石常友[1]2008年在《哺乳藏猪肠道小肽及氨基酸转运载体mRNA表达的组织特异性和发育性变化的研究》文中研究说明蛋白质是叁大主要营养素之一,对动物的生长发育和新陈代谢起着至关重要的作用,小肽和游离氨基酸是蛋白质消化产物的主要形式,其中2-3个氨基酸组成的小肽的吸收是通过肠道上皮细胞上H+驱动小肽转运载体完成的,而游离氨基酸的吸收是通过肠上皮细胞上大量氨基酸转运载体实现的。本文意在探讨藏猪肠道小肽和氨基酸转运载体的组织分布以及发育性表达,为此,开展了①藏猪小肽转运载体PepT1 cDNA克隆,②藏猪哺乳阶段肠道小肽转运载体Pept1、酸性氨基酸转运载体EAAC1和碱性氨基酸转运载体CAT1 mRNA的组织特异性,③藏猪哺乳阶段肠道不同部位EAAC1、CAT1以及PepT1 mRNA表达的发育性变化研究。试验①:选取28日龄哺乳仔藏猪6头,以空肠中段为组织样本,运用RT-PCR技术对藏猪肠道小肽转运载体PepT1 cDNA进行了克隆。结果表明,首次成功克隆了藏猪小肽转运载体PepT1 cDNA的编码区,全长2127bp,Genbank基因序列号为:EU400159,预测该转运载体蛋白由708氨基酸组成。通过TMHMM软件对PepT1蛋白二级结构进行预测显示Pept1具有典型的膜蛋白结构,共有13个跨膜结构域,其中第10和11跨膜结构之间存在一个大的胞外环。试验②:选取体重接近并且健康的28日龄哺乳仔藏猪6头,屠宰后分离肠道(十二指肠、空肠前段、空肠后段和回肠),运用Real-Time PCR技术对藏猪不同肠段小肽转运载体PepT1,酸性氨基酸转运载体EAAC1和碱性氨基酸转运载体CAT1 mRNA的组织分布进行研究。结果发现,1)空肠后段PepT1 mRNA表达丰度最高,显着高于十二指肠、空肠前段和回肠(P<0.05);回肠PepT1 mRNA表达量最低,但与空肠前段以及十二指肠肠的差异不显着(P>0.05);2)从小肠近端到远端EAAC1 mRNA的表达丰度在小肠的表达呈升高趋势,即回肠表达最高,显着高于空肠前、后段和十二指肠(P<0.05);空肠后段次之,但与十二指肠、空肠前段差异不显着(P>0.05);3)不同肠段CAT1 mRNA表达格局与EAAC1相似,回肠中CAT1mRNA表达丰度最高,显着高于十二指肠(P<0.05);空肠前、后段差异不显着(P>0.05)。试验③:选取体重接近并且健康的哺乳仔藏猪30头,即1、7、14、21和28日龄各6头,运用实时定量PCR对PepT1、EAAC1、CAT1 mRNA表达的发育性变化进行了研究。结果表明,藏猪EAAC1、CAT1、PepT1 mRNA表达的发育性变化在十二指肠、空肠和回肠都有较大差异。其中十二指肠中CAT1、PepT1 mRNA表达的发育性变化相似,1-14日龄呈上升趋势并在14日龄达到最大值,21、28日龄均有所降低。1、7日龄EAAC1mRNA表达量显着大于14、21和28日龄;空肠中EAAC1、CAT1mRNA表达的发育性变化相似,1-14日龄呈上升趋势,21日龄显着下降,28日龄回升,1-21日龄PepT1 mRNA表达丰度呈递增趋势,28日龄略有下降。回肠中PepT1与EAAC1mRNA表达丰度具有相似的发育性变化,7日龄PepT1和EAAC1mRNA表达量均达到最大,14日龄显着降低,21日龄显着上升,28日龄略有下降。1-14日龄回肠CAT1 mRNA的表达丰度呈递增趋势,接着在21日龄显着下降,到28日龄反转显着增加并达到最高点。总体而言,哺乳仔藏猪不同肠道PepT1、EAAC1、CAT1mRNA的表达具有组织特异性,同一转运载体mRNA在不同肠段表达的发育性变化有所不同,同一肠段不同转运载体mRNA表达的发育性变化也有所不同。
乔永[2]2007年在《湖羊羔羊不同部位肌肉肌内脂肪沉积相关基因表达的发育性变化研究》文中研究表明为了给绵羊肌内脂肪(Intramuscular fat，IMF)沉积规律及相关基因表达规律的研究提供基础资料，本文以0～6月龄的雄性湖羊羔羊为试验对象，探讨了湖羊羔羊不同部位肌肉(背最长肌、腰大肌、后腿股二头肌和前腿肱二头肌)肌内脂肪沉积的发育性变化以及脂肪沉积和代谢相关基因表达的发育性变化特点。本研究用索氏抽提法测定肌内脂肪含量；以GAPDH基因为内标，用real time PCR法对影响肌内脂肪含量的部分相关基因的表达进行了相对定量分析；并对基因表达与肌内脂肪含量的相关性进行了分析。研究结果如下：1．湖羊羔羊不同部位肌肉肌内脂肪沉积的发育性变化(1)湖羊羔羊不同部位肌肉肌内脂肪含量在0-6月龄间均呈上升趋势，5月龄时极显着高于前面各月龄(P＜0.01)；在背最长肌中，2月龄时IMF显着高于初生时(P＜0.05)；腰大肌IMF在3月龄时显着高于初生时(P＜0.05)；后腿股二头肌IMF在前4个月龄时差异均不显着；在0～6月龄间，背最长肌IMF量均高于腰大肌和股二头肌；表明肌内脂肪沉积在绵羊不同部位肌肉沉积的速度有较明显差异，湖羊肌内脂肪的沉积有较明显的组织特异性。(2)4～5月龄是湖羊羔羊肌肉脂肪沉积最快的时期，5月龄时的肌内脂肪含量在不同肌肉部位都极显着高于前面各月龄(P＜0.01)，表明4～5月龄时是湖羊羔羊肌内脂肪迅速沉积的一个重要时期。2．湖羊羔羊肌肉OB基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)在湖羊羔羊背最长肌中，OB基因mRNA表达水平3月龄时极显着高于其余各月龄(P＜0.01)；在腰大肌中，初生时表达水平最高，显着高于2～3月龄(P＜0.05)，3月龄时下降到最低，到4月龄后回升；在前腿肌肉中，初生羔羊的OB基因表达量最高，显着高于3、5和6月龄(P＜0.05)，然后随月龄增加而波动下降，6月龄时降到最低；后腿肌肉中，初生时OB基因表达量较低，随月龄的增加而上升，3月龄时升到最高，极显着高于初生时(P＜0.01)，显着高于其余各月龄(P＜0.05)，然后4月龄时回落，并保持这种低水平表达；(2)初生时腰大肌和前腿肌肉OB基因表达水平极显着高于背最长肌和后腿肌肉(P＜0.01)，3月龄时背最长肌极显着高于腰大肌和前腿肌肉(P＜0.01)，后腿肌肉显着高于腰大肌和前腿肌肉(P＜0.05)；表明OB基因mRNA表达水平发育性变化在湖羊羔羊肌肉中表现出较明显的组织特异性；(3)背最长肌中OB基因的表达与IMF在3～6月龄间成负相关(r=-0.405，P=0.119)，股二头肌OB基因的表达量与IMF在3～6月龄间成负相关(r=-0.303，P=0.194)，表明OB基因在肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积起着一定的负作用。3．湖羊羔羊肌肉OBR基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)OBR基因mRNA在湖羊羔羊不同部位肌肉中的发育变化模式基本相同，即在刚出生时表达量均较低，然后随月龄增加而上升，到3月龄时各部位均升到最高，然后又下降，保持一个相对较低的水平；腰大肌中，2月龄时OBR mRNA的表达水平极显着高于0～1月龄和4～6月龄(P＜0.01)；背最长肌中OBR表达水平在3月显着高于2和6月龄(P＜0.05)；OBR基因在肱二头肌中的表达水平在3月龄时极显着大于其余各月龄(P＜0.01)；在股二头肌中，3月龄时OBR基因表达水平极显着大于0～1和5～6月龄(P＜0.01)，显着高于4月龄(P＜0.05)，6月龄水平显着低于2月龄(P＜0.05)；(2)2月龄时股二头肌OBR基因mRNA表达量极显着高于背最长肌(P＜0.01)，3月龄时肱二头肌和股二头肌均高于腰大肌和背最长肌(P＜0.05)，4月龄时股二头肌极显着高于腰大肌(P＜0.01)，表明OBR基因在湖羊羔羊肌肉中的表达呈现出组织特异性和时序性发育变化模式；(3)股二头肌中OBR基因的表达量与IMF在本研究中的各月龄均呈明显的负相关(r=-0.433，P=0.012)；在背最长肌(r=-0.128，P=0.209)和腰大肌中(r=-0.254，P=0.168)也发现成负相关，表明OBR基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积也起一定的负作用。4．湖羊羔羊下丘脑OBR基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)湖羊羔羊下丘脑OBR基因在0～6月龄间保持稳定表达水平；(2)湖羊下丘脑OBR基因表达水平与各部位肌肉肌内脂肪含量无明显相关性。5．湖羊羔羊肌肉FAS基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)湖羊羔羊背最长肌中FAS基因mRNA表达在初生时较低，然后波动上升，到5月龄时升到最高(P＜0.01)；在腰大肌中，FAS基因mRNA水平变化呈现出先高后低的趋势，2月龄时最高，极显着高于4～6月龄(P＜0.01)，4月龄时最低，极显着低于0～2月龄(P＜0.01)；前腿肌肉中，FAS基因mRNA水平随月龄的增加先上升后下降，到3月龄时升到最高，极显着高于其余各月龄(P＜0.01)，然后下降保持相对较低水平的表达；后腿肌肉中FAS基因表达量初生时较低，波动上升，到3月龄时最高，然后4月龄时下降到最低，极显着低于3和6月龄(P＜0.01)，5～6月龄缓慢回升；(2)除4月龄时，腰大肌FAS基因mRNA水平均极显着高于其余各部位肌肉(P＜0.01)；2月龄和5～6月龄时背最长肌FAS表达也极显着高于其余各部位(P＜0.01)；3月龄时前腿肌肉FAS mRNA水平极显着高于其它部位肌肉(P＜0.01)。表明FAS基因表达在湖羊羔羊肌肉中的发育性变化有明显的组织特异性；(3)背最长肌FAS基因表达量与IMF在0～6月龄呈极显着正相关(r=0.606，P=0.005)，腰大肌中FAS基因表达量与IMF在4～6月龄呈正相关关系(r=0.360 P=0.187)，股二头肌中FAS基因表达量与IMF在4～6月龄呈正相关关系(r=0.471，P=0.076)，表明FAS基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积可能起着正向调控的作用。6．湖羊羔羊肌肉HSL基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)HSL基因在湖羊羔羊肌肉中的发育性变化表现为：背最长肌中初生时最低，然后随月龄的增加上升，3月龄时出现峰值，显着高于0～1月龄(P＜0.05)，然后又下降，6月龄时升到最高，极显着高于以前各月龄(P＜0.01)；腰大肌中表现为“下降-上升-下降-上升”的模式，3月龄时最高，极显着高于1和4月龄(P＜0.01)；前腿肌肉中先下降，后上升，再下降保持稳定，2月龄时最低，极显着低于刚出生时(P＜0.01)；后腿肌肉表现为先上升，后下降，又上升的模式，3月龄时最高，显着高于0～1月龄(P＜0.05)，4月龄时最低，极显着低于3月龄(P＜0.01)；(2)在0～6月龄，腰大肌中HSL基因mRNA表达量均极显着高于其它部位(P＜0.01)，0月龄时背最长肌极显着低于其它部位．