湖南省妇幼保健院 湖南长沙 410008
摘要：目的 探讨真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）转录表达与宫颈癌Hela细胞增殖的关系。方法 选取人宫颈癌Hela细胞，随机分为阴性对照组，空白对照组和观察组，其中阴性对照组Hela细胞不进行处理，空白对照组Hela细胞转染空白质粒，观察组Hela细胞转染shRNA干扰质粒，采用RT-PCR和Western blot检测各组细胞eIF4E mRNA和蛋白表达，采用MTT法检测Hela细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期。结果 观察组Hela细胞培养48h后eIF4E mRNA和蛋白相对表达量分别为（0.351±0.028）和（0.234±0.038），明显低于阴性对照组和空白对照组（p＜0.05）；观察组Hela细胞培养24h、48h后吸光度值（OD）分别为（0.901±0.067）和（1.201±0.080），明显低于空白对照组和阴性对照组（p＜0.05）；观察组Hela细胞培养48h后G0/G1期细胞比例为（68.01±2.55）%，明显高于空白对照组和阴性对照组，而S期细胞比例为（31.43±2.73）%，明显低于空白对照组和阴性对照组（p＜0.05）。结论 下调eIF4E表达，能抑制宫颈癌Hela细胞增殖，值得进一步研究。
关键词：宫颈癌；真核细胞翻译起始因子4E；Hela细胞；细胞增殖
Analysis of the correlation between the expression of eIF4E and the proliferation of cervical cancer Hela cells and its mechanism
[Abstract]Objective：To investigate the relationship between the expression of eukaryotic translation initiation factor 4E（eIF4E）and the proliferation of cervical cancer Hela cells. Methods：Human cervical cancer Hela cells were randomly divided into negative control group，blank control group and observation group，the negative control group Hela cells were not processed，the blank control group Hela cells transfected with blank plasmid，the observation group Hela cells transfected shRNA interference plasmid，the expression of eIF4E mRNA and protein was detected by RT-PCR and Western blot in each group，MTT method was used to detect the proliferation of Hela cells，and the cell cycle was detected by flow cytometry. Results：The expression of eIF4E mRNA and protein of Hela cells in the observation group culture 48h were（0.351±0.028）and（0.234±0.038），were significantly lower than those in the negative control group and the blank control group（P < 0.05）；The absorbance value（OD）of the Hela cells in the observation group culture 24h and 48h were（0.901±0.067）and（1.201±0.080），significantly lower than the blank control group and the negative control group（P < 0.05）；The observation group Hela cell culture 48h G0/G1 phase cell percentage was（68.01±2.55）%，significantly higher than the blank control group and negative control group，while the proportion of cells in S phase was（31.43±2.73）%，significantly lower than the blank control group and negative control group（P < 0.05）. Conclusion：Down regulation of eIF4E expression can inhibit the proliferation of cervical cancer Hela cells，which is worthy of further study.
[Key words] Cervical cancer；eukaryotic translation initiation factor 4E；Hela cells；cell proliferation
