一、用实验动物制备多克隆抗体Ⅰ.免疫方案的优化（论文文献综述）
关乃瑜[1]（2021）在《基于AuNPs-寡聚核苷酸探针的草甘膦免疫学检测技术研究》文中指出草甘膦（glyphosate,GLYP）是由美国孟山都公司在二十世纪60年代开发一种非选择性广谱除草剂。自2005年以来,GLYP的销量稳居全球农药销售排行榜首位。1995年首株GLYP抗性大豆系培育成功,此后GLYP的生产量与使用量逐年锐增。目前,GLYP已成为世界上应用最广、生产量最大的除草剂,也是目前我国使用量最大的除草剂。GLYP的长期大量施用导致环境及农作物中具有高水平的GLYP残留,对生态环境和人类健康构成了严重的威胁。2015年,世界卫生组织国际癌症研究机构将GLYP归类为2A类致癌物,即对人类可能致癌的物质。所以开发快速、灵敏、高效的GLYP检测技术对于保障农产品食品安全至关重要。GLYP的传统检测方法主要以色谱技术为主,尽管该方法具有较高检测灵敏度,但仍存在样品前处理步骤复杂,分析成本高,检测周期长和仪器设备昂贵等不足。因此,开发选择性好、灵敏度高、方便、价格低廉的GLYP快速检测方法是保障食品安全的迫切需求。与其他检测技术相比,免疫学检测技术具有检测周期短、成本低、操作简便等优势。然而,现有的GLYP免疫学检测方法则以传统的酶联免疫分析方法（ELISA）为主,相比于色谱法等仪器分析方法,ELISA的检测灵敏性较低。近年来,随着新型纳米材料和生物酶的出现,免疫分析技术快速发展,已经成为一个融合纳米技术、酶工程和基因工程等其他多学科交叉的新型分析技术,为开发更加快速、灵敏、特异的免疫学分析方法提供了新的观点和思路。基于生物功能化纳米粒子材料的新型免疫分析技术,可进一步提高免疫学检测方法的灵敏性和稳定性,弥补现有的GLYP免疫学检测方法灵敏性低、检测步骤多、检测方法单一等不足。本课题旨在结合免疫学检测技术、荧光分析技术和分子探针标记技术,利用寡聚核苷酸和金纳米粒子（AuNPs）在生物传感领域的应用优势,以ELISA检测为基础建立基于寡聚核苷酸纳米结构功能化AuNPs探针的新型GLYP免疫学检测方法。以期提高GLYP免疫学检测方法的检测水平,实现更加灵敏、快速、经济的GLYP检测。同时探究聚核苷酸功能化AuNPs探针在GLYP等小分子物质检测中的应用潜力。本论文的具体工作内容和结论如下:1.GLYP完全抗原的合成和鉴定。分别采用活化酯法和混合酸酐法合成了GLYP的免疫抗原（BSA-GLYP）和检测抗原（OVA-GLYP）。通过UV-Vis光谱扫描、琼脂糖电泳和Native-PAGE对合成的完全抗原进行分析鉴定,通过比较不同免疫抗原免疫鼠的血清的效价及抑制率,选择具有较高血清效价和抑制率的c BSA-聚醚胺-GLYP用于制备多克隆抗体。2.GLYP多克隆抗体的制备与鉴定。采用AKTA蛋白纯化系统和A蛋白抗体纯化柱对兔血清中的GLYP抗体进行纯化,并对抗体的浓度、纯度、效价和亲和力进行测定。结果显示,抗体效价为1:256000,抗体的亲和力常数为3.68×109 L mol-1,属于高亲和力抗体。3.ic-ELISA检测方法的建立。利用制备的兔抗GLYP多克隆抗体建立检测GLYP的ic-ELISA方法。线性检测范围为0.125 mg m L-1～4 mg m L-1,最低检测限为139.9μg m L-1。建立的ic-ELISA方法检测GLYP的三种结构类似物AMPA、GLUF和PMIDA的交叉反应率分别为0.61%、0.003%和0.014%,食品样品中的回收率在97.1%～99.9%之间,检测时间为3 h。4.基于AuNPs-TDNs纳米耀斑探针的间接竞争荧光免疫分析方法（AuNP-TDNs-ic-FLIA）的建立。用羊抗兔抗体和荧光染料SYBR Green I（SG）染色的四面体DNA（TDNs）同时修饰AuNPs,制备初始荧光被AuNPs通过FRET作用淬灭的具有可控荧光开启功能的AuNP-TDNs纳米耀斑探针（AuNP-TDNs nanoflare probe）,利用AuNPs的尺度效应及较大的比表面积实现对检测信号的放大。采用TEM、UV-Vis扫描光谱和荧光光谱对制备的探针进行表征,随后基于探针建立检测GLYP的间接竞争荧光免疫分析方法（ic-FLIA）。向包被OVA-GLYP的酶标板中加入GLYP抗体与待检样品混合物后进行孵育,此时样品中的GLYP与酶标板中的OVA-GLYP竞争结合GLYP抗体。洗板后加入AuNP-TDNs纳米耀斑探针进行孵育。再次洗涤后,加入二硫苏糖醇（DTT）释放探针上的耀斑DNA（TDNs-SG）,实现荧光的恢复。结果显示,该方法的检测范围为0.5μg m L-1～32μg m L-1,最低检测线为0.18μg mL-1。灵敏度比基于同一抗体的ic-ELISA方法提高了约700倍。方法检测GLYP的三种结构类似物AMPA、GLUF和PMIDA的交叉反应率均小于0.01%,食品样品中的回收率在95.5%～100.0%之间,检测时间为3.5 h。5.基于AuNP-dsDNA纳米耀斑探针的竞争荧光免疫分析方法（AuNP-dsDNA-c-FLIA）的建立。用GLYP抗体和荧光染料SG标记的dsDNA同时修饰AuNPs,制备初始荧光被AuNPs通过FRET作用淬灭的具有可控荧光开启功能的AuNP-dsDNA纳米耀斑探针（AuNP-dsDNA nanoflare probe）,同时利用AuNPs较大的比表面积实现对检测信号的放大。采用TEM、UV-Vis扫描光谱和荧光光谱对制备的探针进行了表征,并在该探针基础上建立了检测GLYP的竞争荧光免疫分析方法（c-FLIA）。向包被OVA-GLYP的酶标板中加入AuNP-dsDNA纳米耀斑探针与待检样品的混合物后进行孵育,此时样品中的GLYP与酶标板中的OVA-GLYP直接竞争结合探针上的GLYP抗体。洗涤除去未结合组分后,加入DTT释放探针上的耀斑DNA（dsDNA-SG）,实现荧光的恢复和检测信号的放大。结果显示,该方法的检测范围为62.5 ng m L-1～4μg m L-1,最低检测线为28.6 ng m L-1。检测GLYP的三种结构类似物AMPA、GLUF和PMIDA的交叉反应率均小于0.01%,食品样品中的回收率在97.5%～101%之间。该方法的检测灵敏度比基于同一抗体的ic-ELISA和AuNP-TDNs-ic-FLIA方法分别提高了4800倍和6倍。本方法采用直接竞争的检测模式进一步简化了检测程序,将检测时间从3.5 h缩短至1.5 h,检测流程更简单、省时。