(P＜0.01)，4月龄时股二头肌极显着低于其余部位(P＜0.01)，6月龄时背最长肌极显着高于前腿和后腿肌肉(P＜0.01)；表明HSL基因表达在湖羊羔羊肌肉中的发育性变化有明显的组织特异性，其中在腰大肌中的表达量显着高于其余各肌肉部位；(3)对湖羊羔羊不同部位肌肉中HSL基因的表达量和IMF的相关性分析表明：各部位肌肉中两者均呈正相关关系，其中背最长肌在0～6月龄呈极显着相关(r=0.630，P=0.0003)，腰大肌和股二头肌中4～6月龄两者的相关系数分别为0.589(P=0.020)和0.280(P=0.121)，表明HSL基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪沉积的调控可能不是在mRNA水平，可能在蛋白水平上。7．湖羊羔羊肌肉LPL基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)LPL基因在湖羊羔羊不同肌肉部位表现出较明显的差异：在背最长肌中LPL基因的表达随月龄的增加而上升，到5月龄时升到最高，显着高于1～4月龄(P＜0.05)，极显着高于0月龄(P＜0.01)；在腰大肌中LPL水平初生时较高，到1月龄时上升，到3月龄间稳定，4月龄时下降到最低，5～6月龄回升到1～3月龄时的水平，各月龄间差异不显着；前腿肌肉中，0～2月龄保持稳定，3月龄时升到最高，4月时下降，5月龄时上升，到6月又下降，其中3和5月龄时的表达量极显着高于其余各月龄(P＜0.01)；后腿肌肉中，LPL基因初生时较高，然后下降，到3月龄时升到最高，4月龄时下降，5～6月龄又回升，各月龄间差异不显着；(2)在刚出生时，股二头肌中LPL mRNA水平极显着高于其余部位肌肉(P＜0.01)，1～2月龄时腰大肌和股二头基因表达量均高于另外两个研究部位(P＜0.05)，3月龄时股二头肌极显着高于背最长肌(P＜0.01)，4月龄时背最长肌和股二头肌均显着高于另外两个部位(P＜0.05)，6月龄时肱二头肌极显着低于其余叁个部位(P＜0.01)；(3)湖羊羔羊背最长肌中LPL基因的表达量与IMF在0～6月龄呈极显着正相关(r=0.503，P=0.005)，在股二头肌肌肉中，LPL基因mRNA水平与IMF呈正相关(r=0.294，P=0.102)，表明LPL基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积有一定的积极作用。8．湖羊肌肉UCP3基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)湖羊羔羊不同部位肌肉中UCP3基因表达的发育性变化表现为：在背最长肌中，初生时较高，到1月龄时升到最高，然后随月龄增加下降，6月龄时降到最低，各月龄间差异不显着；腰大肌中表现为先上升后下降的模式，3月龄时出现峰值，各月龄间差异不显着；前腿肌肉中初生时较高，1月龄有所下降，2月龄升到最高值，3月龄下降到最低，4月龄回升后又逐渐下降，各月龄间差异不显着；后腿肌肉在各月龄间保持较稳定的水平，没有较大差异；(2)在3月龄时腰大肌中UCP3基因表达水平显着高于其余叁个肌肉部位；表明UCP3基因在湖羊不同部位肌肉中的发育性变化有差异，但差异不明显。(3)湖羊羔羊背最长肌中UCP3基因的表达量与背最长肌IMF在0～6月龄呈负相关(r=-0.211，P=0.262)；在股二头肌肌肉中，UCP3基因mRNA水平与股二头肌中IMF在2～6月龄间呈负相关(r=-0.209，P=0.328)；在腰大肌中，UCP3基因的表达量与IMF在3～6月龄成负相关(r=-0.286，P=0.266)，表明UCP3基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积可能起着负向调控的作用。
黄晔[3]2008年在《NP、BPA和B[a]P联合暴露对斑马鱼（Danio rerio）体内雌激素/抗雌激素效应的研究》文中指出环境内分泌干扰物(EDCs)广泛存在于生活和工作的环境中,并可通过食物链进入动物和人体内,干扰机体正常内分泌系统功能。目前,对单一化合物的内分泌干扰效应已有比较详细的研究,主要造成生殖障碍、出生缺陷、发育异常、代谢紊乱以及癌症发生等不良影响。但是野外环境是非常复杂的,往往存在多种EDCs共同作用,与此相关的报道还很少,据仅有的少量资料可以发现,两种或多种化合物的联合效应并不是各个污染物作用的简单相加,值得我们深入研究。然而,在EDCs作用机理方面的研究还很有限,各实验室的结果时常出现矛盾,无法以现有的的理论来解释。近年来,许多研究者逐渐开始关注AhR-ERα交叉作用在水生动物体内EDCs效应中发挥的作用,众所周知ERα是体内介导雌激素效应的重要受体,其表达受到内源或外源化合物影响,而细胞色素P450系统中的CYP1A与大多数环境污染物的代谢有关,且受到AhR的调控。由此,我们猜想AhR-ERα途径可能在环境内分泌干扰物的联合效应中发挥着重要的调控作用。在本文的研究中,我们用壬基酚(NP)、双酚A(BPA)、苯并[a]芘和雌二醇(E2)多种内分泌干扰物对斑马鱼进行联合暴露,检测暴露后AhR-ERα相关基因的表达差异,试图通过AhR-ERα交叉作用途径来探讨EDCs的雌激素效应或抗雌激素效应的机制。为了获得一个准确、稳定、高效的AhR-ERα交叉作用检测系统,我们选择real-time RT-PCR法测定基因表达水平,并根据GenBank上已公布的序列信息设计实验所用目的基因(ERα、Vtg、AhR和CYP1A)以及内参基因(β-actin)引物。在优化的实时定量RT-PCR条件下,确保引物的特异性和灵敏度符合实验测定要求。而且,通过实验确认目的基因和内参基因的扩增效率基本一致,完全可以用2~(-△△Ct)相对定量方法分析real-time RT-PCR测得的数据。我们通过NP和BPA联合暴露斑马鱼来研究环境类雌激素的联合效应。将成年雄性斑马鱼置于NP(62.5和125μg/L)和BPA(250、500和1000μg/L)半静态系统中,联合暴露14d。从实验结果可以发现,NP和BPA的联合雌激素效应是通过诱导ERα来介导Vtg表达的,这种表达随NP和BPA浓度的升高而上调,有显着的浓度-效应关系。NP与低浓度(250μg/L)BPA和中浓度(500μg/L)BPA联合暴露能诱导ERαmRNA上调2.5至5.7倍,远大于单独暴露的效应之和,呈现明显的协同效应。同样,联合暴露使Vtg随ERαmRNA表达量急剧上升,协同效应也极显着。然而,NP和BPA联合暴露剂量与AhR或CYP1A表达量之间没有明显的相关性。这些结果提示,NP和BPA共同作用于ERα,在低浓度时相互促进与ERα结合,表现为相加效应。另外,从我们的数据发现,NP和BPA并不是通过CYP1A进行代谢的。为了解B[a]P的抗雌激素效应,我们将性成熟雌性斑马鱼暴露于不同浓度B[a]P中研究其与内源雌激素的联合作用,同时将成体雄性斑马鱼暴露于B[a]P和E2混合的水体中研究它与外源雌激素的联合效应机制。首先,当B[a]P暴露浓度在10～50μg/L范围内,性成熟雌性斑马鱼肝脏中ERα和Vtg表达量急剧下降;暴露浓度＞50μg/L时,ERαmRNA表达量维持在一定水平,不再随B[a]P浓度提高而下调,Vtg反而缓慢回升。同时,检测到AhR mRNA表达量显着上升,100μg/L暴露组诱导的表达量最高,然后回落。低剂量(10～20μg/L)B[a]P对CYP1A表达量影响不明显,但是高剂量组(100和200μg/L)诱导CYP1A表达量显着增加。这些结果提示,低剂量B[a]P激活AhR介导的对内源E2(诱导ERα介导的雌激素效应)的代谢作用,而高剂量B[a]P却抑制了这种作用。随后,我们在E2和B[a]P对雄性斑马鱼进行联合暴露时发现,在较低E2浓度(250ng/L)条件下,B[a]P也能诱导AhR和CYP1AmRNA上调,并抑制ERα和Vtg mRNA表达,也呈浓度-效应关系;然而,高浓度E2(500ng/L)与B[a]P联合作用于雄性斑马鱼时,E2反而对AhR有抑制作用,AhR和CYP1AmRNA急剧下降,且EROD酶活性也迅速降低。这些结果说明AhR-ERα交叉作用的机制十分复杂,通过这一途径对外源污染物进行的调控可能与所暴露物质各自的效应浓度有关,还有待今后进一步研究。
张莹[4]2016年在《自然放牧与放牧补饲育肥对呼伦贝尔羔羊与呼杜杂一代羔羊脂肪与蛋白质代谢的影响》文中指出本论文研究了呼伦贝尔羔羊(HL)与呼杜杂一代羔羊(HZ)在自然放牧(NG)与放牧补饲(GS)两种不同育肥方式下脂肪酸(FA)和氨基酸(AA)组成存在的差异,并从脂类和蛋白质代谢相关的血液和组织生化指标、相关基因和蛋白质表达及其与日粮组成的关系角度,探讨其存在差异的主要原因,寻找可能影响羊肉FA和AA组成的关键因素,为通过日粮对羊肉的品质和风味进行调控进而提高羊肉质量提供理论依据。采用2x2完全随机试验设计,选择体重、体型与体况接近的健康4月龄断奶HL和HZ公羔各60只,随机分成4组,每组30只。其中,因素一分为NG和GS两种育肥方式,因素二为2个品种,分别为HL和HZ。育肥试验分为育肥前期(1-30d)和育肥后期(31-60d)两个阶段。NG组在天然草场进行自然放牧(8-10月份)。GS组在自然放牧的基础上每天补饲精料补充料,补饲期分为前、后2期,共2个月。论文分6个试验,试验1比较研究了不同育肥方式下HL和HZ羔羊日粮FA与AA组成的差异。试验2和试验3比较研究了不同育肥方式下HL和HZ羔羊羊肉FA和AA含量与组成的差异,探讨了育肥方式和品种对肉羊肉品质的影响。试验4比较研究了不同育肥方式下HL和HZ羔羊脂肪和蛋白质代谢有关的血液生化指标及组织酶活的变化规律,探讨了育肥方式和品种对肉羊脂肪和蛋白质代谢的影响。试验5和试验6研究了不同育肥方式对HL和HZ羔羊脂肪和蛋白质代谢相关基因和蛋白质表达的影响,进一步从基因转录、蛋白翻译、Wnt信号通路和mTOR信号通路探讨了其可能的影响机理。在本试验条件下初步得出以下结果：从日粮FA组成及其进食量分析,与NG组相比,GS组日粮SFA含量及其进食量较高,其中主要是C16：0和C18：0,其次是C17:0;MUFA含量及其进食量较高,主要是C18：1c9,其次是C15:1;ω-6PUFA含量及其进食量较高,主要是C18：2c6,其次是C18:2t6;NG组日粮co-3PUFA含量及其进食量较高,主要是C18：3n3,其次是C20：5n3。