左室舒张末压显着低于其它各实验组(P<0.05),而左心室射血分数显着高于其它各实验组(P<0.05)。结论:6HRE调控下VEGF165基因修饰后的EPCs移植与VEGF165基因修饰后的EPCs移植和单纯EPCs移植相比促进缺血心肌血管新生、改善AMI后大鼠心脏功能作用更显着。
王尧[10]2010年在《细胞凋亡在慢病毒介导hVEGF165-GFP基因转染内皮祖细胞移植治疗MODS中变化的研究》文中研究指明多器官功能障碍综合症(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)是重症监护病房患者的最常见死亡原因。严重的感染和感染性休克是其主要诱因。感染所致的脓毒症及非感染所致的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)相互作用,构成了一个复杂的网络。目前其发病机制尚不完全明确,临床上尚缺乏满意的治疗措施。随着干／祖细胞研究的不断深入,多器官功能障碍综合征的发病机制研究和临床治疗面临着新的契机。近年来研究发现：骨髓中有一群能够在生理性或病理性因素的刺激下,动员到外周血并分化为成熟内皮细胞(Endothelium cell, EC)以促进血管新生,并可以分化为相应的组织细胞进行损伤修复的祖细胞,这些细胞被称为内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)。EPC过去被认为是胚胎时期血管新生最主要的细胞,而越来越多的证据显示EPCs也是出生后生理性及病理性血管形成最主要的细胞,并参与心、肝、肺、肾等单个器官障碍时的修复；同时迁徙到损伤部位的EPC还可以对不同的局部刺激(包括缺氧或缺血)作出生理反应,依次释放血管活性物质、生长因子以及参与免疫调节的细胞因子和趋化因子,参与创伤后的炎症反应。同时研究发现内皮细胞不仅是炎症反应的参与者,还是首先受损的靶细胞,并进而造成微血管损伤、微循环障碍,这可能是器官功能障碍的始发环节。大量的动物和临床实验都已经证明：当组织受到损伤时,尤其是缺血性损伤时,循环及组织中EPCs动员和增殖能力增强,并可以在组织内分化为内皮细胞替换功能障碍的内皮细胞、修补裸露的血管内皮损伤区,并参与缺血或损伤组织内新血管生成,从而改善缺血器官的功能；而如果创伤后EPCs的分化、迁徙功能发生严重障碍,则会导致损伤微循环严重损害而无法得到修复,甚至发生器官功能衰竭。既往研究发现与MODS有关的细胞因子有白介素(IL-1,IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、热休克蛋白(HSP)、糖皮质激素和细菌产物如内毒素等,它们在导致SIRS/MODS细胞凋亡中具有潜在作用。通过对某些重要器官的细胞凋亡机制及其影响因素的研究可以更深入的了解MODS的机理,为临床更好的防治MODS提供实验依据。本研究通过内毒素+失血性休克制造出MODS的动物模型,在此基础上进行慢病毒介导VEGF-GFP基因转染EPCs移植治疗,动态观察移植前后动物生命体征的变化,血浆中IL-1β、TNF-α等炎性因子表达的变化,以及主要脏器的细胞凋亡情况,评价移植EPC防治MODS的效果,并对其作用机制进行初步探讨。全文共分四部分。第一部分目的：复制双相迟发型的兔MODS模型,为研究移植内皮祖细胞防治创伤后多器官功能障碍的研究提供实验基础。方法：将体重2.52±0.27Kg健康雄性家兔随机分为2组：实验组(M组)12只,施行失血性休克+内毒素血症复合因素；对照组(C)12只,施行假手术,予以股动静脉置管,不实施失血及内毒素注射。用自动分析仪检测WBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN、动脉血氧分压(PaO2),以判断器官功能,7天后处死存活动物,观察主要脏器的病理改变。结果：实验组(M组)WBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN均明显升高,动物死亡前显着高于正常值,PaO2明显下降。病理学改变主要表现为衰竭器官呈以炎症为主的非特异性改变。实验组MODS发生率为83.3%,死亡率为75%,显着高于对照组。结论：本实验采用二次打击方法,与临床实际相符,并且MODS的发生率及死亡率均高,操作简单,容易复制,是一个较成功的动物模型。第二部分目的：制备携带hVEGF165-GFPs双表达基因的慢病毒载体,体外转染内皮祖细胞,为EPC移植治疗做准备。方法：将目的基因VEFG165插入慢病毒过表达载体pWPXL-MOD,慢病毒包装质粒转染293T细胞,得到LV/hVEGF165-GFP,将LV/hVEGF165-GFP与EPCs共培养以转染EPCs。对LV/hVEGF165-GFP-EPCs进行其黏附、迁徙、增殖和血管生成功能进行检测。结果：慢病毒载体能表达目的基因VEGF,成功构建和包装了慢病毒载体；并证实EPCs经LV/hVEGF165-GFP转染后转染率达99%。其迁徙、增殖和血管生成等功能较未转染EPCs提高,P<0.05。结论：LV/hVEGF165-GFP对细胞无毒性,且能提高EPCs的粘附、迁徙及增殖能力。第叁部分目的：研究细胞凋亡在慢病毒介导VEGF165-GFP基因转染EPCs移植治疗MODS中的变化及意义。方法：将体重2.52±0.27Kg健康雄性家兔随机分为3组：单纯MODS组(M)12只,施行失血性休克+内毒素复合因素；单纯内皮祖细胞移植组(ET)12只和慢病毒介导VEGF165-GFP基因转染内皮祖细胞移植组(VT)12只,在固定时间点,分别以1×107个细胞／Kg(体重)和1×107个转染后细胞／Kg(体重)的剂量进行移植治疗。用自动分析仪检测WBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN、动脉血氧分压(PaO2),以判断器官功能,7天后处死存活动物,观察主要脏器的病理改变。原位末端(TUNEL)法检测主要脏器细胞凋亡情况。RT-PCR法检测主要脏器caspase3mRNA表达情况。结果：VT组WBC、GRAN、GOT、GPT、Cr、BUN等指标在移植治疗后较M组及ET组均有明显改善,比较有统计学意义。VT组主要脏器细胞凋亡及caspase3mRNA表达均低于M组及ET组,P<0.01。VT组动物的MODS发生率和死亡率较M组及ET组明显减少,P<0.05。结论：移植慢病毒介导VEGF165-GFP基因转染EPCs治疗MODS,能减少MODS动物的细胞凋亡,明显的改善各个重要脏器的功能,降低动物的死亡率。
参考文献：
[1]. VEGF_（165）基因转染预防移植静脉再狭窄[D]. 周云. 昆明医学院. 2004
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[5]. 穿心室壁内支架联合血管内皮生长因子治疗冠心病的研究[D]. 刘华. 同济大学. 2006
[6]. 携人血栓调节蛋白基因内皮祖细胞预防动脉成形术后再狭窄[D]. 丁蓉蓉. 东南大学. 2016
[7]. 超声介导微泡空化靶向传输系统促血管新生作用的初探[D]. 周忠江. 第一军医大学. 2002
[8]. 转染VEGF165基因内皮祖细胞移植预防血栓后综合症实验研究[D]. 唐军建. 苏州大学. 2012
[9]. 低氧启动子调控下VEGF_（165）基因修饰的EPCs诱导大鼠急性心肌梗死后血管新生[D]. 夏爽. 重庆医科大学. 2010
[10]. 细胞凋亡在慢病毒介导hVEGF165-GFP基因转染内皮祖细胞移植治疗MODS中变化的研究[D]. 王尧. 第二军医大学. 2010