同时,以dsDNA-SG代替TDNs-SG作为耀斑DNA,进一步提高了探针的信号放大性能。6.基于双功能化AuNPs的条形码检测方法的建立。用GLYP抗体和dsDNA修饰AuNPs,制备同时具有GLYP识别捕获和信号扩增放大功能的AuNPs探针。dsDNA由一条巯基修饰的捕获DNA链（SH-capture DNA）和一条互补配对结合在捕获链上的条形码DNA/信号DNA（signal DNA）组成。在该探针基础上,建立了检测GLYP的条形码扩增免疫分析方法（AuNP-BB-iPCR）。向包被有OVA-GLYP的PCR管中加入AuNPs探针和待检样品的混合物进行免疫竞争反应,在此过程中样品中的GLYP与PCR管中的OVA-GLYP竞争结合AuNPs探针上的GLYP抗体。洗涤除去未结合组分后,向管中加入PCR反应体系进行real-time PCR,通过检测signal DNA的量实现对GLYP的检测。本方法对探针制备条件进行了优化,并采用TEM、UV-Vis扫描光谱、real-time PCR和SDS-PAGE等方法对探针进行了表征。结果显示,该方法的最低检测限为8.9 pg m L-1,线性范围是122.1 pg m L-1～62.5 ng m L-1。建立的AuNP-BB-iPCR方法检测GLYP的三种结构类似物AMPA、GLUF和PMIDA的交叉反应率分别为2.36%、0.02%和0.34%。在对食品样品进行的标准品添加回收实验中,回收率在98.3%～102.9%之间。本研究利用real-time PCR对探针上条形码DNA进行PCR循环扩增实现检测信号的指数放大。灵敏度比基于同一抗体的ic-ELISA、AuNP-TDNs-ic-FLIA和AuNP-dsDNA-c-FLIA分别提高了7个数量级、4个数量级（20000倍）和3个数量级（3200倍）。检测时间为3.5 h。7.结论。本研究将纳米技术、荧光标记技术和免疫学检测技术相结合,制备基于AuNPs和寡聚核苷酸的纳米材料生物传感探针。经过探针表征、条件优化和性能评估试验后证明了探针在提高GLYP免疫学检测方法的灵敏性方面的有效性。并在此基础上开发了检测GLYP的一种ic-ELISA方法和三种新型免疫学检测方法。除了ic-ELISA方法以外,其他三种方法的灵敏性均满足我国国家标准中对食品中的GLYP最大残留限量的检测标准要求。相比于国标中规定的食品中GLYP残留量测定的GC-MS标准方法,本方法不需要特殊的检测条件和昂贵的仪器,仅需要简单的孵育步骤即可在1.5 h～3.5 h内完成检测,成本低廉、操作简单。
张昆[2]（2021）在《胞内劳森菌抗原候选蛋白表达及ELISA方法建立》文中指出胞内劳森菌（Lawsonia intracelluaris,LI）属于脱硫弧菌科,是一种严格的胞内致病菌,微需氧环境中生长,革兰氏染色为阴性,抗酸染色为阳性,形态上呈弯曲状、逗点状或杆状,长约1.25μm-1.75μm,宽约0.25μm-0.43μm。LI主要寄生于猪回肠上皮细胞,引起猪增生性回肠炎（porcine proliferative ileitis,又名增生性肠病,proliferative enteropathy）,导致猪生长缓慢,给养猪业带来了巨大的经济损失。自1931年于猪肠腺瘤样病变组织中首次发现LI以来,已先后证实该菌能自然感染马、犬、仓鼠、兔、狐狸、猫、羊、鹿、鸵鸟、鸡等动物。LI感染发生在世界各养猪国家,如美国、加拿大、澳大利亚、欧洲、巴西、日本、韩国、中国。目前用于检测LI的方法有聚合和梅链式反应（PCR）、间接免疫荧光试验（IFA）、免疫过氧化物单细胞试验（IMPA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）,但由于我国对该病研究几乎空白,国内尚无可应用的检测试剂盒,本研究根据生产实际需要,建立一种用于检测LI的间接ELISA方法,为猪增生性肠炎的检测和流行病学调查提供技术支撑。本研究根据免疫蛋白质组学研究的文献报道结果（Obradovic,et al,2019）,选取胞内劳森菌鞭毛相关蛋白（LI0641、LI0570、LI0710）、opp A蛋白LI0169、外膜蛋白LI0841、效应蛋白LI1035和膜转运蛋白LI1153作为候选蛋白。成功构建重组质粒p ET32-LI0641、p ET32a-LI0570、p ET32ɑ-LI0710、p ET32ɑ-LI0841、p ET32ɑ-LI0169、p ET32ɑ-LI1153、p ET32ɑ-LI1035,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞内,经IPTG诱导表达并通过镍柱纯化,SDS-PAGE电泳鉴定候选蛋白成功表达且纯化效果较好,并用抗E.coli血清对重组蛋白进行沉淀纯化,之后测定各重组蛋白浓度分别为2.41 mg/ml、2.57 mg/ml、3.24 mg/ml、2.04 mg/ml、2.32 mg/ml、2.67 mg/ml、1.52mg/ml。将获取的7种重组蛋白先经Western blot试验验证其反应原性,其中r LI0570、r LI0710、r LI0841、r LI1035具有反应原性,之后通过IFA验证这四种蛋白的免疫原性,结果显示均具有免疫原性。后续结合生物信息学分析r LI0841蛋白与其它病原无抗原表位交叉且反应原性较好,选取r LI0841蛋白作为包被抗原创建检测LI的间接ELISA方法。通过对间接ELISA基本优化,确定最佳条件;之后特异验证该重组抗原与其它病原（放线杆菌、副猪嗜血杆菌、冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、链球菌、支原体等）阳性血清无交叉反应,表现较高的特异性性;敏感性实验结果显示,分别在血清稀释度度为1:800和1:1600表现阳性,展现较高的敏感性。创建的间接ELISA进行重复性实验,批内变异系数小于5.2%,批间变异系数小于5%,具有较好的重复性。用建立的间接ELISA方法检测SPF级小鼠血清阳性率为0;检测甘肃兰州和江苏邳州两个猪场阳性率分别为15%和22%。结果表明,本研究成功建立可检测血清抗胞内劳森氏菌抗体的间接ELISA方法,为胞内劳森菌血清流行病学调查及临床检查提供有力工具。