从日粮AA组成及其进食量分析,与NG组相比,GS组日粮EAA含量及其进食量较高,其中主要是Leu,其次是Phe和Lys；NEAA含量及其进食量较高,主要是Glu,其次是Asp；BCAA含量及其进食量较高,主要是Leu,其次是Ile和Val;FAA含量及其进食量较高,主要是Glu,其次是Leu和Arg；DAA含量及其进食量较高,主要是Glu,其次是Met和Asp；LAA含量及其进食量较高,主要是Met,其次是Lys。与NG组相比,GS组多数肌肉和脂肪组织中SFA含量较高,其中主要是C18：0,其次是C14：0和C24:0;MUFA含量较高,主要是C18：1c9,其次是C17:1;ω-6PUFA含量较高,主要是C18：2n-6c,其次是C18:3n-6;NG组肌肉和脂肪组织中co-3PUFA含量较高,主要是C18：3n-3,其次是C20:5n-3。HZ羔羊多数肌肉和脂肪组织中SFA含量较高,主要是C16：0和C18：0,其次是C24:0;MUFA含量较高,主要是C18:ln-9c。与GS组相比,NG组血浆和肌肉组织中EAA、NEAA和BCAA含量升高；与HL相比,HZ血浆和肌肉组织中EAA、NEAA、TAA、FAA、LAA和DAA含量均有升高的趋势。与GS组相比,NG组血清中与脂肪和蛋白质分解相关的T3/T4、GH、Leptin和TNFa含量显着升高,血清中TP、TG和LDL-C含量显着降低,血清和组织中与FA分解相关的HSL酶活及与蛋白质代谢相关的BCAT2和BCKD酶活显着升高；血清中与脂肪和蛋白质合成相关的INS含量显着降低,血清和组织中与FA合成相关的FAS和ACC酶活显着降低。与HL相比,HZ血清中T3/T4、PG、NEFA含量和HSL酶活显着降低,但IGF-1、TG、HDL-C含量和ACC酶活显着升高。GS组肌肉、脂肪和肝脏组织中与脂肪合成相关的ADD1、FAS, ACC和DGAT1 mRNA表达量高于NG组,但与脂肪分解相关的HSL mRNA表达量低于NG组；HZ中与脂肪合成相关的ADD1、FAS, ACC和DGAT1 mRNA表达量高于HL羔羊,但与脂肪分解相关的HSL mRNA表达量低于NG组。与GS组相比,NG组Wnt信号通路中PPARγ mRNA表达量显着升高,但β-catenin mRNA表达量呈现相反的规律。与HZ相比,HL中PPARy和C/EBPα mRNA表达量显着降低,但β-catenin mRNA表达量显着升高。Wnt信号通路中蛋白表达的规律基本与基因转录规律相一致。与GS组相比,NG组与蛋白质合成正相关的mTORC1, S6K1和eIF-4G mRNA表达量显着降低,与蛋白质合成负相关的4EB-P1mKNA表达量显着升高；与HL相比,HZ组织中mTORCl、S6K1和eIF-4G mRNA表达量显着升高,而4E-BP1mRNA表达量显着降低。mTOR信号通路中蛋白表达的规律基本与基因转录规律相一致。综合上述研究结果得出,从脂肪酸营养角度分析,NG组肌肉和脂肪组织的肉品质优于GS组,HL肌肉和脂肪组织的肉品质优于HZ羔羊。引起其差异的主要原因是日粮的FA含量与组成不同,与自然放牧相比,放牧补饲日粮PUFA含量降低,提高了组织中与FA从头合成相关的FAS, ACC和PPARy mRNA表达量,进而提高了从头合成酶ACC、FAS及SCD的活性及血清中INS和IGF-1含量,导致体组织中SFA和MUFA含量的增加；日粮中C18：2n6和C18：3n-3含量是导致体组织相应FA差异的主要原因,进而引起肉品质发生改变。从蛋白质营养角度分析,NG组肌肉的蛋白质营养价值低于GS组,HL肌肉的蛋白质营养价值低于HZ羔羊。引起其差异的主要原因是日粮的AA含量与组成不同,与自然放牧相比,放牧补饲日粮中Leu含量较高,提高了血清中INS和IGF-1含量,激活了mTOR信号通路,提高了mTORCl、S6K1、4EB-P1 mRNA及其磷酸化蛋白的表达量,进而促进了蛋白质合成；降低了BCAT1和BCKD酶活,提高了肌肉中BCAA的含量,进而导致肌肉的营养价值发生变化。
刘新福[5]2016年在《ERCC1、TS和TUBB3的表达与胃癌化疗敏感性及其预后的相关性研究》文中指出一、研究背景及目的胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,发病率位于全球最常见的恶性肿瘤中的第4位,肿瘤相关死亡原因居第2位。中国是胃癌高发国家,其发病人数占全世界的42%,并且新发胃癌患者愈来愈年轻化,其死亡率仅次于肺癌和肝癌。世界上大多数国家包括中国尚未开展胃癌常规性筛查,同时胃癌起病隐匿,早期常常无典型症状体征,多数病例常在晚期才会被确诊,单纯手术治疗疗效差,术后5年生存率仅20%左右,严重危害人们的生命与健康。胃癌的发生发展是一个多阶段多因素多步骤共同作用的复杂过程,涉及多个癌基因的活化和抑癌基因的失活,但胃癌发病的分子机制迄今尚未完全明确,目前研究结果显示,幽门螺旋杆菌感染、饮食、吸烟及宿主的遗传易感性是影响胃癌发生的重要因素。目前研究表明,个体间化疗疗效的差异不能用患者年龄、性别、组织类型、生长部位、脏器功能状态等来加以解释。影响化疗疗效及毒性反应的主要因素是药物基因组学。药物基因组学是研究基因变异所致的不同疾病对药物的不同反应,是在药物遗传学基础上发展起来的新兴学科。20世纪50年代,人们就发现不同的遗传基因会导致药物不同的反应。由于胃癌患者对化疗的敏感性不同,使真正获益于化疗患者并不多,如果选择不当,反而使一些对于化疗不敏感的患者延误治疗、增加痛苦及治疗费用。因此,筛选晚期胃癌患者化疗的敏感性生物标记物,对患者的化疗敏感性进行预测,可以有效避免上述风险,使患者最大程度获益。铂类药物对肿瘤的细胞毒性作用主要是通过形成铂-DNA加合物,其作用靶点为DNA。铂-DNA加合物可以引起链间交联诱导DNA畸变,从而抑制DNA修复。导致顺铂耐药的一个重要机制就是核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER), NER在DNA修复中发挥着重要作用,其修复过程是一个复杂的过程。切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementing gene 1, ERCC1)是NRE通路中1个关键基因,ERCC1的表达水平与铂类耐药有关。氟尿嘧啶类药物是临床上重要的抗肿瘤药物,其抗肿瘤作用主要源于其竞争性抑制胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, TS), TS是嘧啶核苷酸合成通路的限速酶,在DNA的合成和修复当中起着极为重要的作用,为氟尿嘧啶类药物(如5-氟尿嘧啶、卡培他滨、S-1)的靶点,因此TS被认为是5-氟尿嘧啶(5-FU)及其衍生物治疗恶性肿瘤过程中的一个靶点,其活性高低的变化与肿瘤对5-FU耐药密切相关。TS是5-dUMP磷酸化成5-dTMP的一个限速酶,正常情况下,在常规合成中5-dTMP转变成合成DNA的5-dTTP,缺乏TS存在,DNA合成受限,最终导致细胞死亡。增加肿瘤细胞中TS的表达能阻断5-FU诱导的细胞核毒性,促进DNA合成,修复肿瘤细胞。微管蛋白结合类药物是作用于细胞微管,通过影响纺锤体形成,从而抑制细胞有丝分裂的一类广谱化疗药,常用于实体瘤和血液恶性肿瘤。紫杉醇和多西紫杉醇是临床上常用的抗微管蛋白化疗药物,该类药物可以促进微管聚合和稳定已聚合微管,也称为微管稳定剂。在接触该类药物后,细胞内会积累大量微管,从而干扰细胞的代谢,特别是使细胞有丝分裂停止,发挥抗肿瘤效果。细胞内微管蛋白分α、β两个亚型,是有丝分裂时纺锤体的基本组成单位,也是抗微管药物的主要作用靶点。β-微管蛋白Ⅲ(class Ⅲ β-tubulin, TUBB3)是微管蛋白家族中的一种亚型,多个临床研究表明,在肺癌、卵巢、前列腺、乳腺及胰腺癌多种人类肿瘤细胞株中,TUBB3高表达与紫杉醇类化疗药物耐药有关。2012年美国国家癌症综合癌症网络(NCCN)非小细胞肺癌的指南中已经明确指出,在接受化疗前检测ERCC1、RRM1表达水平检测可提高有效率和患者生存率,但在胃癌等其它肿瘤中尚未提及。然而近2年公布的研究大多提示在肺癌中ERCC1不能预测含铂化疗疗效试验,这提示化疗分子标记物的检测及其指导化疗的临床研究存在很大争议,化疗相关的分子标志物在临床研究中依然是巨大挑战。目前国内外专家对生物标记物是否可预测晚期胃癌预后及化疗疗效相关的研究相对较少,且目前研究多处于回顾性研究。我们课题组在临床上收集胃癌病例,观察胃癌组织中ERCC1、TS和TUBB3的表达水平与临床病理特征的相关性,分析它们与化疗敏感性及预后相关性,并通过体外细胞实验加以证实,为胃癌个体化治疗的靶标检测提供临床及实验理论依据,规范临床治疗,高效使用医疗资源为病人服务具有重要意义。二、实验方法第1章ERCC1、TS和TUBB3在胃癌组织中的表达及相关性研究1、收集湖南省邵阳市中心医院2008年12月至2011年12月临床资料完整的118例胃癌患者,其中2例患者因免疫组化染色不符合要求而被剔除,共116例完成全部试验可供评价,按美国癌症联合委员会(AJCC)胃癌TNM分期,Ⅱ期23例,Ⅲ期66例,Ⅳ期27例,男62例,女54例,组织学分级：高分化20例,中分化35例,低分化61例,有淋巴结转移69例,未发生转移47例。收集资料包括病人的年龄、性别、住院号、病理类型,ECOG评分、有无淋巴结转移、肿瘤大小和临床分期。所有胃癌组织标本经10%福尔马林固定,常规脱水、石蜡包埋,一部分标本用于免疫组化检测胃癌组织中ERCC1、TS和TUBB3蛋白的表达水平；另一部分标本用于分支液相芯片技术检测胃癌组织中ERCC1TS和TUBB3 mRNA的表达水平。分析ERCC1、TS和TUBB3在胃癌中的表达与临床病理特征之间的关系,同时分析ERCC1、TS和TUBB3叁者的相关性。2、免疫组化结果判读胃癌组织标本用10%福尔马林固定、石蜡包埋、组织切片(4gm),采用免疫组化SP法检测ERCC1、TS和TUBB3蛋白,操作按免疫组化试剂盒说明书进行。用PBS代替一抗作阴性对照,用已知阳性切片作阳性对照。由2位病理科高级职称医师在对临床资料不知情的情况下,对标本染色结果进行判断。所有评分分为0、1、2、3和4分,>2分定义为高表达,≤2分为低表达。第2章晚期胃癌中ERCC1、TS和TUBB3表达与化疗疗效及预后的研究1、选择湖南省邵阳市中心医院2008年12月至2011年12月临床及随访资料完整并经病理学确诊的晚期胃癌患者67例进行回顾性分析(包括失去手术指征的晚期胃癌及术后复发转移的胃癌患者)。