杨青和 桂福
怀化市第二人民医院检验科 湖南怀化 418000
【摘 要】目的 研究分析PCR-膜杂交法和PCR-荧光法在临床感染人乳头瘤病毒检测中的应用价值。方法 本次研究行回顾性调查法，采集126例不同类型的标本，分别采用PCR-膜杂交法和PCR-荧光法对每个标本的人乳头瘤病毒进行检测，对比记录各组标本的检出阳性率。结果126份标本中共有94份（74.6%）NILM，细胞异常共有32份（25.4%）。在NILM组细胞的阳性检出率上，PCR-膜杂交法与PCR-荧光法分别为27.7%、12.8%，具有统计学差异（P＜0.05）；在细胞异常组的阳性检出率上，PCR-膜杂交法与PCR-荧光法分别为96.9%（31/32）、90.6%，不具有统计学差异（P＜0.05）。结论 对于人乳头瘤病毒检测而言，PCR技术对其有高灵敏度与特异性。在临床应用中，PCR-荧光法更具临床价值，可提高人乳头瘤病毒检出率，而PCR-膜杂交法对非高危性人乳头瘤病毒检测以及科学研究更有意义。
【关键词】PCR-膜杂交法；PCR-荧光法；聚合酶链反应；人乳头瘤病毒
人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）是女性生殖道常见的病毒，是导致宫颈癌与CIN的主要因素[1]。临床研究显示，HPV阴性的女性发生宫颈癌的概率极低，HPV亚型的不同对宫颈癌的致病性不同，因此，准确筛查HPV并分型具有重要的临床价值。本文围绕研究分析PCR-膜杂交法和PCR-荧光法在临床感染人乳头瘤病毒检测中的应用价值展开讨论，取得了较为满意的结果，现具体报告如下。
1资料与方法
1.1一般资料
以我院妇科126例自2015年1月份至2015年10月份收治的门诊患者为对象实施研究方案。患者年龄范围在（22-59）岁之间，平均年龄为（31.4±2.6）岁。标本来自患者的宫颈口麟状上皮与柱状上皮交界处细胞，通过棉拭子擦除宫颈口的多余分泌物，随后用宫颈刷采集脱落细胞。将宫颈刷置入1mL生理盐水的试管中漂洗，并立即送检。细胞学检查所需标本的采集通过专用采集器，立即送检。本研究经伦理会讨论并通过，所有患者对本次研究内容均知情并愿意参与。
1.2纳入标准
曾有性生活史，处于非妊娠期与非例假期，取样前3天不能对阴道进行冲洗或使用阴道内药物，自愿接受HPV检测与细胞学检查。
1.3方法
1.3.1 PCR-膜杂交法
原理为PCR技术及导流杂交原理，以包被有型特异性探针膜杂交结果与反向点杂交检测扩增产物为依据，通过碱性磷酸酶系统进行定性检测分析[2]，检测标本中是否含有下列基因：HPV6/11/16/18/31/33/35/39/42/43/44/45/51/52/53/56/58/59/66/68，CP8304。对标本离心5min，转速为1300r/min，分离沉淀，提取标本的DNA，取2μL。将DNA模板、PCR mix、TAQ以一定比例混合。在95℃的温度下反应9min，循环40个（95℃/20s，55℃/30s，72℃/30s），72℃的温度下反应5min。所得产物应用于杂交。显色后可在阳性结果中见清晰的蓝紫色点，以膜条HPV分型图为依据，判断类型。
1.3.2 PCR-荧光法
DNA的提取方法同PCR-膜杂交法。将提取的DNA加入反应管中，管中包括以13种高危型人乳头瘤病毒的L1基因段为靶序列对应的高特异性探针与引物。并检测标本中是否含有下列高危型HPV：HPV16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68，在50℃的温度下反应2min，95℃的温度下反应10min，循环40个（95℃/15s，52℃/30s，62℃/60s）。根据PCR过程中释放的荧光反映产物剂量，将荧光转化为DNA模板剂量，并判断结果。
1.3.3细胞学检查
根据TBS标准将细胞检查结果分为NILM（未见恶性病变或上皮内病变细胞）、ASC-H、LSIL、HSIL、SCC。
1.4统计学方法
将原始数据整理输入SPSS 17.0软件分析。计数资料χ2检验用（%）表示，以P＜0.05为界限，作为是否具有统计学差异的标准。
2结果
2.1细胞检查结果
126份标本中共有94份（74.6%）NILM，细胞异常共有32份（25.4%），包括17份ASC-H，13份LSIL，1份HSIL，1份SCC。
2.2 两种PCR方法在不同类别细胞中阳性检出率结果
两种方法对HPV阳性率灵敏度均较高，特异性理想。在NILM组细胞的阳性检出率上，PCR-膜杂交法与PCR-荧光法分别为27.7%、12.8%，具有统计学差异（P＜0.05）；在细胞异常组的阳性检出率上，PCR-膜杂交法与PCR-荧光法分别为96.9%（31/32）、90.6%，不具有统计学差异（P＜0.05）。具体数值见表1所示。
3讨论
PCR-荧光法在常规PCR上增加了荧光探针，整个反应过程均在密闭试管中进行，避免了实验室交叉污染的发生[3]。PCR-膜杂交法建立于常规PCR技术之上，其过程增加了膜杂交，所得结果只能通过定性分析，不能根据信号强弱进行定量分析。虽然HPV的阳性检出率较高，但此过程相比于荧光法操作较为繁琐，且杂交过程会增加交叉污染的发生。同时，PCR-荧光法在扩增过程中可通过荧光进行半定量分析，结果精准，适用于高危型HPV进行亚型的筛选[4]。
本研究结果显示，PCR对异常细胞有较高的阳性检出率，对NILM的检出率明显较低。说明PCR对HPV的灵敏度较高。而在NILM组细胞的阳性检出率上，PCR-膜杂交法与PCR-荧光法分别为27.7%、12.8%，具有统计学差异（P＜0.05）；在细胞异常组的阳性检出率上，PCR-膜杂交法与PCR-荧光法分别为96.9%（31/32）、90.6%，不具有统计学差异（P＜0.05）。说明PCR-荧光法与PCR-膜杂交法具有相似的HPV检出率，但PCR-荧光法综合优势更为显著。
综上所述，对于人乳头瘤病毒检测而言，PCR技术对其有高灵敏度与特异性。在临床应用中，PCR-荧光法更具临床价值，可提高人乳头瘤病毒检出率，而PCR-膜杂交法对非高危性人乳头瘤病毒检测以及科学研究更有意义。
参考文献：
[1]肖克林，王辉林，麦光兴，等.多重实时PCR检测高危型人乳头瘤病毒感染[J].中华检验医学杂志，2011，34（6）：534-537．
[2]孟芝兰，程雪梅，朱晨雁，等.全自动DNA定量分析系统在宫颈癌及癌前病变筛查中的应用价值[J].诊断病理学杂志，2012，19（1）：15-18.
[3]王慰敏，安瑞芳，朱克修.多重聚合酶链反应一步法用于宫颈病变患HPV分型检测的初步研究[J].现代诊断与治疗，2014，25（12）：2647-2649.
[4]张燕，黄丽慧.高危型 HPV定量检测在宫颈癌筛查中的应用[J].内蒙古中医药，2014，30：93-94.
论文作者:杨青和,桂福
论文发表刊物:《航空军医》2016年第11期
论文发表时间:2016/7/25
标签：检出论文; 细胞论文; 阳性论文; 标本论文; 荧光法论文; 病毒论文; 统计学论文; 《航空军医》2016年第11期论文;