韩振宇[3]（2021）在《诺氟沙星抗体的制备及超灵敏检测技术研究》文中研究表明目的诺氟沙星（Norfloxacin,NOR）抗菌类药是喹诺酮类的第三代产品,其通过阻断细菌产生DNA转录酶,抑制细菌DNA复制从而起到抑菌作用。随着诺氟沙星使用量的增加,滥用现象频发导致在食品中残留严重。研究者发明了许多技术来检测食品中诺氟沙星残留,如能够准确鉴定小分子化合物的液相色谱-质谱串联法;灵敏度高,测量范围广的电化学法等。然而,这些技术大都需要大量人力、物力,而且对检测人员要求比较高。本文以抗原抗体特异性结合为基础,开发了两种检测诺氟沙星的方法,能够快速、灵敏、直观的检测食品中诺氟沙星小分子,并且在牛奶中得到验证。方法本文以抗原抗体特异性结合为基础展开研究。首先,诺氟沙星小分子与大蛋白偶联获得完全抗原,通过免疫动物获得抗诺氟沙星多克隆抗体。利用点击化学将诺氟沙星小分子与生物素偶联形成多功能配体。还原法合成了粒径为15nm左右的胶体金并与叠氮/炔基形成共轭体以备可视法检测。本文开发的两种方法分别为:（1）化学发光检测法:本方法基于双功能配体改进化学发光法检测诺氟沙星小分子;（2）荧光/可视双通道检测法:利用铜离子不同价位能够参与不同反应的特点进行双通道检测。分别用两种方法对诺氟沙星小分子进行检测,绘制标准曲线、计算线性标准方程以及相关系数。最后,利用两种方法对市场上的牛奶进行加标回收实验,并进行方法学比较。结果合成诺氟沙星完全抗原,经过五次免疫后对大白兔心脏取血,对血清进行纯化获得抗诺氟沙星多克隆抗体。通过点击化学合成了诺氟沙星-生物素多功能配体用于检测方法的开发。还原法合成了15nm左右的胶体金并且与叠氮/炔基偶联成功。化学发光法检测4种FQs的检测限分别为0.05 ng/mL、0.11 ng/mL、0.14 ng/mL和0.16 ng/mL,加标回收率在86.31-112.11%之间。结果表明,该方法简单、有效、灵敏,对小分子污染物的检测符合国家标准。双通道法检测范围为3.18x10-2～6.88x103 pg/mL。该方法对其他类型的抗生素有良好的选择性。对两种方法进行了方法学比较。化学发光法线性范围为10-1-102 pg/mL,加标回收率为:99.44%,批内均值:9.52±0.12,批内CV（%）:1.25,批间均值:9.57±0.31,批内CV（%）:3.14,双通道法线性范围为:3.18x10-2-6.88x103 pg/mL,加标回收率平均为:100.86%,批内均值:11.37±0.45,批内CV（%）:3.96,批间均值:10.78±0.78,批内CV（%）:7.23。通过比较得出化学发光法简单,便捷,但是相较于双通道法灵敏度差,线性范围较窄。因此,可以根据需要选择合适的检测方法检测食品中的诺氟沙星抗生素。结论本研究基于抗体与抗原的特异性结合展开研究。制备了抗诺氟沙星多克隆抗体并且开发了两种针对诺氟沙星小分子的快速检测技术。通过方法学比较验证了两种方法的特异性和灵敏度。本文的优点是可以通过多种形式来检测食品中的诺氟沙星小分子,并且能进一步应用到其他抗生素的检测及食品安全检测中。
张超[4]（2021）在《牛IRF7蛋白的表达及对牛病毒性腹泻病毒增殖的影响研究》文中研究说明牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）能够引起一种极为复杂,呈多种临床症状的牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD）,严重危害全球畜牧业的健康发展。干扰素调节因子7（IRF7）是IRF转录因子家族的主要成员,也是IFN持续反应的正反馈调节环中不能或缺的一部分。前期q RT-PCR和转录组数据发现,在NCP BVDV感染的牛外周血单核淋巴细胞中IRF7呈下调表达,但是,IRF7与BVDV感染之间的关系尚不清楚。据此,本研究旨在确定牛IRF7（Bo IRF7）与BVDV复制的关系,为阐明IRF7在先天免疫抗病毒应答的分子机制中提供依据。目的:（1）利用生物信息学方法分析IRF7基因结构和功能,克隆Bo IRF7基因,利用原核表达系统表达IRF7蛋白,并制备多克隆抗体,为后续的实验研究提供物质材料。（2）构建Bo IRF7过表达和干扰细胞模型,为Bo IRF7基因功能验证奠定基础。（3）确定Bo IRF7与BVDV增殖的关系,为阐明Bo IRF7在天然免疫应答中的作用机制提供依据。方法:（1）使用生物信息学软件预测并分析Bo IRF7潜在生物学功能,参考Gen Bank已公布的IRF7基因序列,设计引物,通过RT-RCR扩增获得预期大小的目的基因,将其与p MD19-T载体进行连接后测序;为表达高效的IRF7蛋白,首先将克隆出的大小为1497bp的基因片段与带有His标签的p ET-28a载体质粒分别进行酶切后连接成为重组质粒,转化到大肠杆菌表达菌株中,挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序正确后诱导表达纯化,并对纯化后的蛋白进行复性,以复性后的蛋白为免疫原免疫实验兔,经三次免疫得到多克隆抗体血清,对抗体进行纯化,后用BCA法测定蛋白浓度,并用间接ELISA测定抗体效价。（2）通过构建过表达及干扰慢病毒载体,利用HEK-293T细胞包装慢病毒粒子,感染宿主细胞,经RT-PCR和Western-blot检测相关基因的过表达和干扰效果,筛选出干扰效果较好的片段。（3）通过BVDV感染细胞后,采用实时定量PCR和Western-blot方法检测Bo IRF7基因的m RNA及蛋白的表达情况;用NCP BVDV感染IRF7过表达和干扰的MDBK细胞,平行制备相同的两组样品,分别用作RT-PCR和Western-blot检测,验证其对病毒的增殖影响。结果:（1）通过对Bo IRF7进行生物信息学分析发现其具有潜在抗原潜力,筛选出抗原优势表位,成功从BVDV感染的MDBK细胞中扩增出大小为1497bp的基因片段,成功表达出60 KDa的IRF7蛋白,BCA方法测得纯化IRF7蛋白浓度为2000μg/m L;Western-blot结果显示制备的抗体具有良好特异性,间接ELISA检测出IRF7多克隆抗体的效价为1∶128000,成功制备出IRF7多克隆抗体。（2）成功构建过表达和干扰MDBK细胞系,并筛选出干扰效果较好的干扰片段。（3）BVDV病毒感染过表达及干扰的MDBK细胞系后,发现IRF7过表达后引起BVDV复制降低,干扰IRF7的表达会引起BVDV复制增强,结果表明IRF7基因的表达影响BVDV的复制。结论:（1）利用生物信息学方法预测IRF7蛋白具有良好抗原性,利用原核表达系统表达IRF7蛋白制备的多抗具有良好的特异性。（2）过表达IRF7会明显抑制BVDV的增殖,而干扰IRF7的表达则促进BVDV的增殖,IRF7在抑制BVDV增殖方面发挥重要作用。