免疫组化方法检测胃癌组织中ERCC1、TS和TUBB3蛋白的表达水平,分析ERCC1与铂类、TS与氟尿嘧啶类及TUBB3与紫杉醇类化疗药物敏感性及预后的相关性。2、化疗方案及临床疗效评价接受卡培他滨、替吉奥胶囊或5-氟尿嘧啶为基础的化疗组,具体用法为：根据体表面积计算剂量,卡培他滨1000-1250mg/m2,替吉奥胶囊40mg/m2,饭后半小时口服,每天2次,连用2周,休息1周,每3周重复,5-FU 1000mg/m2,持续泵入,d1-3,每3周重复。接受紫杉醇或多西紫杉醇为基础的化疗组,具体用法为：多西紫杉醇75mg/m2,静脉滴注d1或紫杉醇150-175 mg/m2,静脉滴注,dl,每3周重复。接受顺铂或奥沙利铂为基础的化疗组,具体用法为：顺铂75mg/m2,静脉滴注dl或奥沙利铂130 mg/m2,静脉滴注,d1,每3周重复。其中DCF方案36例,TP方案11例,多西他赛单药方案2例,XELOX方案8例,替吉奥胶囊单药方案2例,希罗达单药方案3例,ECF方案5例,对于年龄超过70岁、PS评分为2分或一般情况较差的患者化疗药物的剂量稍微减量,对能够耐受的患者给予4-6个周期化疗,未完成2周期化疗或失访的患者作为脱落病例,至少2个周期化疗后纳入疗效评价。每个患者治疗2周期后,重新复查胸部+全腹部+盆腔增强CT、胃镜。参照RECIST 1.1实体瘤评价疗效标准进行疗效评价,分为完全缓解(complete response, CR)、部分缓解(partialresponse, PR)、稳定(stable disease, SD)和进展(progression disease, PD),定义如下：完全缓解(CR)定义为临床症状完全消失并且CT检查病灶完全消失；部分缓解(PR)定义为CT检查所有的肿瘤病灶最长径及其垂直径乘积缩小50%以上,并且没有新的病灶出现；病情稳定(SD)定义为所有的肿瘤病灶最长径及其垂直径乘积缩小不超过50%,增加不超过25%；疾病进展(PD)定义为所有的肿瘤病灶最长径及其垂直径乘积增大超过25%以上或者出现新的病灶。所有患者评估时间一致,如出现CR、PR和SD为临床受益,继续同方案化疗2至4个周期,最多为6个周期,如出现PD,则更改治疗方案。总生存期(OS)定义为从实验入组开始至因任何原因引起死亡的时间。无进展生存期(PFS)定义为从实验入组开始至疾病进展的时间,采用门诊随访、电话随访等方式,末次随访时间为2014年12月。第3章胃癌组织中ERCC1、TS和TUBB3与化疗药物体外药敏实验选择湖南省邵阳市中心医院及南方医科大学南方医院2013年10月至2014年9月期间外科手术的胃癌患者的新鲜标本48例,年龄49-67岁,中位年龄57岁,男28例,女性20例,Ⅱ期18例,Ⅲ期28例,Ⅳ期2例,组织学分级：高分化8例,中分化10例,低分化30例,有淋巴结转移27例,未发生转移21例,所有入选病人在术前未接受放化疗及其它抗肿瘤治疗。术后收集新鲜胃癌组织标本,每份癌组织标本均分成两份：一份立即装入含有100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的RPM11640的离心管中,用于原代培养细胞,制成单细胞悬液,立即送于用ATP-TCA法检测其对体外化疗药物的敏感性。另一部分将组织固定,石蜡包埋用于免疫组化检测ERCC1、TS和TUBB3蛋白的表达。分析体外胃癌细胞中ERCC1与顺铂、TS与5-氟尿嘧啶及TUBB3与紫杉醇化疗药物敏感性的相关性。叁、实验结果第1章1、在116例胃癌病理标本中,ERCC1、TS和TUBB3蛋白在高、中、低不同分化程度的胃癌组织中均有不同程度的表达,ERCC1蛋白阳性表达主要位于肿瘤组织的胞浆和胞核,为棕褐色颗粒,ERCC1低表达组占50.86%(59/116),ERCC1高表达组占49.14%(57/116)。TS蛋白阳性反应颗粒主要位于肿瘤组织的胞浆和胞核,为棕黄色颗粒,TS低表达组占48.28%(56/116),TS高表达组占51.72%(60/116)。在肿瘤组织中TUBB3主要定位于细胞核,成棕黄色弥漫性细颗粒状分布,TUBB3低表达组占55.17%(64/116),TUBB3高表达组占44.83%(52/116)。2、116例胃癌组织标本中,免疫组化及分支液相芯片技术两种方法检测结果提示ERCC1、TS和TUBB3表达与患者性别、年龄、ECOG评分、组织学分化程度、临床分期、淋巴结转移均无明显相关性(P>0.05)。在116例胃癌组织标本中,免疫组化检测ERCC1、TS和TUBB3蛋白叁者共同高表达占18.10%(21/116), ERCC1、TS和TUBB3蛋白叁者共同低表达占12.93%(15/116)。ERCC1、TS蛋白两者共同高表达为31.03%(36/116),两者同时低表达的患者为25.00%(29/116),两种蛋白在胃癌组织中的表达不存在相关性(χ2=1.381,P=0.240)。ERCC1、TUBB3蛋白共同高表达为26.72%(31/116),两者同时低表达的患者为19.83%(23/116),两种蛋白在胃癌组织中的表达亦不存在关联性(χ2=0.348, P=0.556)。TS和TUBB3蛋白共同高表达37.07%(43/116),两者同时低表达的患者为25.86%(30/116),两种蛋白在胃癌组织中的表达存在统计学相关性(χ2=5.690,P=0.017)。第2章1、67例晚期胃癌中,其中有60例患者接受含奥沙利铂或顺铂为基础的化疗方案,1例患者因免疫组化质量问题和2例患者因石蜡标本太少被剔除,57例患者中化疗疗效达CR 2例,PR 26例,SD 17例,PD 12例,化疗总有效率(CR+PR)为49.12%(28/57),ERCC1低表达组有效率为66.67%(20/30),ERCC1高表达组有效率为29.63%(8/27),两者差异具有统计学意义(χ2=7.8,P=0.005)。其中有53例患者接受含卡培他滨、替吉奥胶囊或5-氟尿嘧啶基础的化疗方案,有1例患者因石蜡组织标本太少被剔除,化疗疗效达CR 1例,PR 20例,SD 18例,PD 13例,化疗总有效率(CR+PR)为40.38%(21/52),TS低表达组有效率为63.46%(16/27),TS高表达组有效率为36.54%(5/25),两者差异具有统计学意义(χ2=8.310,P=0.004)。其中有49例患者接受含多西他赛或紫杉醇为基础的化疗方案,有3例患者因组织标本太少被剔除,化疗疗效达CR 1例,PR 17例,SD 22例,PD 6例,化疗总有效率(CR+PR)为39.13%(18/46), TUBB3低表达组有效率为54.17%(13/24),TUBB3高表达组有效率为22.73%(5/22),两者差异具有统计学意义(χ2=4.736,P=0.029)。2、ERCC1低表达组患者的中位PFS和OS分别为6.0个月和12.9个月,ERCC1高表达组患者的中位PFS和OS分别为3.1个月和7.8个月,ERCC1低表达组较高表达组的PFS和OS均延长,差异有统计学意义(PFS:P=0.005, OS:P=0.002)。TS低表达组患者的中位PFS和OS分别为7.8个月和13.3个月,TS高表达组患者的中位PFS和OS分别为3.1个月和8.3个月,TS低表达组较高表达组的PFS和OS均延长,差异有统计学意义(PFS:P=0.007,OS:P=0.003)。 TUBB3低表达组患者的中位PFS和OS分别为5.9个月和11.6个月,TUBB3高表达组患者的中位PFS和OS分别为3.9个月和7.9个月,TUBB3低表达组较高表达组的PFS和OS均延长,差异有统计学意义(PFS:P=0.032,OS:P=0.001)。3、单因素及多因素分析得出,ERCC1、TS及TUBB3均为晚期胃癌的预后因素。第3章1、48例胃癌组织体外药敏的检测中,有3例标本在原代细胞培养过程中因细菌污染、操作等原因导致传代失败,余下45例标本进行有效的体外药物实验,并得到有效的实验数据,根据IC90和IC50大小来判断其体外药敏情况。根据判断标准得出,顺铂体外敏感(SS+IS)24例(53.33%),体外耐药(MS+R)21例(46.67%),5-氟尿嘧啶体外敏感(SS+IS)23例(51.11%),体外耐药(MS+R)22例(48.89%),紫杉醇体外敏感(SS+IS)21例(46.67%),体外耐药(MS+R)24例(53.33%),与临床药物疗效基本一致。2、45例胃癌组织中,ERCC1高表达为21例(46.67%),低表达24例(53.33%)。21例ERCC1高表达组敏感例数7例(33.33%),24例低表达组敏感例数17例(70.83%), ERCC1低表达者对顺铂的敏感有效率要明显高于ERCC1高表达者,且差异在统计学上有显着性意义(P<0.05)。TS高表达为19例(42.22%),低表达26例(57.78%)。19例TS高表达组敏感例数5例(26.32%),26例低表达组敏感例数18例(69.23%),TS高表达者对5-氟尿嘧啶的敏感有效率要明显低于低表达者,且差异在统计学上有显着性意义(P<0.01)。TUBB3高表达为22例(48.89%),低表达23例(51.11%)。22例TUBB3高表达组敏感例数5例(22.73%),23例低表达组敏感例数16例(69.57%),TUBB3高表达者对紫杉醇的敏感有效率要明显低于低表达者,且差异在统计学上有显着性意义(P<0.01)。四、结论1、ERCC1、TS和TUBB3在胃癌组织中均有不同程度表达,叁者与临床特征均无相关性,TS和TUBB3蛋白之间存在一定的相关性。2、晚期胃癌组织中ERCC1、TS和TUBB3的表达与化疗药物耐药及预后具有一定的相关性,低表达组的化疗疗效及生存预后好于高表达组。3、体外实验证实ERCC1、TS和TUBB3的表达与化疗药物耐药具有一定的相关性,低表达组的耐药发生率低于高表达组。4. ERCC1、TS和TUBB3有望成为判断胃癌患者化疗疗效及预后的分子标志物。
