硫氢化钠对慢性脑缺血大鼠学习记忆及TH表达的影响论文_郑永强刘南暖叶飞邓晓玲上官守琴王成谋

郑永强刘南暖叶飞邓晓玲上官守琴王成谋

湖北医药学院附属十堰市人民医院神经内科湖北十堰432000

基金项目：十堰市科学技术研究与开发项目(NO:ZD2012022)

【摘要】

目的：探讨NaHS对慢性脑缺血大鼠学习记忆及TH表达的影响。方法采用Sarti等改良的分次结扎双侧颈总动脉术制作慢性脑缺血大鼠模型，术后8周五组（假手术组，慢性脑缺血组，低剂量组，中剂量组，高剂量组）大鼠Morris水迷宫测试后断头取脑检测H2S的含量,免疫组化检测TH的表达。结果：水迷宫实验结果：慢性脑缺血组学习记忆能力显著下降，与假手术组比较有显著性差异（P<005），NaHS中、高剂量组学习记忆能力显著提高，与慢性脑缺血组比较有显著性差异（P<005），说明NaHS能有效改善大鼠的学习记忆功能。慢性脑缺血组大鼠脑内H2S含量明显降低，与假手术组比较有显著性差异(P<005)；NaHS中、高剂量组H2S含量明显升高，与慢性脑缺血组比较有显著性差异(P<005)。大鼠TH的表达水平慢性脑缺血组明显升高，与假手术组比较有显著性差异（P<005），硫氢化钠中剂量组、高剂量组与慢性脑缺血组比较有显著性差异（P<001）。结论NaHS可明显增强慢性脑缺血大鼠脑组织H2S生成，提示H2S可能改善慢性脑缺血大鼠学习记忆功能，其机制可能与上调TH的表达有关。

【关键词】硫氢化钠；慢性脑缺血；硫化氢；Morris水迷宫；酪氨酸羟化酶

【Abstract】

Objictive:To investigate Effects of sodium hydrosulfide on learning and memory abilities and the expression of TH in chronic cerebral ischemic rats. Methods:Sarti's 2VO was used to make the chronic cerebral ischemic rats．All rats were randomly divided into sham operation group,chronic cerebral ischemia group,low dose group,middle dose groupand high dose group.Morris water maze was used to evaluate the effects of sodium hydrosulfide on chronic cerebral ischemic rats in their learning and memory abilities; The SPSS160 Statistics software was used to analyze data of variance.Results:1Water maze test results: The rats' learning and memory ability in chronic cerebral ischemia group significantly decreased，and which was lower than that in the sham group(P<005).The rats' learning and memory ability of the middle and highdose group of NaHS significantly increased，2 The content of H2S in brain in the chronic cerebral ischemia group was significantly lower than that in the sham group (P<005); The content highdose group of NaHS was significantly higher than that in the chronic cerebral ischemia group (P<005).3 The level of TH expression in rats brain in chronic cerebral ischemia and which was higher than that in the sham group(P<005)，The level of TH expression in middle and high dose group of sodium was higher than that in chronic cerebral ischemia (P<001).Conclusion:NaHS can significantly enhance the content of H2S in rat brain tissue in the chronic cerebral ischemia,suggesting that H2S may improve ability in rats with chronic ischemia,the mechanism may be related to increased the level of TH expression.

【Key words】sodium hydrosulfide,NaHS; chronic cerebral ischemia; hydrogen sulfide(H2S);Morris water maze;tyrosine hydroxylase(TH).

【中图分类号】R74331

【文献标识码】B【文章编号】16748999(2013)12007602

慢性脑供血不足是临床上常见的一组亚健康状态，主要由于大脑局部组织的供血不足，引发脑部慢性缺氧缺血而出现一系列脑功能下降，随着我国生活水平的提高，而人口逐渐老龄化，慢性脑供血不足的病理机制及其治疗的研究日益受到重视，研究其病理生理机制可以为临床上早期药物干预提供更多的选择。有研究表明硫化氢在中枢神经系统中通过调控离子通道KATP、提高神经细胞中cAMP水平实现对脑血管和神经细胞功能的调节，提示硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)在神经系统的病理生理过程中具有重要的作用［1］。而硫化氢对慢性脑缺血的影响报道较少，其机制尚不清楚。本研究采用Sarti等［2］的分次结扎双侧颈总动脉术制作慢性脑缺血大鼠模型，给予大鼠腹腔注射硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)作为外源性硫化氢供体，通过Morris水迷宫、检测硫化氢含量，免疫组化检测酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH)，观察硫化氢对慢性脑缺血模型大鼠学习记忆的影响，探讨硫化氢可能的作用机制。

1材料与方法

11实验动物分组模型制备和给药:

选用华中科技大学同济医学院实验动物中心提供的健康成年雄性SD大鼠，体重200250克，共120只，随机分为5组，每组24只，分别为假手术组；慢性脑血组；NaHS低剂量组；NaHS中剂量组；NaHS高剂量组。NaHS低、中、高剂量组分别于大鼠慢性脑缺血后3h左右腹腔注射07mg/kg、14mg/kg和28mg/kg的NaHS，以后每天一次，连续5天，假手术组和慢性脑缺血组大鼠注射等容量的生理盐水。

采用Sarti等［2］改良的2VO，分次结扎大鼠双侧颈总动脉。大鼠术前12h禁食，4h禁水。10%水合氯醛(035ml/100g)腹腔注射麻醉后，待大鼠进入麻醉状态后，将其仰卧位固定，依次于颈前术区去毛，碘伏消毒，手术侧颈部切开约1～2cm，钝性分离颈总动脉，采用0号线依次结扎颈总动脉近心、远心端，确保结扎牢固后，用眼科剪将颈总动脉从两个结扎点中间剪断，以确保阻断颈总动脉血流，剪断后，局部消毒，逐层缝合。手术过程保证体温及呼吸的稳定。手术后动物置于保温的单笼饲养。1周后采用同法结扎另一侧颈总动脉。术后每日腹腔注射青霉素20万单位/kg，连续7天。假手术组手术方法及术后饲养方法同手术组，但仅分离暴露颈总动脉而不结扎。各组大鼠予以相同环境、饲料、供水条件饲养8周。

12水迷宫测试:

实验条件与仪器参照Morris水迷宫法［3］，实验分为两个部分：定位航行实验和空间搜索实验。

定位航行实验：造模前3天对大鼠实施水迷宫训练，第一天让大鼠自由游泳30s以适应环境，从第2天开始，每天训练一次，训练时按东北、西北、东南、西南4个象限依次将大鼠面向池壁放入水中，设定最长游动时间为120s，观察并记录大鼠寻找并爬上平台所需时间（逃避潜伏期）。如果大鼠在120s内未找到平台，则将其引至台，并将潜伏期为120s。造模前1天进行水迷宫测试，记录大鼠找到平台所用的时间，作为大鼠学习成绩。造模结束后8周再次测试各组大鼠水迷宫实验找到平台所需的时间，作为大鼠的记忆成绩，连续五天。

空间探索实验：定位航行实验结束后撤掉平台,选定和平台相对的象限中点为入水点,观察大鼠在120s内跨越平台所在位置的路径和次数，记录大鼠穿越平台的次数和搜寻平台的轨迹。采用荷兰Noldus公司研制的Morris水迷宫检测软件系统自动跟踪池内大鼠的活动轨迹并记录大鼠游泳时间、穿越平台次数等参数。行为学检测期间，保持室内安静。

13脑组织中H2S含量的测定:

采用去蛋白的方法测定［4］，用不同浓度的NaHS绘制标准曲线。Morris水迷宫测试结束后立即处死大鼠开颅取脑，分离出脑组织，放入液氮保存备用。用4℃的50mmol/L磷酸钾缓冲液(pH74)制备匀浆(质量体积比12%)，匀浆液离心(47000×g,10min,4℃)，取75μl上清液移至另一离心管中，在室温下加入025ml的1%醋酸锌及045ml蒸馏水孵育10min，再加入10%三氯乙酸025ml再次离心(14000×g,10min,4℃)，收集清澈的上清液，加入133μl的氮二甲基对苯二胺盐酸盐(20mmol/L)/HCl(72mol/L)缓冲液及133ul的三氯化铁(30mmol/L)/HCl(12mol/L)缓冲液，充分混匀。20min后，用全自动酶标仪(BioTEK ELx800,美国)在波长670nm测定吸光度，根据不同浓度硫氢化钠绘制的标准曲线计算溶液中的硫化氢含量，以单位重量的脑组织中硫化氢的量(nmol/g)表示。

14TH免疫组织化学

141主要试剂：兔抗大鼠TH抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，二步法免疫组化检测试剂(北京中杉金桥试剂公司)。

142灌注取材:Morris水迷宫测试结束后，采用多聚甲醛对各组大鼠进行大鼠全身固定处理，断头取脑，石蜡包埋，切片，进行免疫组化检查。

143图像分析和统计处理:每组动物随机取3张切片，每张切片选取海马CA1和皮质区在20×20倍下用HPIAS1000高清晰度彩色图文分析系统对其免疫反应产物进行图像录入后，测定海马CA1皮质区的免疫阳性产物的平均吸光度，并分别计数每一个视野(4,000,000μm2)中CA1和皮质区有阳性表达的细胞数。