刘瑶[5]（2021）在《β-丙内酯灭活肺炎支原体的安全性及其免疫原性研究》文中研究表明肺炎支原体（Mycoplasmapneumoniae,MP）是一种细菌性人类病原体,是全球公认的导致原发性非典型肺炎的主要病因,能引起上呼吸道症状和下呼吸道疾病。鉴于MP耐药菌株的出现和高发生率,预防MP感染引起的肺炎和继发性并发症的疫苗迫在眉睫。国外曾进行过甲醛的MP灭活疫苗临床试验,保护效果仅在40%左右。本研究采用甲醛和β-丙内酯（BPL）两种灭活剂对MP进行灭活,比较两种灭活剂的灭活效果及灭活后样品对Balb/c小鼠的免疫保护效果,并进一步探索MP灭活液的免疫剂量、剂次等对动物的免疫效果,对MP疫苗的研究具有重要意义。[目的]用甲醛和BPL制备肺炎支原体灭活液,比较两种灭活剂灭活效果及灭活样品对Balb/c小鼠的免疫效果,并进行免疫剂量和免疫剂次探索对BPL灭活MP的安全性及免疫原性进行研究。[方法]1.双抗体夹心ELISA体系建立:用山羊抗MP多克隆抗体、兔抗MP多克隆抗体和鼠抗MP多克隆抗体三种抗体,两两组合对MP抗原进行双抗体夹心ELISA检测,选取灵敏度高,交叉反应小的抗体建立双抗体夹心ELISA检测体系。2.MP标准品制备:将大量培养的5LMP菌液离心,1000倍浓缩收集,1ml/管分装于-80℃冻存,记为标准品MP-202001。将MP-202001倍比稀释以ELISA测定值大于0.1的最大稀释度的倒数作为其EU含量。将标准品MP-202001进行4倍稀释作为二级标准品（MP-202002）置于-20℃冻存,用于后续实验中MP抗原检测。3.灭活工艺研究:对肺炎支原体的培养进行优化,制备大量MP抗原用。不同浓度的甲醛和β-丙内酯对MP（ATCC 29342）进行灭活处理,测定不同灭活条件下最佳灭活时间,并对灭活样品的蛋白含量和EU等进行测定。4.免疫效果评价:两种灭活剂灭活样品相同蛋白量（20μg）对4-6周龄的Balb/c小鼠进行皮下免疫,用肺炎支原体ATCC 29342以107CCU/ml进行攻毒,通过测定攻毒后肺组织中MP的活菌数计算MP清除率,进行组织病理学评分和测定血清中抗体效价等指标。[结果]1.用山羊抗MP多克隆抗体和兔抗MP多克隆抗体建立的双抗体夹心ELISA,测定标准品MP-202001的抗原含量为2560 EU/ml。标准品倍比稀释检测所得曲线中,标准品稀释后在10 EU/ml-320EU/ml范围内检测值标准曲线R2>0.97,回归性良好。2.β-丙内酯（BPL）作为灭活剂相比于甲醛灭活的MP样品,在灭活后相同蛋白含量下,BPL灭活的MP样品有效抗原含量（EU）较甲醛灭活的MP样品高,0.05%和0.1%BPL灭活组所含抗原含量要高于甲醛灭活组（p<0.95）,且所需灭活时间更短。相同蛋白含量进行Balb/c小鼠的免疫（20μg/只）,0.1%的BPL灭活的MP样品GMT（1:9.12）、血清IgG抗体水平和对MP的清除率均显着高于甲醛灭活的各组（p<0.001）。3.选取上述灭活条件0.1%BPL进行免疫剂量探索,用不同剂量0.1%BPL灭活的 MP 样品免疫 Balb/c 雌鼠,按 0.675 EU/只、1.35 EU/只、2.7 EU/只、5.4 EU/只、10.8 EU/只、21.6 EU/只、43.2 EU/只剂量免疫小鼠MP的清除率分别为60.7%、80.5%、94.6%、92.7%、92.0%、91.1%、91.4%。结果显示免疫剂量在 2.7 EU/只及以上的各组GMT和血清IgG抗体水平要高于免疫剂量低于2.7 EU/只的组,经统计分析结果具显着性（p<0.05）。0.1%BPL灭活的MP,2.7 EU/只进行免疫剂次探索,对小鼠进行一次、二次、三次、四次、五次免疫小鼠测定血清效价及血清IgG抗体水平显示该灭活样品多次加强免疫后免疫效果要优于单次免疫,结果显示该灭活样品3次及以上免疫的Balb/c小鼠GMT和血清IgG抗体水平明显高于一次二次免疫（p<0.001）,3次及以上免疫的MP清除率可达100%。[结论]1.以山羊抗MP多抗和兔抗MP多抗建立的双抗体夹心ELISA,测定标准品MP-202001的抗原含量为2560EU/ml,标准品稀释在10 EU/ml-320 EU/ml范围内线性回归良好可用于MP的定量检测。2.BPL作为MP抗原的灭活剂要优于甲醛作为MP抗原灭活剂。两种灭活剂灭活后相同蛋白量下BPL灭活样品有效抗原EU高于甲醛灭活样品（p<0.05）。0.1%BPL灭活组免疫Balb/c小鼠后与甲醛灭活各组相比MP清除效果更好（p<0.05）。3.0.1%BPL灭活的MP样品皮下免疫Balb/c小鼠接种量2.7 EU/只免疫3次,用测定活菌含量为107CC U/ml的MP菌液攻毒后,Balb/c小鼠对MP的清除率可达100%。
龚静芝[6]（2021）在《片形吸虫病早期诊断靶标的筛选及诊断方法的建立》文中研究说明片形吸虫病（Fasciolosis）是由大片吸虫（Fasciola gigantica）和肝片吸虫（Fasciola hepatica）引起的一种人畜共患寄生虫病。该病主要感染反刍动物和人,是一种食源性寄生虫病,受到感染的动物或人表现为急性肝炎、慢性肝纤维化、胆管炎等,严重时能造成动物的大量死亡,对人类及畜牧业的危害十分严重。目前对于该病的防控主要依赖于药物治疗,因此,对于该病的诊断、尤其是早期诊断尤为重要,能够做到早诊断、早治疗,就能减少该病对人类及动物健康的危害,降低畜牧业的经济损失。片形吸虫病的诊断研究一直是该领域的研究热点。目前临床上主要采用的经典粪便虫卵镜检法不能应用于片形吸虫病的早期诊断;国际上虽然存在几种较好的免疫学诊断方法,但是其诊断抗原多为虫体纯化的天然混合抗原,成本高,具有一定交叉反应。为解决这一重要难题,本课题在前期的蛋白组学的基础上,通过生物信息学方法筛选到一些候选的诊断靶标,通过原核表达、蛋白纯化、Western bloting对诊断靶标进行筛选及评价,并筛选到一个新组织蛋白酶（命名为CL7）,建立了间接ELISA方法,并用该方法对田间样品进行了检测。随后对筛选的诊断靶标蛋白CL7进行单克隆抗体及多克隆抗体制备,进而建立了双抗夹心ELISA方法,用于检测片形吸虫的循环抗原,以达到片形吸虫病的早期诊断的目的。