修琳琳[6]2017年在《含反药组合的海藻玉壶汤中海藻不同品种与甘草加减对甲状腺肿大大鼠生物效应影响及机制探讨》文中指出背景:海藻与甘草相反,属于"十八反"反药组合之一。"十八反"历来争议颇多,有遵从古训者,亦有勇越雷池者,其能否同用,一直是中医药学界的难题之一。"十八反"多为有毒中药与无毒中药的配伍,只有海藻甘草这一反药组合,均属于无毒中药,两个无毒中药配伍产生了"相反",是配伍使用后产生还是与复方中其他药物共同作用而引起了增毒或减效的作用,目前没有明确结论。2015版《中华人民共和国药典》记载海藻为马尾藻科植物海蒿子Sargassum pallidum(Turn.)C.Ag.或羊栖菜Sargassum fusiforme(Harv.)Setch.的干燥藻体。前者习称"大叶海藻",后者习称"小叶海藻"。关于不同品种海藻与甘草配伍后比较的研究不多,且主要集中在关于海蒿子和羊栖菜与甘草单独配伍的研究,关于两种不同品种的海藻与甘草配伍后对于反药组合药效或毒性的影响,目前没有结论。因此,本实验在课题组已完成的实验研究基础上,选择有临床应用基础的经典名方海藻玉壶汤,针对病理条件下,不同品种海藻与甘草加减配伍进行研究,从而挖掘基于临床应用的不同品种海藻与甘草配伍对甲状腺肿大模型大鼠的毒效作用及其内在机制,以期为完善中药配伍禁忌理论和指导临床"相反"药物配伍应用提供实验依据。目的:基于甲状腺肿大模型,探讨含不同品种海藻的海藻玉壶汤在海藻甘草加减配伍条件下的毒效作用,验证是否与方中的反药组合相关。通过下丘脑-垂体-甲状腺轴及甲状腺相关基因表达,探讨不同品种海藻与甘草加减配伍应用治疗甲状腺肿大的机制;通过CYP450相关基因及蛋白表达以及肾脏凋亡等相关指标探讨不同品种海藻对甲状肿大大鼠肝肾功能影响的机制。方法:1.急性毒性实验:比较海蒿子、羊栖菜,二者与生甘草配伍使用,及其在海藻玉壶汤中加减配伍对小鼠急性毒性的影响,以评价单味药、二者分别与甘草配伍以及含不同品种海藻的海藻玉壶汤的急性毒性。2.生物效应:在前期实验研究中,我们已经探讨了含不同品种海藻的海藻玉壶汤在海藻甘草接近临床剂量的条件下的毒-效关系。海藻甘草剂量为《药典》高限剂量的两倍时对甲状腺肿大的治疗效果明显,因此选择该剂量进行本实验研究,去掉海藻玉壶汤反药组合中的一味或两味,观察其对模型大鼠的药效影响及毒理作用。将大鼠随机分为空白组、模型组、阳性药(左甲状腺素钠片)组、海藻玉壶汤海蒿子配生甘草组(以下简称全方海组)、海藻玉壶汤羊栖菜配生甘草组(以下简称全方羊组)、海藻玉壶汤海蒿子去甘草组(以下简称海去草组)、海藻玉壶汤羊栖菜去甘草组(以下简称羊去草组)、海藻玉壶汤去海藻组(以下简称去海藻组)、海藻玉壶汤去海藻甘草组(以下简称去藻草组)。检测甲状腺功能相关指标、血液生化相关指标及心肝肾病理组织形态方面的变化,观察其毒效作用,验证其生物效应是否与方中的反药组合相关。3.机制研究:检测"效"的机制相关指标:检测血清中甲状腺激素代谢相关指标水平,包括:促甲状腺激素释放激素、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、蛋白水解酶、促甲状腺激素;甲状腺激素受体水平:促甲状腺激素受体、促甲状腺激素受体抗体;RT-PCR法检测甲状腺中Tg及TPO基因表达。肝肾影响的机制相关研究:肝脏代谢:肝组织CYP450基因及蛋白表达。肾脏相关机制:尿乳酸脱氢酶、尿表皮生长因子、尿β2-微球蛋白;TUNEL法检测肾组织凋亡细胞。结果:1.急性毒性实验结果:各组别药物对小鼠急性毒性依次表现为:海蒿子组>海蒿子生甘草组>海去草组>全方海组>去藻草组>羊去草组;其余各组未表现出毒性。海蒿子与羊栖菜在单用、与生甘草配伍应用以及在海藻玉壶汤复方中加减配伍应用的急性毒性实验中,均表现出明显的差异,单用及各配伍组合中,海蒿子毒性高于羊栖菜。2.含反药组合的海藻玉壶汤中海藻不同品种与甘草加减应用对甲状腺肿大大鼠生物效应的影响(1)药效作用:与空白组相比,模型组大鼠体重明显减轻,体温下降,甲状腺系数升高,血清T4、FT4水平降低和TSH、TRH升高,病理切片显示甲状腺组织小叶排列紊乱,甲状腺滤泡内分泌物明显减少,滤泡上皮细胞弥漫性增生和肥大,提示甲状腺肿大模型建立成功。阳性药明显改善甲肿大鼠的体重减轻、回调血清甲状腺激素水平,但在调节升高的血清TRH、TSI水平方面,即对下丘脑-垂体-甲状腺轴的影响未见明显作用。全方海组、全方羊组在回调甲肿大鼠体温、甲状腺系数及组织形态学改善方面,效果明显优于阳性药及拆方各组,且对回调升高的TSH、TSHR有明显效果,与下丘脑-垂体-甲状腺轴的作用有关。(2)毒性表征1)肝脏:根据肝脏系数、肝脏内酶水平、肝脏合成功能以及肝脏组织形态学的变化,评价不同品种海藻与生甘草反药组合加减配伍应用对甲状腺肿大模型大鼠肝功能的影响。结果显示,丙硫氧嘧啶所致甲状腺肿大大鼠显示出了一定程度的肝损伤,在这一病理状态下,海藻玉壶汤中不同品种海藻与甘草配伍加减各组,对相应的指标有回调作用;海藻甘草反药组合在海藻玉壶汤中应用,对甲状腺肿大模型大鼠的肝损伤有恢复作用,优于相应的去海藻或甘草组;其中,全方海组、海去草组表现出明显的恢复作用。而全方羊组表现出了影响肝脏中白蛋白的合成的结果。海蒿子与羊栖菜分别于复方海藻玉壶汤中配伍,二者显示出了对肝功能影响的差异。2)肾脏:根据肾脏系数、肾功能相关指标、血尿电解质以及肾脏组织形态学的变化,评价不同品种海藻与生甘草反药组合加减配伍应用对甲状腺肿大模型大鼠肾功能的影响。结果显示,丙硫氧嘧啶所致甲状腺肿大大鼠表现出了一定程度的肾损伤,血清电解质水平受到影响,在这一病理状态下,全方海组、海去草组对相应的指标有明显的恢复作用。而全方羊组对肾功能表现出一定的影响。3)心脏:根据心脏系数、肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平以及心脏组织形态学的变化,评价不同品种海藻与生甘草反药组合加减配伍应用对甲状腺肿大模型大鼠心功能的影响。结果显示,模型组大鼠未见明显心功能损伤。海藻甘草反药组合于复方中应用,与去藻草组相比,对于心肌酶的调节显示出了一定的作用。4)血液系统:根据全血细胞分析,评价不同品种海藻与生甘草反药组合加减配伍应用对甲状腺肿大模型大鼠血液系统的影响。结果显示,丙硫氧嘧啶所致甲状腺肿大大鼠,红细胞系统受到抑制,血小板水平明显升高,嗜酸性粒细胞百分比降低。在这一病理状态下,全方海组、全方羊组对甲状腺肿大大鼠的红细胞系统有一定的恢复作用,且能调节升高的血小板和降低的嗜酸性粒细胞百分比,优于相应的各拆方组合,二者之间未见明显差异。5)脂质过氧化:结果显示,丙硫氧嘧啶所致甲状腺肿大大鼠氧化和抗氧化作用未见失衡。海藻甘草反药组合于复方中应用,会引起大鼠自由基水平下降,同时自由基清除也减少,因此对于甲状腺肿大大鼠氧化和抗氧化能力无明显影响。3.机制探讨(1)药效机制探讨:模型组大鼠甲状腺组织TPO、TgmRNA表达明显增强。全方海组、全方羊组能抑制TPO基因表达的增强。(2)肝脏影响机制探讨:模型组大鼠肝脏CYP2E1/3A1/3A2mRNA表达增强,海藻玉壶汤中不同品种海藻与甘草配伍加减各组,对相应的指标有回调作用;海藻甘草反药组合在海藻玉壶汤中加减应用,对甲状腺肿大模型大鼠的肝损伤有恢复作用;其中,全方海组、海去草组显示出明显的恢复作用。推测可能与海藻玉壶汤(海蒿子/羊栖菜)对增强的基因表达有回调作用有关,可以抑制肝脏内的前毒物,抑制药物吸收,发挥保护肝功能的作用。而全方羊组表现出了影响肝脏中白蛋白的合成的结果。海蒿子与羊栖菜分别于复方海藻玉壶汤中配伍,二者显示出了对肝功能影响的差异。而海藻玉壶汤(海蒿子/羊栖菜)对CYP2E1蛋白表达未见明显影响。(3)肾脏影响机制探讨:模型组大鼠出现肾小管损害及细胞凋亡,但重吸收功能未见影响。在这一病理状态下,全方海组、全方羊组、海去草组对肾小管损害有保护作用,其效果优于各拆方组,但对肾组织细胞凋亡无明显影响。结论:1.海藻甘草反药组合在海藻玉壶汤中应用,对甲状腺肿大的恢复作用及回调甲状腺激素水平的效果优于各拆方组,与下丘脑-垂体-甲状腺轴的调节作用有关。不同品种的海藻与甘草配伍,未显示出明显差异。2.海藻甘草反药组合在复方中加减应用,对甲状腺肿大模型大鼠的肝肾损伤有恢复作用,且能恢复受抑制的红细胞系统;其中,全方海组、海去草组显示出较明显的恢复作用。而全方羊组表现出了影响肝脏中白蛋白的合成、影响肾功能相关指标的结果。不同品种海藻与甘草配伍,分别于海藻玉壶汤中应用,二者显示出了对肝肾功能影响的差异。3.全方海组对CYP2E1/3A1/3A2基因表达的增强有回调作用,可以抑制肝脏内的前毒物,抑制药物吸收,发挥保护肝功能的作用。全方海组、全方羊组、海去草组对肾小管损害有保护作用,其效果优于各拆方组,但对肾组织细胞凋亡无明显影响。
武振中[7]2008年在《不同强度运动对大鼠骨骼肌脂联素受体mRNA表达的影响》文中研究指明脂肪组织是一个活跃的内分泌器官,分泌多种重要蛋白,这些蛋白被称为脂肪因子。其中脂联素是一个重要的脂肪因子,在糖代谢、脂代谢中均起着重要的作用,脂联素的低水平与一些疾病(如糖尿病、心血管疾病等)有密切联系。研究发现,脂联素不仅参与糖和脂肪的代谢调节,还具有增加胰岛素的敏感性和抗动脉粥样硬化作用,是近年来众多脂肪因子中研究的热点。脂联素受体有两个亚型,AdipoR1和AdipoR2,在骨骼肌丰富表达,脂联素与AdipoR结合后可通过一系列的信号转导,从而调节糖脂代谢。本文研究不同强度的运动对大鼠骨骼肌脂联素受体mRNA表达的影响。研究运动对脂联素受体的作用,可以更好地理解脂联素的作用和肥胖相关疾病,如糖尿病和动脉粥样硬化,可以以AdipoR1,AdipoR2作为靶点来设计新的抗糖尿病和抗动脉粥样硬化的药物;以及运动对糖尿病等疾病的良性影响的作用机理,为运动处方的设计提供一定的参考。本研究选用2月龄雄性SD大鼠24只,体重226.4±31.0g。随机将大鼠分为安静组(C组,n=8);中等强度运动组(EX1组,n=8);过度运动组(EX2组,n=8),运动方式为游泳训练,运动组分别进行不同强度的游泳训练,每周5天,训练8周。训练结束后叁组大鼠断头处死,取腓肠肌及血清,检测骨骼肌中AdipoR1、AdipoR2、PPAR-α、GLUT4的mRNA表达以及血清中血糖、胰岛素、甘油叁酯、游离脂肪酸、总胆固醇的含量。实验结果如下:(1)8周中等强度和大强度的游泳训练促进了健康大鼠的糖代谢,并提高了大鼠骨骼肌GLUT4的mRNA表达,但并没有显着性提高健康大鼠的胰岛素敏感性指数。(2)8周中等强度的游泳训练促进了大鼠的脂代谢,并显着提高了大鼠骨骼肌的AdipoR1、GLUT4以及PPAR-αmRNA的表达,但对AdipoR2 mRNA的表达没有产生显着性影响。结论:中等强度的游泳训练使大鼠的AdipoR1、PPAR-αmRNA表达显着上升,而中等以及大强度的游泳训练均对健康大鼠的AdipoR2表达没有产生显着性影响,表明AdipoR1可以通过PPAR-α通路对大鼠的脂代谢产生影响。此外,本实验中GLUT4mRNA以及糖代谢显着性增加,但胰岛素敏感无显着性变化,说明脂联素对健康大鼠的糖代谢调节并不依赖于胰岛素这一通路。与此同时,在以肥胖大鼠为研究对象的实验中,AdipoR2的mRNA表达是受运动调节的,而运动对健康大鼠的AdipoR2表达则没有这种效用,两者之间差别的原因和机制还有待于进一步的研究。这些问题的提出,或许会有助于我们今后更深入的研究。