15统计学方法:采用SPSS160统计软件做方差分析和t检验，数据以X±s表示,并以单因素方差分析，P<005为差异有统计学意义。

2结果

21硫氢化钠治疗可显著改善慢性脑缺血大鼠的学习记忆能力检测结果

211大鼠平均逃逸潜伏期：定位航行实验中大鼠逃避潜伏期在造模前各组无显著性差异（P>005）。造模后8周各组大鼠逃避潜伏期随训练次数的增多在不断缩短，造模后慢性脑缺血组学习能力显著下降，其中慢性脑缺血组与假手术组比较有显著性差异（P<005），硫化氢中、高剂量组与慢性脑缺血组相比学习能力均显著提高（P<005）。见表1所示。

A正常对照组、B慢性脑缺血组、C低剂量组、D中剂量组、E高剂量组

3讨论

慢性脑血液供应不足是一种常见的慢性脑血管疾病，早期表现为一个或多个认知领域功能障碍，如不控制其进展，缺血引起的神经细胞不可逆的损伤，从而导致脑功能的降低或损坏，最终进展为血管性痴呆、脑白质稀疏等多种脑血管疾病［5］。硫化氢已经被认为是第三种气体信号分子，在神经系统生理和病理生理过程中发挥重要作用。硫化氢能够调节NMDA受体，增强NMDA受体介导的神经反应，易化海马的长时程增强效应［6］。

在本研究中慢性脑缺血组大鼠海马CA1和皮质区酪氨酸羟化酶免疫反应阳性染色较假手术组稍加深，阳性细胞数明显增多，与假手术组比较有显著性差异（P<005），慢性脑供血不足使大脑处于慢性缺血缺氧的状态而导致神经元变性，可能是通过长周期负反馈作用，使酪氨酸羟化酶表达上调。低氧状态可提高酪氨酸羟化酶mRNA转录速率和酪氨酸羟化酶mRNA的稳定性，增强胞浆蛋白与酪氨酸羟化酶mRNA3'端未翻译区域的结合，保护mRNA免受核酸酶的作用而降解，从而上调酪氨酸羟化酶的表达，使多巴胺等儿茶酚胺类神经递质合成增多，参与保护学习记忆能力［7］。有研究表明：硫氢化钠低于300μM时可以抑制6羟基多巴、鱼藤酮及1甲基4苯基吡啶离子所诱导的PC12及SHSY5Y的细胞凋亡，其机制是维持线粒体膜电位稳定，抑制细胞色素c释放和caspase级联反应的激活［8］。硫化氢治疗组在海马CA1和皮质区酪氨酸羟化酶的表达显著增加，硫氢化钠中剂量组、高剂量组与模型组比较有显著性差异（P<005），考虑硫化氢可能通过抑制细胞凋亡、增强细胞抗氧化能力从而上调酪氨酸羟化酶的表达，使多巴胺等儿茶酚胺类神经递质合成增多，从而改善慢性脑缺血大鼠的学习记忆能力，其具体机制有待于进一步研究。

参考文献

［1］Brager DH，Capogna M，Thompson SM .Shortterm synaptic plasticity，simulation of nerve terminal dynamics，protein kinase C activation in rat hippocampus. J.Physiol，2002,541:545–559

［2］Sarti C,Pantoni L,Bartolini L,et al. Cognitive impairment and chronic cerebral hypoperfusion:what can be learned from experimental models〔J〕.J Neurol Sci,2002; 2034:263266

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［4］Shibuya N,Tanaka M,Yoshida M,et al.3Mercaptopyruvate sulfur produces hydrogen in the brain［J］. Redox Signal,2009,11(4):703714

［5］Torre JC.Alzheimer＇s disease is a vasocognopathy:a new term to describe its nature［J］.Neurol Res,2004，6(5):517524

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［7］Iwawaki T,Kohno K,Kobayashi K.Identification of a potential nurrl response element that the tyrosine hydroxylase gene promoter cells［J］,Biochem Biophys Res Commun,2000,274(3):590595

［8］Tiong CX,Lu M,Bian JS.Protective effect of hydrogen sulphide against 6OHDAinduced

cell injury in SHSY5Y cells involves PKC/PI3K/Akt pathway.Br J Pharmacol，2010，161:467480

论文作者:郑永强刘南暖叶飞邓晓玲上官守琴王成谋

论文发表刊物:《中医学报》2013年12月第28卷供稿

论文发表时间:2014-3-21

标签：大鼠论文;  酪氨酸论文;  硫化氢论文;  脑缺血论文;  剂量论文;  迷宫论文;  氢化论文;  《中医学报》2013年12月第28卷供稿论文;