具体内容概述如下:1.诊断靶标的筛选、表达纯化及间接ELISA方法的建立和优化本研究选取 Annexin（Ann）、Leucine aminopeptidase（LAP）、CUB domain protein（CUB）以及一个命名为CathepsinL7（CL7）新的组织蛋白酶家族成员的蛋白基因进行分子克隆、载体构建、体外原核表达,蛋白纯化,用Western bloting对四个诊断靶标进行筛选及评价,随后以四种蛋白为包被抗原建立相应的间接ELISA（indirect enzyme linked immunoabsordent assay iELISA）方法以筛选最佳诊断靶标。使用片形吸虫感染的羊阳性血清和健康羊阴性血清用来评价其敏感性,结果表明:Ann、CUB敏感性（SEN）较低;LAP、Ann+LAP、CL7的敏感性较高。使用片形吸虫感染的羊阳性血清（n=16）和其他常见寄生虫阳性血清（n=16）,进行交叉反应,结果显示CL7特异性（SPE）最高,其他二者次之。在四个靶标蛋白中CL7是最有潜力的。2.CL7生物信息学分析、单克隆抗体的制备及夹心ELISA方法的建立本实验首次对CL7基因进行研究,通过生物信息学分析,证明其属于CL家族一员（组织蛋白酶L）,因此命名为（CL7）,并将其基因序列上传GenB ank,基因号:MN150457。同时本文对CL7还进行结构域分析、建模和可靠性3D建模。为建立适用于早期诊断的夹心ELISA（sandwich ELISA sELISA）方法,以CL7作为免疫原分别免疫小鼠和新西兰兔,成功获得11株CL7单克隆抗体（mAbs）和兔多克隆抗体。选取四株高滴度单抗:2B5、3B10、5A2、9H9进行小鼠腹水的制备、纯化、效价测定,亚型表位鉴定。结果表明:2B5、3B10、5A2、9H9分别属:IgG1、IgG2b、IgG1、IgG3,叠加ELISA结果显示2B5与5A2识别相似或相同表位,3B10与9H9识别相似或相同表位。用2B5和3B10与兔多克隆抗体进行组合,建立多种sELISA方法。对比发现CL7单抗2B5与兔多抗组合建立的sELISA效果最佳。并对该CL7 sELISA建立标准曲线,用于循环抗原CL7的定量分析。经ROC统计分析显示:CL7 sELISA对片形吸虫感染羊血清（n=12）检测下线为1.087ng/mL（Cut-off:0.4115）,并将上述阳性血清用于SEN与SPE的评估,结果表明二者均达到100%,CL7 sELISA检测不同感染期水牛的阳性（3-7感染周）、阴性血清时,检测下线为2.009 ng/mL（Cut-off:0.4845）,SPE达到100%,SEN达到93.75%。因此CL7 sELISA可应用于反刍动物片形吸虫的早期诊断。综上所述,本实验成功表达了四种片形吸虫重组蛋白,发现了一个良好的诊断靶标蛋白CL7,并建立了一种可以用于早期诊断的sELISA方法,对片形吸虫的诊断具有重要的应用价值。
赵鹏飞[7]（2021）在《紫草素/双硫仑仿生递药系统的构建及脑胶质瘤治疗的研究》文中研究说明肿瘤代谢与微环境之间的互动是影响脑胶质瘤进程的重要因素。肿瘤免疫微环境（Tumor immune microenvironment,TIME）中包含基质细胞、成纤维细胞、免疫细胞等多种成分,且处于有利于肿瘤发展的免疫抑制状态。肿瘤细胞主要通过糖酵解的代谢模式供能,伴随免疫抑制代谢物（如:乳酸等）的产生,进一步有利于免疫抑制环境的形成,加速肿瘤的生长。许多化疗药物可以诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡（Immunogenic cell death,ICD）,产生特异性的肿瘤新抗原,激活局部免疫,从而特异性杀伤肿瘤细胞实现免疫治疗。因此,通过调控肿瘤细胞代谢和诱导ICD重编程TIME是解除免疫耐受的重要策略,对于研究新型的脑肿瘤疗法具有潜在的应用价值。本研究通过乳化-高压均质法制备了一种基于白蛋白和乳铁蛋白的仿生嵌合纳米给药系统用于共递送双硫仑和紫草素,实现脑胶质瘤靶向和治疗。紫草素是来源于中药紫草的主要活性成分,它是糖酵解的关键酶——丙酮酸激酶同工酶2（Pyruvate kinase isozyme type M2,PKM2）的抑制剂,可有效抑制肿瘤细胞糖酵解及乳酸产生,还能够诱导肿瘤细胞ICD引起肿瘤局部免疫反应。双硫仑是一种不可逆的乙醛脱氢酶（Acetaldehyde dehydrogenase,ALDH）抑制剂,本课题发现双硫仑可以有效地抑制ALDH1蛋白家族L1（ALDH1L1）,从而抑制肿瘤细胞能量供应的替代途径。同时,双硫仑具有FROUNT抑制作用,能够调控肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophages,TAMs）。因此,联合应用双硫仑和紫草素可通过抑制葡萄糖-糖酵解/叶酸-NADH-ATP代谢轴,激活肿瘤免疫反应,重编程TIME来治疗脑胶质瘤。为了实现脑部药物递送,设计了基于白蛋白/乳铁蛋白嵌合纳米共递药系统（BSA/LF NP）。研究结果表明,仿生白蛋白/乳铁蛋白嵌合纳米共递药系统通过多受体介导（SPARC和LRP-1）高效地穿透血脑屏障并蓄积于肿瘤部位。基于共递送策略,双硫仑和紫草素能以协同比例蓄积于脑胶质瘤部位,BSA/LFNP表现出最佳的脑胶质瘤靶向效果,其肿瘤药物蓄积较游离药物组提高了 10倍以上,较BSANP组提高了 1.6倍。机制研究表明,联合治疗能有效地抑制葡萄糖-糖酵解/叶酸-NADH-ATP代谢轴,耗竭肿瘤细胞内ATP并减少乳酸产生,同时紫草素诱导ICD效应能有效激活T细胞免疫,抑制调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）,以及双硫仑介导的TAMs调控,从而发挥免疫治疗的作用。本研究设计了一种白蛋白和乳铁蛋白嵌合共递药系统,通过多受体介导实现高效脑胶质瘤药物递送,并通过肿瘤代谢（葡萄糖-糖酵解/叶酸-NADH-ATP代谢轴）和免疫（SHK诱导的ICD激活免疫应答和DSF介导的巨噬细胞调控）的调控作用来治疗脑胶质瘤,为脑部肿瘤治疗提供了一种潜在的递药及治疗策略。