赵敬[8]2014年在《糖肾平对DKD大鼠肾脏保护作用及TGF-β_1-Smad2/3-ILK信号转导通路影响的研究》文中提出糖尿病肾病(diabetic kidney disease.DKD)是糖尿病(diabetes mellitus.DM)严重和常见的微血管并发症之一,其发病率逐年上升,严重影响了患者的生活质量。DKD的基本病理改变包括肾小球肥大、细胞外基质沉积、肾小球硬化和肾间质纤维化,但其病因非常复杂,发病机理至今尚未完全明确。近几年,上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transtion,EMT)被认为是导致肾脏纤维化发生的重要机制之一,转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)是致纤维化的关键因子,可以通过多条信号转导通路参与转分化。研究表明,DKD时高血糖、氧化应激、糖基化终末产物、血管紧张素Ⅱ等因素导致TGF-β/Smad信号转导通路激活,介导了细胞外基质产生与降解失衡、系膜细胞增生、肾小管上皮细胞转分化、足细胞损伤等病理改变,加速了肾脏纤维化进程。整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)是TGF-β/Smad信号转导通路中一个重要的下游因子,在TGF-β介导的EMT中发挥重要作用。TGF-β1通过Smad2／3增加ILK的表达,后者可增加纤维连接蛋白、基质金属蛋白酶-2及-9的表达,促进细胞外基质沉积,破坏基底膜的完整性,进而导致EMT的发生。最近研究表明,作为肾小球滤过屏障重要组成部分的足细胞在高糖、氧化应激等因素刺激下可以发生表型改变、转分化,进而破坏肾小球滤过屏障的完整性,导致蛋白尿的发生,加速肾脏纤维化进程。足细胞EMT为足细胞与蛋白尿的关系提供了一种新的解释,成为蛋白尿形成和肾脏纤维化机制研究中重要的切入点。导师赵宗江教授将传统医学与现代医学相结合,提出了DKD“肾痿”假说,并以“肾痿”假说为指导,结合临床经验组方了糖肾平胶囊(以下简称糖肾平),用于治疗DKD取得了较好的临床疗效。导师课题组前期研究发现,糖肾平可降低DKD大鼠肾组织MCP.1.CTGF蛋白及mRNA的表达,并可通过抑制TGF-β1/Smad7.NF-KB及TGF-β1/p38MAPK信号转导通路减少足细胞损伤、凋亡,减轻肾脏病理损害,保护DKD大鼠肾功能。本研究以足细胞EMT为切入点,采用免疫组化、原位杂交、Western blot及RT-PCR方法,探讨糖肾平干预DKD TGF-β1-Smad2/3-ILK信号转导通路的作用机制为DKD“肾痿”假说的研究提供实验依据。目的：动物实验：采用一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导DKD大鼠,以厄贝沙坦为实验对照药物,观察糖肾平对DKD大鼠的药效学和氧化应激水平的影响,并采用免疫组化、原位杂交和RT-PCR方法观察糖肾平对DKD大鼠肾组织中TGF-β1, Smad2/3, ILK. CD2AP, α-SMA蛋白及mRNA表达的影响。细胞实验：采用Vestern blot及RT-PCR方法观察高糖+LPS对足细胞表型的影响,以及糖肾平对足细胞TGF-β1, Smad2/3. ILK, CD2AP, α-SMA蛋白及mRNA表达的影响。方法：1糖肾平对STZ诱导DKD大鼠药效学的影响：清洁级Wistar大鼠74只按体质量随机分为正常组10只,造模组64只,造模组采用一次性腹腔注射STZ (45mg/kg)建立糖尿病大鼠模型。造模成功后按体质量随机分为模型组、厄贝沙坦组、糖肾平小剂量组、糖肾平大剂量组,并进行灌胃治疗。观察大鼠一般状态、体质量,检测24h尿蛋白定量。14周时,股动脉取血检测血清中尿素氮(blood urea nitrogen, BUN),肌酐(serum creatinine, Scr)、甘油叁酯(triglyeride, TG)含量；摘取大鼠肾脏,称取大鼠肾质量；肾组织石蜡切片进行普通HE染色、Mallory, Masson, PASM-HE染色观察肾组织病理形态变化,透射电镜观察肾小球血管基底膜及足突等超微结构的变化。2ELISA法：检测血清中一氧化氮(nitric oxide, NO)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)水平。3免疫组化：检测大鼠肾组织中TGF-β1Smad2/3, ILK, CD2AP, a-SMA蛋白表达4原位杂交：检测大鼠肾组织中TGF-β1, Smad2/3, CD2APmRNA表达。5RT-PCR:检测大鼠肾组织中TGF-β1, Smad2/3, ILK, CD2AP, α-SMAmRNA表达。6体外细胞培养实验：体外培养大鼠肾小球足细胞,以高糖(25mmol/L),脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(1μg/mL)刺激足细胞建立细胞模型,并用糖肾平含药血清干预足细胞36h,观察足细胞表型变化,采用Western blot及RT-PCR方法检测足细胞TGF-β1. Smad2/3, ILK, CD2AP,α-SMA蛋白及mRNA的表达情况。7实验数据用SPSS17.0进行统计学处理。结果：1糖肾平对STZ诱导DKD大鼠药效学的影响经过糖肾平治疗后,大鼠一般状态良好；与模型组比较,糖肾平大、小剂量组大鼠体质量均有不同程度增长(P<0.01),肾质量体质量比值显着降低(P<0.01),24h尿蛋白定量显着减少(P<0.01),血清BUN、TG含量显着降低(P<0.01),Scr含量降低(P<0.05),肾小球硬化指数和肾间质损伤指数显着降低(P<0.01),糖肾平小剂量组肾小球基底膜轻度增厚、足突轻度融合糖肾平大剂量组肾小球基底膜、足突基本正常,肾脏病理改变明显减轻。2糖肾平对STZ诱导DKD大鼠氧化应激的影响与模型组比较,糖肾平大、小剂量组NO、SOD含量显着升高(P<0.01),MDA含量显着降低(P<0.01)。3糖肾平对DKD大鼠肾组织TGF-β1、Smad2/3、ILK、CD2AP、α-SMA蛋白表达的影响免疫组化显示：正常组大鼠肾脏固有细胞有少量TGF-β1、Smad2/3、ILK、 α-SMA蛋白表达,明显低于模型组(P<0.01)；与模型组比较,治疗组大鼠肾脏固有细胞TGF-β1、ILK蛋白表达降低,有统计学差异(P<0.05),Smad2/3、α-SMA蛋白表达明显降低,有显着统计学差异(P<0.01),且糖肾平大剂量组疗效最佳。正常组大鼠肾小球足细胞有大量CD2AP蛋白表达,明显高于模型组(P<0.01)；与模型组比较,厄贝沙坦组、糖肾平大剂量组肾小球足细胞CD2AP蛋白表达升高,有统计学差异(P<0.05)。糖肾平小剂量组肾小球足细胞CD2AP蛋白表达高于模型组。4糖肾平对DKD大鼠肾组织TGF-β1、Smad2/3、ILK、CD2AP、α-SMAmRNA表达的影响4.1原位杂交：正常组大鼠肾脏固有细胞有少量TGF-β1、Smad2/3mRNA表达,明显低于模型组(P<0.01)；与模型组比较,糖肾平大剂量组肾脏固有细胞TGF-β1、Smad2/3mRNA表达明显降低,有显着统计学差异(P<0.01),糖肾平小剂量组肾脏固有细胞TGF-β1、Smad2/3mRNA表达有所降低。正常组大鼠肾小球足细胞有大量CD2APmRNA表达,明显高于模型组(P<0.01)；与模型组比较,治疗组肾小球足细胞CD2APmRNA表达明显升高,有显着统计学差异(P<0.01),且糖肾平大剂量组疗效最佳。4.2RT-PCR:模型组大鼠肾组织TGF-β1、Smad2/3、ILK、 α-SMAmRNA表达明显高于正常组,有显着统计学差异(P<0.01)；与模型组比较,糖肾平大剂量组大鼠肾组织TGF-β1、Smad2/3、ILK、α-SMAmRNA表达明显降低,有显着统计学差异(P<0.01),糖肾平小剂量组大鼠肾组织Smad2/3、ILK、 α-SMAmRNA表达明显降低,有显着统计学差异(P<0.01),且糖肾平大剂量组疗效优于糖肾平小剂量组。正常组大鼠肾组织CD2APmRNA表达明显高于模型组,有显着统计学差异(P<0.01)；与模型组比较,治疗组CD2APmRNA表达明显升高(P<0.01)。5足细胞表型变化正常足细胞呈分叉状,形态不规则,突起较长、较细、较多,有些突起末梢还会分出树枝状的分叉。高糖和高糖+LPS作用后,贴壁细胞大量失去突起,胞体变大。糖肾平干预组足细胞形态均有所改善,突起增多,胞体变小,糖肾平大剂量组最为明显。6糖肾平对足细胞TGF-β1.Smad2/3.ILK.CD2AP.α-SMA蛋白及mRNA表达的影响6.1Western blot:正常组足细胞高表达CD2AP蛋白,少量表达TGF-β1. P-Smad2/3.ILK.α-SMA蛋白。与正常组比较,高糖组和高糖+LPS组足细胞CD2AP蛋白表达明显降低,TGF-β1.P-Smad2/3.ILK.α-SMA蛋白表达明显升高,有显着统计学差异(P<0.01)。与高糖+LPS组比较,糖肾平大、中、小各剂量组足细胞TGF-β1.P-Smad2/3.α-SMA蛋白表达明显降低(P<0.01),CD2AP蛋白表达明显升高(P<0.01)。6.2RT-PCR:与正常组比较,高糖组和高糖+LPS组足细胞CD2APmRNA表达明显降低,TGF-β1.Smad2/3.ILK.α-SMAmRNA表达明显升高,有显着统计学差异(P<0.01)。与高糖+LPS组比较,糖肾平大、中、小各剂量组足细胞TGF-β1. Smad2/3. ILK. α-SMAmRNA表达明显降低(P<0.01),CD2APmRNA表达明显升高(P<0.01)。结论：1糖肾平可以改善DKD大鼠的一般状态,增加DKD大鼠体质量,降低肾质量体质量比值、24h尿蛋白定量,明显减轻DKD大鼠肾脏病理损害,对DKD大鼠肾脏有一定的保护作用。糖肾平大剂量组疗效明显优于小剂量组。2糖肾平能够降低DKD大鼠血清MDA含量,升高NO.SOD含量,改善DKD大鼠氧化应激状态,起到保护肾功能的作用。3糖肾平能够下调肾组织和足细胞TGF-β1.Smad2/3.ILK.α-SMA蛋白及]mRNA的表达,上调CD2AP蛋白及mRNA的表达,从而逆转足细胞转分化。综上所述,糖肾平通过TGF-β1-Smad2/3-ILK信号转导通路,干预足细胞转分化,维持足细胞形态功能的稳定性,从而保障肾小球滤过屏障的功能,减轻“肾痿”时的肾小球硬化和肾间质纤维化,保护DKD肾功能,延缓其病程进展。