真核细胞翻译起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）是近些年发现的一组新型原癌基因，其定位与人染色体4q2-q25上，包含一条由8条反平行β链组成的β折叠片和三个与β折叠片平行的α螺旋[1]。eIF4E是真核细胞翻译的重要节点，对帽依赖性翻译的起始及限速具有调节能力[2]。临床已经证实了eIF4E的细胞增殖及转换蛋白翻译能力，但其调控表达机制如何，目前尚无明确结论[3]。国内对eIF4E与宫颈癌间的联系的研究较少，其对宫颈癌病毒间作用机制研究也刚刚起步。为此，本研究选用RNA干扰技术对宫颈癌Hela细胞对eIF4E的转录表达间的联系进行分析，现将结果报道如下。
1材料与方法
1.1细胞及试剂
宫颈癌Hela细胞由第三军医大学附属医院提供；eIF4E抗体由美国Santacruz公司提供；DMEM高糖培养基由美国G1bco公司提供；脂质Lipofectamine 2000由 Invitrogen 公司提供；CCK-8试剂盒由北京索莱宝科技有限公司提供。
1.2实验方法
1.2.1 实验分组
实验分为三组，即阴性对照组（Hela细胞不进行处理），空白对照组（转染空白质粒）和观察组（转染shRNA干扰质粒）。
1.2.2 质粒转染
将样本细胞取出后，于37℃下水浴解冻，滴入10ml DMEM培养基，吹打均匀，1000r/min离心，弃上清，滴入10ml DMEM培养基，吹打均匀，1：3传代，移入至培养瓶内，于室温下，5% co2的培养箱内培养、传代[4]。镜检细胞状态，挑取生长旺盛、形态良好的细胞进行转染。转染根据Invitrogen公司的Lipofectamine2000试剂的说明书进行。
1.2.3 RT-PCR检测
选用Eppendorf核酸定量测定仪检测每组总RNA，每组取1ug总RNA样本置于70℃温箱内孵化30min，Hela细胞及eIF4E mRNA引物由长沙艾杰生物技术有限公司提供，根据相关试剂盒说明书进行PCR反应，参数为：94预变性5min，94℃ 40s，54℃ 40s，72℃ 60s，35个循环，72℃延伸10min。取5ul PCR产物，选用1.8%琼脂凝胶电泳，并根据凝胶成像系统分析其吸光度[5]。
1.2.4 Western blot检测
将样本接入至6孔板内，滴入10ul DMSO室温过夜，弃培养基，PBS洗涤，滴入100ul RIPA；裂解液，孵化30min，1500r/min离心 5min，检测蛋白含量。将样本置于SDS-聚丙烯酞胺凝胶孔内，电泳，置于PVDF膜上，封闭60min，加入10ml 0.5% eIF4E抗体进行一抗，孵化1h，洗膜2次，加入0.5%封闭稀释液二抗，孵化1h，洗膜2次，化学发光法显示，X线片显影，检测仪器选用KONTROMBAS 2.0全自动图像分析仪。
1.2.5 细胞增殖检测
选用CCK-8法检测细胞增殖情况，选用RPMI-1640 培养基将样本细胞密度调整为2.0*104/ml，将样本接种至96孔板内，每孔滴入10ul CCK-8溶液，室温下孵化120min，选用酶标仪检测吸光度，并计算细胞生长抑制率，公式为：细胞生长抑制率=（1-实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。
1.2.6 流式细胞术检测
将培养后的样本经0.25%胰酶消化5min，滴入10ml培养基终止反应，2000r/min离心5min，弃上清，PBS洗涤，65%乙醇固定，低温保存过夜。2500r/min离心5min，PBS洗涤，滴入0.8ml PI，低温避光染色60min，过滤后选用贝克曼库尔特FC 500 MCL/MPL流式细胞仪检测。
1.3统计学处理
统计分析采用SPSS19.0，计量资料采用（±s）表示，组间比较使用方差分析，计数资料比较使用2检验。检验水准=0.05。
2结果
2.1 各组Hela细胞eIF4E表达情况
观察组Hela细胞培养48h后eIF4E mRNA和蛋白相对表达量明显低于阴性对照组和空白对照组（p＜0.05）；阴性对照组和空白对照组eIF4E mRNA和蛋白相对表达量比较差异无统计学意义（p＞0.05）。见表1。
图2 流式细胞仪检测图
3讨论
eIF4E是帽结合蛋白的一种，可通过识别mRNA的帽结构来调节mRNA的翻译，如可作用细胞mRNA由43s起始复合物的48s复合物转化，解开mRNA 5等[6]。eIF4E功能与癌基因类似，其在翻译起始复合物中的含量最低，但控制着增高蛋白翻译过程[7]。eIF4E的生物活性不但受自身磷酸化的调节，同时还受其结合蛋白的调节。磷酸化eIF4E是eIF4E激活的初始步骤，随后eIF4E将对mRNA 5，帽状结构进行翻译[8]。细胞核内的eIF4E蛋白则可具有转运VEGF、ODC等特殊细胞因子至细胞质内的功能，但这一功能并无法影响细胞mRNA的表达。已有研究表明，eIF4E与头颈鳞癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤存在密切联系，eIF4E参与着这些恶性肿瘤的发生、发展[9]。过表达的eIF4E可通过激活肿瘤细胞的5UTRs基因序列，并以此增强弱mRNA的表达，增强影响肿瘤细胞的生长、分化的EVGF、MMP9、Bcl-2等细胞因子的表达，最终作用癌症恶化[10]。
宫颈癌是我国女性高发恶性肿瘤之一，世界卫生组织调查显示，我国宫颈癌发病率位于世界第二，仅次于智利，并且发病率呈年轻化趋势[11]。但我国对宫颈癌的病理研究依然处于探索阶段，eIF4E与宫颈癌间的联系研究也处于起步阶段。有学者通过免疫组化实验发现，健康宫颈鳞状上皮组织内无eIF4E表达，而宫颈病变患者则存在eIF4E表达情况，并且其表达水平与病变级别呈正相关，该学者推测eIF4E表达可促使宫颈癌变的早期病理改变，参与着健康宫颈细胞的癌化[12]。动物实验发现，过表达的eIF4E病毒载体转染大鼠胚胎成纤维组织细胞后，大鼠胚胎成纤维组织细胞均出现恶变；相反的，如选用反义低聚和苷酸抑制eIF4E的表达，大鼠胚胎成纤维组织细胞恶性表型将出现逆转情况，这充分证明了eIF4E与肿瘤间的联系[13]。本组研究发现，Hela细胞培养48h后eIF4E mRNA和蛋白相对表达量及吸光度值（OD）明显低于阴性对照组和空白对照组，提示eIF4E对宫颈癌细胞的活化具有重要作用，其机制可能与eIF4E作用宫颈细胞增殖、凋亡动态平衡失衡，促使宫颈细胞过度增殖、转换，甚至恶化[14]。有研究发现，恶性组织宫颈组织内的eIF4E表达水平明显高于良性组织，这表明eIF4E还可能与宫颈癌分期、预后存在密切联系[15]。本研究还发现，观察组Hela细胞培养48h后G0/G1期细胞比例明显高于空白对照组和阴性对照组，而S期细胞比例明显低于空白对照组和阴性对照组，这表明下调eIF4E的表达能抑制宫颈癌细胞的增殖分化，提示eIF4E或可成为宫颈癌治疗新靶点。