李丹[8]（2021）在《嗜水气单胞菌溶血素基因的功能及其作用机制的研究》文中研究说明嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）常导致鱼虾等水生生物患病,这不仅给沿海地区的经济造成损失,且制约水产养殖业的长久可持续发展。A.hydrophila的致病性是复杂、多因素的,主要通过产生和分泌相关毒力因子导致宿主患病。其中,溶血素基因（ahh1）在A.hydrophila感染宿主过程中起重要作用,阐释其功能及作用机理对于病害防治及疫苗开发具有现实意义。本课题首先通过原核表达获得重组溶血素蛋白,经Ni-NTA树脂纯化并通过尿素梯度透析获得纯化的复性溶血素蛋白。复性后的溶血素可在血平板上可形成溶血环,其溶血率最高为170%,蛋白稀释64倍时仍可检出溶血率为18%,表明溶血素具有较高活性。将溶血素免疫新西兰大白兔以制备高特异性的兔源溶血素多克隆抗体。为了检测溶血素的免疫效果,将溶血素免疫锦鲤后采集血清并检测超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）及过氧化氢酶（CAT）的活性变化,结果表明各免疫组血清酶活性在免疫初期变化较为明显,免疫14天达到最大值,此时与对照组相比,SOD活性高1.9倍,LZM活性高3.8倍,CAT活性1.7倍;其后各酶活性呈现波动变化,但仍显着高于对照组,表明溶血素具有较好的抗原性,可刺激机体产生免疫反应。为了深入探究溶血素感染宿主的分子机制,对感染溶血素14天的锦鲤脾脏进行转录组测序。筛选获得1982个差异表达基因（DEGs）,其中1083个基因表达量上调,899个基因表达量下调。其中,与炎症相关的IL-8、TLR5、CTSK、CXCL9等基因的表达水平显着上调,进一步分析发现DEGs主要富集于IL-17和Toll样受体等信号通路,表明溶血素的刺激可引发机体炎症反应,激活免疫系统;另一方面,分析发现MHC1、MHC2及STAT2等分子的表达量异常下调,提示溶血素在逃避宿主免疫方面发挥作用。随机选取7个免疫相关基因进行q RT-PCR实验以验证RNA-seq数据的准确性,结果表明候选基因的表达趋势与测序数据一致,表明测序数据准确可靠。为了研究溶血素基因的功能,利用CRISPR/Cas9技术构建溶血素敲除质粒:以BPK764为骨架载体偶联sg RNA元件及同源修复臂构建单质粒敲除系统;将含有靶位点的sg RNA表达质粒p Target F-ahh1,通过同源修复臂,运用CRISPR/Cas9系统偶联λ-Red重组酶构建双质粒敲除系统。结果显示单质粒/双质粒敲除载体构建成功,但有关于敲除质粒的转入方式及敲除效率的提高仍有待进一步研究。本论文的研究阐释了溶血素在锦鲤感染免疫中的功能,明确锦鲤对溶血素免疫应答的关键基因及通路,构建敲除ahh1基因的单质粒和双质粒系统。这不仅为深入解析溶血素的作用机制奠定了较好的理论基础,且对有效防控A.hydrophila引起的病害具有现实意义。
杜茜蕾[9]（2020）在《基于sfTSLP/1fTSLP平衡的麻芥巴布膏“经皮治肺”调控过敏性鼻炎的体内外研究》文中研究指明前期实验证明麻芥巴布膏“经皮治肺”的血药浓度虽低于口服给药组,但却有更好疗效,这可能是通过肺与皮肤之间特异的调节通路而实现的。TSLP是肺与皮肤炎症免疫的关键共性因子,其两种亚型lfTSLP与sfTSLP分别在促进炎症与抑制炎症反应方面起作用。基于此我们提出以下假说:麻芥巴布膏可能通过调节肺与皮肤sfTSLP/lfTSLP平衡,继而减轻Th2炎症,从而达到“经皮治肺”的良好疗效。目的1.揭示过敏性鼻炎状态下肺与皮肤sfTSLP/lfTSLP平衡的变化规律及联系。2.评价麻芥巴布膏在体内外对sfTSLP/lfTSLP平衡的影响,确证TSLP是麻芥巴布膏发挥“经皮治肺”疗效中的关键因子。3.通过探讨麻芥巴布膏是否通过调节sfTSLP/lfTSLP平衡影响上皮免疫系统发挥“经皮治肺”的效果,部分揭示“肺主皮毛”理论的现代生物学内涵。方法1.SPF级雌性6周龄C57BL/6J小鼠40只,体质量21-25g,适应性喂养3天,随机分为4组,每组10只:空白组（K）,空白+sfTSLP预处理组（KS）,模型组（M）,模型+sfTSLP预处理组（MS）。基础致敏阶段,第0、7、14天模型组与模型+sfTSLP预处理组小鼠腹腔注射OVA基础致敏溶液,0.1ml/只,空白组与空白+sfTSLP预处理组小鼠予以等体积PBS注射。激发致敏与给药阶段,第15-30天预处理组小鼠每次激发致敏前1h给予sfTSLP多肽溶液滴鼻处理,40μl/只,其他组不做处理。预处理1h后,模型组与模型+sfTSLP预处理组小鼠鼻内滴入OVA激发致敏溶液,40μL/只,空白组与空白+sfTSLP预处理组小鼠予以等体积PBS滴鼻。第22、30天（激发致敏后7天、末次激发致敏）观察滴鼻1min内小鼠的挠鼻次数,并记录小鼠的一般状态。取小鼠鼻、肺组织做HE染色,ELISA法检测血清IgE,TSLP含量,RT-PCR法检测小鼠肺组织TSLP,TNF-α,IL-4,IL-5,IL-13 基因表达情况。2.普通级雌性4周龄新西兰大白兔4只,体质量2.3-2.5kg,适应性喂养3天,同一组2只。初次免疫用弗氏完全佐剂混合,加强免疫用弗氏不完全佐剂混合。每两周免疫一次,每只兔子免疫4个部位。初次免疫每个部位注射量为200μl,加强免疫每个部位注射量为100μl。三免、四免后耳静脉采血间接ELISA检测抗血清效价,抗血清纯化后Dot Blot检测其特异性。3.人支气管上皮细胞株16HBE细胞,用DMEM高糖培养基+10%胎牛血清（FBS）+1%青霉素-链霉素混合液培养,取对数生长期16HBE细胞,CCK8法检测不同浓度麻芥巴布膏水煎液对16HBE细胞活性的影响;经细胞计数后调整细胞浓度为1×106个/ml,按6孔板每孔2ml、12孔板每孔1ml接种。细胞接种12h后,镜下观察细胞已贴壁生长,则弃去原细胞培养液,按实验分组更换混合不同浓度OVA溶液或HDM溶液的细胞培养液,继续培养6-24h。RT-PCR法检测过敏性鼻炎细胞模型目的基因lfTSLP和sfTSLP 含量。结果1.模型+sfTSLP预处理组小鼠挠鼻次数明显少于模型组（P<0.01）,一般活动状态也好于模型组;空白组和空白+sfTSLP预处理组未见明显异常。鼻粘膜HE染色模型+sfTSLP预处理组小鼠较之模型组有明显改善,未见有明显的鼻黏膜假复层纤毛柱状上皮增厚和粘液腺体增生,仅见有周围组织轻度水肿和少许炎性细胞浸润,空白组与空白+sfTSLP预处理组小鼠鼻黏膜组织生长状态正常;肺组织HE染色模型+sfTSLP预处理组小鼠较之模型组有明显改善,支气管粘膜上皮周围组织水肿明显减轻,炎细胞数量明显减少,偶尔可见有轻度充血红肿的肺泡,肺泡内可见少量以淋巴细胞为主的炎性细胞,空白组与空白+sfTSLP预处理组小鼠支气管粘膜上皮及肺泡组织状态正常。