刘忠慧[9]2008年在《铅对神经细胞信号传导通路中蛋白激酶C及钙调蛋白表达影响的研究》文中提出目的研究铅对仔鼠海马、人神经胶质瘤细胞U251中的蛋白激酶C(PKC)、钙调蛋白(CaM)的mRNA和蛋白表达的影响,以进一步探讨铅神经毒作用的分子机制,为铅中毒的防治工作提供理论依据。材料和方法1铅对仔鼠的学习记忆能力及相关指标的影响将孕鼠随机分为去离子水对照组、0.2%醋酸铅(Pb(Ac)_2)和1%Pb(Ac)_2组,从怀孕第0d起开始通过自由饮水染毒。幼鼠出生后,先通过哺乳接触铅,断乳后则自行饮用与其母鼠浓度相同的含铅水。出生后(postnatal,PN)8d内行悬崖回避实验,PN 50d行跳台实验,随后处死仔鼠,原子吸收光谱法测定脑铅含量,乙酰胆碱酯酯酶试剂盒测定乙酰胆碱酯酶活力,RT-PCR法和Western-blotting法观察各组仔鼠海马PKC、CaM的mRNA和蛋白表达情况。2铅对人神经胶质细胞瘤细胞U251细胞PKC、CaM表达的影响将U251细胞分为5×10~(-8)、5×10~(-6)、5×10~(-4)mol/L Pb(Ac)_2染毒组和生理盐水对照组,接种密度为5.5×10~5个/ml,75cm~2细胞培养瓶每瓶接种5ml,培养24h贴壁后染毒,染毒24h。MTT实验观察铅对U251细胞存活率的影响,免疫细胞化学观察PKC和CaM在细胞中的定性表达,RT-PCR和Western blot方法检测各组细胞中PKC和CaM的mRNA和蛋白表达水平。结果1铅对仔鼠的学习记忆能力及相关指标的影响(1)染铅组仔鼠的体重、身长均低于对照组(P＜0.01),且呈剂量反应关系。(2)染铅组PN 8d和PN 50d的仔鼠脑铅含量均高于对照组(P＜0.01),呈剂量反应关系;同剂量组PN 50d与PN 8d的仔鼠相比,脑铅含量明显增加(P＜0.01)。(3)染铅组平面翻正反射完成率均低于对照组(P＜0.01),1%Pb(Ac)_2组平面翻正反射完成率低于0.2%Pb(Ac)_2组(P＜0.01)。(4)染铅组悬崖回避完成率均低于对照组(P＜0.01)。1%Pb(Ac)_2组悬崖回避完成率低于0.2%Pb(Ac)_2组(P＜0.01)。(5)铅可显着降低仔鼠的学习记忆能力,染铅组仔鼠跳台实验反应时间延长、潜伏期变短、错误次数显着高于对照组(P＜0.05,P＜0.01),且呈剂量反应关系。(6)PN 8d 1%Pb(Ac)_2组仔鼠海马的胆碱酯酶活力低于对照组(P＜0.01);PN 50d的0.2%、1%Pb(Ac)_2组仔鼠海马的胆碱酯酶活力均低于对照组(P＜0.05,P＜0.01),且呈剂量反应关系。(7)PN 8d和PN-50d的1%Pb(Ac)_2组仔鼠海马的PKC mRNA相对表达量均低于对照组(P＜0.05,P＜0.01),0.2%Pb(Ac)_2组仔鼠海马的PKC mRNA相对表达量与对照组比较差异均没有统计学意义(P＞0.05)。PN 50d与PN 8d相比,1%Pb(Ac)_2组PKC mRNA表达有下降趋势,但差异没有统计学意义(P＞0.05)。(8)PN 8d和PN 50d的0.2%、1%Pb(Ac)_2组仔鼠海马PKC蛋白相对表达量与对照组比较表达均降低(P＜0.01),且呈剂量反应关系。PN 50d与PN 8d相比,1%Pb(Ac)_2组PKC蛋白表达有下降趋势,但差异没有统计学意义(P＞0.05)。(9)PN 8d的1%Pb(Ac)_2组仔鼠海马CaM mRNA相对表达量低于对照组(P＜0.05),但0.2%Pb(Ac)_2组与对照组比较差异没有统计学意义(P＞0.05);PN 50d的0.2%和1%Pb(Ac)_2组仔鼠海马CaM mRNA表达均低于对照组(P＜0.05,P＜0.01),且呈剂量反应关系。PN 50d与PN 8d相比,1%Pb(Ac)_2组CaM mRNA表达有下降趋势,但差异没有统计学意义(P＞0.05)。(10)PN 8d 1%Pb(Ac)_2组仔鼠海马CaM蛋白相对表达量与对照组比较表达降低(P＜0.01),而0.2%Pb(Ac)_2组与对照组比较差异没有统计学意义(P＞0.05);PN 50d的0.2%、1%Pb(Ac)_2组仔鼠海马CaM蛋白相对表达量与对照组比较均降低(P＜0.05,P＜0.01),呈剂量反应关系。PN 50d与PN 8d相比,0.2%、1%Pb(Ac)_2组CaM蛋白表达均有下降趋势,但差异没有统计学意义(P＞0.05)。2铅对U251细胞中PKC、CaM表达的影响(1)5×10~(-6)、5×10~(-5)和5×10~(-4)mol/L Pb(Ac)_2组的细胞存活率与对照组相比均降低(P＜0.01),且随剂量的增加存活率下降。(2)细胞免疫化学结果显示,PKC、CaM在U251细胞的胞质中均有表达。且随剂量的增加,阳性表达细胞率均下降。(3)5×10~(-4)mol/L Pb(Ac)_2组PKC mRNA相对表达量低于对照组(P＜0.05);而5×10~(-8)、5×10~(-6)Pb(Ac)_2组PKC mRNA相对表达量与对照组比较没有减少(P＞0.05)。5×10~(-8)、5×10~(-6)、5×10~(-4)mol/L Pb(Ac)_2组PKC蛋白相对表达量均低于对照组(P＜0.01),且随剂量的增加蛋白表达降低。(4)5×10~(-8)、5×10~(-6)、5×10~(-4)Pb(Ac)_2组的CaM mRNA和蛋白相对表达量均低于对照组(P＜0.01),且呈剂量反应关系。结论1通过孕期和哺乳期对母鼠染毒,铅可以在仔鼠的脑部蓄积;使仔鼠的学习记忆能力下降;降低胆碱酯酶的活力;使不同发育时期的仔鼠海马部位的PKC、CaM的mRNA和蛋白表达均降低,可能是铅影响仔鼠学习记忆能力的机制之一。2铅可以影响U251细胞的生长,使细胞存活率下降;使U251细胞中的PKC、CaM的mRNA和蛋白表达均降低,可能是铅对人体的神经毒性的机制之一。综上,动物实验与细胞学实验的结果一致。提示铅对信号传导通路中PKC、CaM的影响可能是其神经毒性的机制之一。
刘頔[10]2016年在《ERK信号通路在高糖诱导的髓鞘化损伤中的作用及槲皮素、桂皮醛、水蛭素和单体组合对其影响的研究》文中进行了进一步梳理[研究目的]从细胞及分子水平,探讨ERK信号通路在高糖诱导周围神经系统髓鞘损伤中的作用以及槲皮素、桂皮醛、水蛭素及单体组合的干预作用。[研究方法]1.采用改良消化复合植块法培养雪旺细胞(Schwann cells, SCs), S-100免疫荧光染色法鉴定细胞纯度,并比较改良消化复合植块法与经典植块法、普通消化复合植块法获取SCs数量和纯度。2.分别采用CCK-8法和Hoechst染色法检测50 mmol/L (mM)、75 mM、100 mM、125 mM、150 mM高糖培养24h、48h、72h、96h对SCs增殖和凋亡的影响。通过Western Blot和实时荧光定量PCR法分别检测50 mM高糖培养24h、 48h、72h、96h对SCs P0、p-ERK、ERK蛋白表达和P0、Krox-20、MAG mRNA表达的影响。3.槲皮素(Q,高中低浓度)、水蛭素(H)、桂皮醛(C)、槲皮素+水蛭素组合(QH)、槲皮素+桂皮醛组合(QC)、水蛭素+桂皮醛组合(HC)、槲皮素+水蛭素+桂皮醛组合(QHC)和10μM ERK通路抑制剂U0126分别干预50 mM高糖培养的SCs72h, CCK-8法检测增殖率,免疫荧光染色法检测periaxin表达,Western Blot检测P0、p-ERK、ERK、p-c-Jun、c-Jun、NICD的蛋白表达,实时荧光定量PCR法检测P0、Krox-20、MAG、Notch1、Jagged1 mRNA表达,ELISA法检测CNTF的分泌水平。4.采用混合酶分步消化法培养背根神经节神经元(dorsal root ganglion neuron, DRGn), MAP-2免疫荧光染色鉴定DRGn纯度。将纯化后的SCs接种在DRGn上,建立共培养体系。采用MBP免疫荧光染色检测髓鞘形成。通过Western Blot和实时荧光定量PCR法分别检测50 mM高糖培养DRGn/SCs共培养体系3d、5d、7d对MBP、MAG、p-ERK、ERK蛋白表达和MBP、MAG mRNA表达的影响。5.Q(高中低浓度)、H、C、QH、QC、HC、QHC和U0126分别干预50 mM高糖培养的DRGn/SCs共培养体系7d, MBP免疫荧光染色检测髓鞘节段的数目和长度,MAG与p-ERK免疫荧光双染检测共培养体系中SCs p-ERK的表达,Western Blot检测p-ERK、ERK、MBP和MAG蛋白表达,实时荧光定量PCR法检测MBP和MAG mRNA表达。[研究结果]一、改良消化复合植块法可提高获取SCs的数量和纯度改良消化复合植块法获取的细胞数量和纯度均较普通消化复合植块法和经典植块法显着提高(P<0.01)。二、不同高糖培养条件对SCs的损伤作用72h时,与CON组比较,50mM-150mM HG组细胞增殖率均明显降低,细胞凋亡率均显着增加(p<0.01),SCs的增殖率与葡萄糖浓度呈负相关(P<0.01),凋亡率与葡萄糖浓度呈正相关(P<0.01)。72h时,与CON组比较,50mM HG PO蛋白表达及P0、Krox-20和MAG mRNA均显着降低(P<0.01), ERK蛋白磷酸化水平显着升高(P<0.01)。叁、槲皮素可抑制高糖条件下ERK通路介导的SCs成髓鞘损伤1.槲皮素可缓解高糖对SCs增殖和分化及CNTF分泌的抑制与CON组相比,HG组细胞增殖率、periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平均显着降低(P<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组均显着升高(P<0.01); SCs增殖率、periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平均与槲皮素的剂量呈正相关(P<0.01)。2.槲皮素可抑制高糖条件下SCs的髓鞘蛋白和mRNA表达的下调与CON组相比,HG组P0蛋白和P0、Krox-20、MAGmRNA表达均显着降低(P<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组SCs的P0蛋白和P0、Krox-20、 MAG mRNA表达均显着升高(P<0.01)；P0蛋白和P0、Krox-20、MAGmRNA表达均与槲皮素的剂量呈正相关(P<0.01或P<0.05)。3.槲皮素可抑制高糖条件下SCs ERK通路的激活和其下游髓鞘负性调控因子c-Jun和Notch通路的活化与CON组相比,HG组SCs的ERK蛋白磷酸化水平、c-Jun磷酸化水平、NICD蛋白表达以及Notch1和Jagged1 mRNA表达均显着升高(P<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组均显着降低(P<0.01); ERK蛋白磷酸化水平、c-Jun磷酸化水平、NICD蛋白表达以及Notch1和Jagged1 mRNA表达均与槲皮素的剂量呈负相关(P<0.01)。