本研究通过RNA干扰技术对宫颈癌Hela细胞的eIF4E干扰，并选用RT-PCR、Western blot及CCK-8法等对干扰细胞进行检测分析，发现eIF4E参与着这些恶性肿瘤的发生、发展，并发现下调eIF4E表达，Hela细胞增殖分化可有效抑制，但其作用机制尚不明确，这有待我们随后的进一步研究。
综上所述，下调eIF4E表达，能抑制宫颈癌Hela细胞增殖，eIF4E或可成为宫颈癌治疗新靶点，值得临床进一步研究。
参考文献：
[1]李龙. 宫颈癌组织中真核细胞翻译起始因子4E和血管内皮生长因子的表达及意义[J]. 广东医学，2015，21（13）：2060-2063.
[2]林宇，岳丽玲，蒋丽艳. 岩大戟内酯B对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响[J]. 中国实验方剂学杂志，2016，10（3）：132-136.
[3]鲁建军，潘游，雷艺炎，等. 真核细胞翻译起始因子和雷帕霉素靶蛋白在食管鳞癌组织中表达的临床意义[J]. 中华胃肠外科杂志，2015，30（9）：905-908.
[4]Thumma S C，Jacobson B A，Patel M R，et al. Antisense oligonucleotide targeting eukaryotic translation initiation factor 4E reduces growth and enhances chemosensitivity of non-small-cell lung cancer cells[J]. Cancer Gene Therapy，2015，22（8）：396-401.
[5]闫昭飞，龙惠，王帅，等. 真核翻译起始因子5A在热疗抗恶性肿瘤中的作用机制研究进展[J]. 中国普通外科杂志，2016，25（4）：604-608.
[6]阙万才，黄宁，刘峰，等. 甘蔗真核生物翻译起始因子5A基因的克隆与表达分析[J]. 应用与环境生物学报，2015，21（6）：1120-1127.
[7]Bommer U A，Iadevaia V，Chen J，et al. Growth-factor dependent expression of the translationally controlled tumour protein TCTP is regulated through the PI3-K/Akt/mTORC1 signalling pathway[J]. Cellular Signalling，2015，27（8）：1557-1568.
[8]秦晓黎，刘晓瑞，田福举，等. 真核细胞翻译起始因子5A与自然流产相关性的初步研究[J]. 上海交通大学学报医学版，2015，35（4）：470-475.
[9]刘世凯，宋莉莉，曾赛田，等. 人脐带间充质干细胞对宫颈癌Hela细胞增殖特性的影响[J]. 中国组织工程研究，2015，19（45）：7274-7278.
[10]王丽丽，杨金刚，李长岭，等. 核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）介导SP600125诱导的巨核细胞白血病细胞系多倍体化依赖于细胞分化程度[J]. 细胞与分子免疫学杂志，2016，32（10）：1336-1341.
[11]Chen B，Zhang B O，Xia L，et al. Knockdown of eukaryotic translation initiation factor 4E suppresses cell growth and invasion，and induces apoptosis and cell cycle arrest in a human lung adenocarcinoma cell line：[J]. Molecular Medicine Reports，2015，12（6）：7971-7978.
[12]刘怡，陈辉，王凤，等. 洋椿苦素对人宫颈癌Hela细胞增殖的抑制作用研究[J]. 中药药理与临床，2016，105（1）：65-69.
[13]杨婧，戚基萍，王锐，等. 红花多糖对人宫颈癌Hela细胞增殖和VEGF表达的影响[J]. 中国实验方剂学杂志，2016，39（8）：111-114.
[14]刘峰，俞勇，禹林昌，等. 黄芩苷对人宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡影响机制研究[J]. 中华肿瘤防治杂志，2015，22（9）：661-665.
[15]刘晶，李菁菁，李义飞，等. 氧化苦参碱通过P38MAPK通路抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖[J]. 中国现代医学杂志，2015，25（10）：10-14.
论文作者:刘双
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2017年第13期
论文发表时间:2017/9/22
标签：细胞论文; 宫颈癌论文; 对照组论文; 阴性论文; 转染论文; 蛋白论文; 空白论文; 《中国误诊学杂志》2017年第13期论文;