血清IgE及TSLP含量,肺组织TSLP、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13基因表达结果显示,与空白组相比,模型组明显增高,差异具有统计学意义（P<0.01）;与模型组相比,模型+sfTSLP预处理组明显降低,差异具有统计学意义（P<0.01）,空白组与空白+sfTSLP预处理组差异无统计学意义。2.第一组免疫兔抗血清三免效价检测结果显示兔A抗血清效价在0K,兔B抗血清效价在0K;四免效价检测结果显示兔A抗血清效价在0K,兔B抗血清效价在0K。第二组免疫兔抗血清四免效价检测结果显示兔C血清效价在0K,兔D抗血清效价在0K,抗血清纯化后Dot Blot检测为阴性。3.当麻芥巴布膏水煎液浓度为1mg/ml时,16HBE细胞活性较正常组略有升高,差异具有统计学意义（P<0.01）,该浓度下麻芥巴布膏水煎液具有促进细胞生长的作用,可用于后续麻芥巴布膏的治疗研究。ELISA试剂盒检测两种细胞模型上清液未能检测出TNF-α有效含量,多次RT-PCR检测均未能得出sfTSLP及lfTSLP基因表达的有效信号。结论1.sfTSLP对OVA诱导过敏性鼻炎小鼠支气管及鼻黏膜组织具有良好的保护作用,且sfTSLP对正常小鼠无明显作用。2.sfTSLP能够显着降低OVA诱导过敏性鼻炎小鼠Th2相关炎症因子含量,并减轻由TSLP（lfTSLP）介导的Th2型炎症反应。3.对lfTSLP多克隆抗体的制备和过敏性鼻炎细胞模型的建立进行了探索。
张晓寒[10]（2020）在《环境中有机污染物的生物分析新方法的研究及应用》文中研究说明随着经济与工业的快速发展,一些有机污染物,如多溴二苯醚、多环麝香以及多环芳烃等,随着人类生产活动的排放目前已呈世界性分布。这些污染物多伴有潜在的持久性、生物累积性和毒理效应等。国内外研究学者们分别建立了多种检测方法来分析检测以上有机污染物,例如GC-ECD、GC-MS、HPLC等。传统仪器分析方法对仪器配置有极高要求,且存在检测周期长和成本高等问题。近年来,生物分析检测技术逐渐成为了高灵敏、微量、快速的检测手段。但是,对于以上有机污染物的生物分析法研究,仅有针对多溴二苯醚的酶联免疫吸附法有所报导;多环麝香相关免疫分析研究工作尚为空白;而多环芳烃的总体分析、评估方面,毒性当量评估、免疫分析手段等尚存在不足。因此,结合研究现状,为克服现有检测、评估方法的不足,建立针对不同有机污染物的高灵敏、简单、快捷的新型生物分析方法将具有重要研究意义与应用前景。本文首先以典型低溴代四溴二苯醚BDE-47和人工合成多环麝香的代表吐纳麝香AHTN为免疫分析研究对象,设计了新型、简便的合成路线并制备了相应的半抗原。半抗原经红外光谱和核磁共振氢谱表征后,与BSA、OVA载体蛋白偶联,最终制备了BDE-47和AHTN的人工免疫原与包被原。经免疫实验后,从兔血清中提取并纯化得到抗BDE-47和抗AHTN的多克隆抗体。最终建立了间接竞争生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附法（BS-ELISA）、基于新型复合探针的间接竞争ELISA、直接竞争实时荧光定量免疫PCR等新型免疫分析方法用于实际样品中BDE-47与AHTN的分析,并将免疫分析测定结果分别与GC-ECD、GC-MS方法对比,以考察免疫分析新方法结果的准确性。间接竞争BS-ELISA方法建立时,优化了基本检测条件与基质效应等因素。在优化条件下:测定AHTN时线性工作范围为0.092～5.93ng/m L;IC50=0.74 ng/m L;检测下限为0.046 ng/m L。测定BDE-47时线性工作范围为0.04～7.85 ng/m L;IC50=0.56 ng/m L;检测下限为0.02ng/m L。两种方法的板内、板间变异系数?15%,方法重复性较好。实际样品测定结果分别与GC-MS、GC-ECD测定结果相关性好,样品加标回收率分别为88.0%～110.3%（AHTN）、89.3%～106.8（BDE-47）;变异系数分别为5.2%～8.6%（AHTN）、1.7%～8.2%（BDE-47）;可实现高通量测定。采用BS-ELISA监测了上海闵行区PM2.5中BDE-47的浓度,分析了BDE-47/PM2.5和大气常规污染物浓度的时空变化,结论如下:BDE-47的排放过程可能伴随有NO2的排放;工厂、车辆以及人类活动等可能是BDE-47排放的主要贡献者,但不是此区域大气颗粒物PM2.5的主要排放者。基于复合探针的间接竞争ELISA测定BDE-47,采用预先制备的了复合探针取代传统的酶标二抗,增加了酶信号量,提高方法灵敏性。在优化条件下,新方法测定BDE-47的线性工作范围为0.016～5.11ng/m L,IC50=0.284 ng/m L,IC10=0.0059 ng/m L。新方法测定实际样品的结果与GC-MS测定结果相关性好;与传统间接竞争ELISA法比,新型免疫分析的检测下限降低了约20倍。样品加标回收率为86.5%～104%;变异系数为3.6%～10.2%,方法重复性较好。建立基于复合探针的直接竞争实时荧光免疫PCR方法中,分别采用抗AHTN抗体-金纳米颗粒（AuNPs）、抗BDE-47抗体-碳纳米管（CNTs）制备生物探针,建立了直接竞争AuNPs-rt-iPCR法测定AHTN、直接竞争CNTs-rt-iPCR法测定BDE-47。在优化条件下,直接竞争AuNPs-rt-iPCR测定AHTN时在1 pg/L～10 ng/L时线性关系良好,检出限1.73 pg/L。样品加标回收率和变异系数分别为84.6%～105.2%、2.8%～10.3%。直接竞争CNTs-rt-iPCR测定BDE-47浓度在5pg/L～0.5ng/L时线性关系良好,检出限约为1 pg/L。样品加标回收率和变异系数分别为83.4%～110.3%、3.2%～16.7%。两种新方法的测定结果与GC-MS或GC-ECD均有较好相关性;且新方法的变异系数均小于20%,重复性良好。本文采用了新型第三代重组小鼠肝癌细胞H1L7.5c1,建立了基于多环芳烃毒理学机制的基于芳香烃受体通路的化学活化荧光素酶报告基因法（AhR-CALUX）。优化了细胞接种个数、培养基、培养时间等因素的影响。