四、槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下ERK通路介导的SCs成髓鞘损伤1.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可缓解高糖对SCs增殖和分化及CNTF分泌的抑制与HG组相比,各干预组的细胞增殖率、periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平均升高,差异显着(P<0.01)；与QHC组相比,QH、QC、HC组及Q3、H3、C3组均显着降低(P<0.01)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3组和H3组periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平明显降低(P<0.05或P<0.01),与QC组相比,Q3和C3组CNTF分泌水平均显着降低(P<0.01),C3组periaxin阳性细胞比例显着降低(p<0.01),与HC组相比,H3组和C3组periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平均显着降低(p<0.01)；单体组间比较,与Q3组相比,H3和C3组periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平显着降低(P<0.01)。2.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下SCs的髓鞘蛋白和mRNA表达的下调与HG组相比,各药物干预组P0蛋白和P0、Krox-20、MAG mRNA表达均升高,差异显着(P<0.01)；与QHC组相比,QH、QC、HC组及Q3、H3、C3组均降低,差异有统计学意义(p<0.05或P<0.01)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3组和H3组明显降低(P<0.05或P<0.01),与QC组相比,C3组显着降低(P<0.01),与HC组相比,H3组和C3组均显着降低(P<0.01)；单体组间比较,与Q3组相比,H3和C3组显着降低(p<0.01)。3.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下SCs ERK通路的激活和其下游髓鞘负性调控因子c-Jun和Notch通路的活化与HG组相比,各药物干预组ERK磷酸化水平、c-Jun磷酸化水平、NICD蛋白表达以及Notch1和Jagged1 mRNA表达均降低,差异显着(p<0.01)；与QHC组相比,QC、QH、HC组及Q3、H3、C3组均升高,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3组和H3组c-Jun磷酸化水平、NICD蛋白表达以及Notch1和Jagged1 mRNA表达均明显升高(P<0.01或P<0.05),H3组ERK磷酸化水平显着升高(P<0.01),与QC组相比,Q3组和C3组c-Jun磷酸化水平以及Notch1和Jagged1 mRNA表达明显升高(P<0.01或P<0.05),H3组ERK磷酸化水平显着升高(p<0.01),与HC组相比,H3组和C3组ERK磷酸化水平、c-Jun磷酸化水平以及Notch1和Jagged1 mRNA表达明显升高(P<0.01或P<0.05),；单体组间比较,与Q3组相比,H3组和C3组ERK磷酸化水平、c-Jun磷酸化水平以及Notch1和Jagged mRNA均明显升高,差异有统计学意义(p<0.01或P<0.05)。五、DRGn/SCs体外共培养可建立周围神经髓鞘化模型MAP-2免疫荧光染色鉴定,DRGn细胞纯度达97.39±0.09%,MBP免疫荧光染色显示DRGn/SCs共培养体系可在体外形成髓鞘节段。六、高糖不同时间点对DRGn/SCs共培养体系的影响7d时,与CON组相比,50mM HG组MBP和MAG蛋白及mRNA表达显着下降,ERK磷酸化水平显着增强(p<0.01)。七、槲皮素可抑制高糖条件下DRGn/SCs共培养体系中ERK通路介导的髓鞘化损伤1.槲皮素可抑制高糖条件下共培养体系髓鞘节段数目和长度的下降与CON组相比,HG组的髓鞘节段数目和长度显着减少(p<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组均显着增加(P<0.01)；髓鞘节段数目和长度与槲皮素的剂量呈正相关(P<0.01)。2.槲皮素可抑制高糖条件下共培养体系的髓鞘蛋白和]mRNA表达的下调与CON组相比,HG组MBP和MAG蛋白及nRNA表达均显着降低(p<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组均显着升高(P<0.01); MBP和MAG蛋白及mRNA表达与槲皮素的剂量均呈正相关(P<0.01)。3.槲皮素可抑制高糖条件下共培养体系ERK通路的激活MAG与p-ERK免疫荧光双染检测结果显示,p-ERK与MAG染色阳性的位置基本重合。与CON组相比,HG组的ERK蛋白磷酸化水平和p-ERK表达显着升高(P<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组均显着降低(P<0.01); ERK蛋白磷酸化水平p-ERK表达与槲皮素的剂量负相关(P<0.01)。八、槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下DRGn/SCs共培养体系中ERK通路介导的髓鞘化损伤1.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下共培养体系髓鞘节段数目和长度的下降与HG组相比,各药物干预组髓鞘节段数目和长度均增多,差异显着(p<0.01)；与QHC组相比,QK、QC、HC组及Q3、H3、C3组均显着减少(p<0.01)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3和H3组均明显减少(P<0.01或P<0.05),与QC组相比,Q3组和C3组明显减少(P<0.05或P<0.01),与HC组相比,H3组和C3组均显着减少(P<0.01)；单体组间比较,与Q3组相比,H3和C3组均明显减少(P<0.05)。2.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下共培养体系的髓鞘蛋白和mRNA表达的下调与HG组相比,各药物干预组MBP和MAG蛋白及mRNA表达均升高,差异显着(p<0.01)；与QHC组相比,QH、QC、HC组及Q3、H3、C3组均显着降低(p<0.01)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3组和H3组MBP和MAG蛋白及mRNA表达均明显降低(P<0.01或P<0.05),与QC组相比,Q3和C3组MBP和MAG蛋白及mRNA表达均明显降低(P<0.01或P<0.05),与HC组相比,H3组和C3组MBP和MAG蛋白及mRNA表达均显着降低(P<0.01)；单体组间比较,与Q3组相比,H3组和C3组MBP和MAG蛋白及mRNA表达均降低,差异有统计学意义(p<0.01或P<0.05),与H3组相比,C3组MBP和MAG mRNA表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下共培养体系ERK通路的激活MAG与p-ERK免疫荧光双染检测结果显示,p-ERK与MAG染色阳性的位置基本重合。与HG组相比,各药物干预组ERK磷酸化水平和p-ERK表达均降低,差异显着(P<0.01)；与QHC组相比,QH、QC、HC组及Q3、H3、C3组均显着升高(p<0.01)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3组和C3组p-ERK表达明显增加(p<0.01或P<0.05),H3组ERK磷酸化水平显着升高(P<0.01),与QC组相比,C3组ERK磷酸化水平和p-ERK表达均显着升高(P<0.01),与HC组相比,H3和C3组ERK磷酸化水平显着升高(P<0.01)；单体组间比较,与Q3组相比,H3和C3组ERK磷酸化水平和p-ERK表达显着升高(P<0.01)。[结论]1.高糖通过诱导SCs ERK通路激活,同时活化其下游靶点SCs成髓鞘负性调控因子c-Jun和Notch通路,抑制SCs的增殖和分化,降低CNTF的分泌水平,减少髓鞘相关蛋白P0的蛋白表达以及髓鞘调控基因P0、Krox-20和MAG mRNA表达,从而导致SCs成髓鞘损伤。2..槲皮素、水蛭素、桂皮醛单体单用组、两两配伍组和叁种单体复方组能够通过抑制高糖诱导的ERK通路的激活,同时阻断其下游靶点c-Jun和Notch通路的活化,促进SCs的增殖和分化,增加CNTF的分泌水平,上调P0的蛋白表达以及P0、Krox-20和MAG mRNA表达水平,从而有效缓解高糖诱导的SCs成髓鞘的损伤。单体之间比较,槲皮素的作用优于水蛭素和桂皮醛。两两配伍组作用优于组合中配伍的单体单用组。叁种单体复方组的作用均优于两两配伍组和单体单用组。3.高糖通过诱导共培养体系中SCs的ERK通路的激活,下调髓鞘相关蛋白MBP和MAG蛋白和mRNA表达,减少共培养体系形成的髓鞘节段数目和长度,从而引起DRGn/SCs共培养体系髓鞘化的损伤。4..槲皮素、水蛭素、桂皮醛单体单用组、两两配伍组和叁种单体复方组均能通过抑制高糖条件下共培养体系中SCs的ERK通路的激活,提高MBP和MAG的蛋白和mRNA表达,增加共培养体系形成的髓鞘节段数目和长度,从而有效缓解高糖对共培养体系髓鞘化的损伤。槲皮素的作用优于水蛭素和桂皮醛。两两配伍组作用优于组合中配伍的单体单用组。叁种单体复方组的作用均优于两两配伍组和单体单用组。[创新点]本课题分别采用高糖诱导SCs成髓鞘损伤模型和高糖诱导DRGn/SCs共培养体系髓鞘化损伤模型,探讨ERK信号通路在高糖诱导周围神经系统髓鞘损伤中的作用以及槲皮素、桂皮醛、水蛭素及单体组合的干预作用,为DPN髓鞘损伤机制的阐明和筋脉通防治DPN提供理论基础和实验依据,经检索国内外文献未见报道。
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