在优化条件下,BaP作为标准物质,其EC50约为1.099±0.195 n M,EC25约为0.345±0.078 n M,该测定法可以检测出BaP当量浓度大于3×10-11M的情况。方法的板内变异系数为1.35%～16.20%;板间变异系数为1.81%～23.92%;方法重复性好,可用于实际水体样品中痕量多环芳烃的分析。与传统仪器分析方法相比,本文建立的新免疫分析方法具有特异性好、灵敏度高、简单、快捷等优点,有益于实现环境中痕量有机污染物的高通量检测。对于多环芳烃总体评估,国内外研究学者们采用传统仪器（例如HPLC等）测定每一种多环芳烃浓度后,与其对应毒性当量因子相乘后求得总和为其毒性当量（TEQ）,但此法忽略了污染物之间的协同或拮抗作用。本文新建的AhR-CALUX分析方法可以直接用于测定总体的生物分析当量,方法更加准确、简便、快捷。新型生物分析法可用于BDE-47,AHTN和PAHs有机污染物的检测,不仅具有快速、高通量筛选的特点,还具有良好的应用前景。
二、用实验动物制备多克隆抗体Ⅰ.免疫方案的优化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用实验动物制备多克隆抗体Ⅰ.免疫方案的优化（论文提纲范文）
（1）基于AuNPs-寡聚核苷酸探针的草甘膦免疫学检测技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 草甘膦研究进展 |
| 1.1 草甘膦简介 |
| 1.2 GLYP的残留现状 |
| 1.3 GLYP的毒性及危害 |
| 1.4 国内外GLYP最大残留限量标准 |
| 1.5 GLYP检测方法的研究进展 |
| 1.5.1 色谱法 |
| 1.5.2 毛细管电泳分析法 |
| 1.5.3 光谱法 |
| 1.5.4 电化学检测方法 |
| 1.5.5 FRET荧光分析法 |
| 1.5.6 免疫学分析方法 |
| 第2章 金纳米粒子的特性及在检测中的应用 |
| 2.1 尺寸可调性 |
| 2.2 分散稳定性 |
| 2.3 光电特性 |
| 2.4 荧光特性 |
| 2.4.1 光致发光金纳米团簇 |
| 2.4.2 荧光淬灭剂 |
| 第3章 寡聚核苷酸自组装的DNA纳米结构 |
| 3.1 DNA纳米技术 |
| 3.2 DNA纳米结构自组装策略 |
| 3.2.1 树枝状DNA自组装 |
| 3.2.2 DNA瓦片自组装 |
| 3.2.3 DNA折纸自组装 |
| 3.2.4 DNA砖自组装 |
| 3.3 四面体DNA纳米结构的特点及应用 |
| 3.3.1 四面体DNA纳米结构的特点 |
| 3.3.2 四面体DNA在纳米医学中的应用 |
| 3.3.3 四面体DNA在检测中的应用 |
| 第4章 纳米粒子-寡聚核苷酸探针在生物传感中的应用 |
| 4.1 电化学检测方法 |
| 4.2 纳米耀斑探针介导的荧光检测方法 |
| 4.3 基于纳米材料的条形码检测方法 |
| 4.3.1 银沉积型条形码检测 |
| 4.3.2 PCR扩增型条形码检测 |
| 4.4 AuNPs-寡聚核苷酸探针在免疫学检测中的优势 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 GLYP完全抗原的合成与鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂与耗材 |
| 1.1.2 主要仪器与设备 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 阳离子化BSA的制备 |
| 1.2.2 c BSA的纯化及浓缩 |
| 1.2.3 c BSA的鉴定 |
| 1.2.4 GLYP免疫抗原的合成 |
| 1.2.5 GLYP检测抗原的合成 |
| 1.2.6 GLYP免疫抗原的双向琼脂糖凝胶电泳鉴定 |
| 1.2.7 GLYP检测抗原的Native-PAGE鉴定 |
| 1.2.8 GLYP完全抗原的UV-Vis光谱扫描鉴定 |
| 1.2.9 免疫小鼠 |
| 1.2.10 GLYP免疫抗原的鼠免疫血清效价检测 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 c BSA鉴定结果 |
| 1.3.2 GLYP完全抗原琼脂糖电泳和Native-PAGE鉴定结果 |
| 1.3.3 GLYP完全抗原UV-Vis光谱扫描鉴定结果 |
| 1.3.4 GLYP免疫抗原的免疫效果分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 载体蛋白的选择 |
| 1.4.2 完全抗原偶联方法的选择 |
| 1.4.3 UV-Vis吸收光谱鉴定完全抗原 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 GLYP多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂与耗材 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 动物免疫 |
| 2.2.2 兔血清效价检测 |
| 2.2.3 血清的采集与保存 |
| 2.2.4 抗体的纯化 |
| 2.2.5 抗体纯度与浓度鉴定 |
| 2.2.6 抗体的效价测定 |
| 2.2.7 抗体亲和力的测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 兔血清效价 |
| 2.3.2 多克隆抗体的纯度与浓度鉴定 |
| 2.3.3 抗体效价检测结果 |
| 2.3.4 抗体亲和力测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 抗体纯化方法的选择 |
| 2.4.2 抗体亲和力的测定 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 ic-ELISA方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂与耗材 |
| 3.1.2 主要仪器与设备 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 抗原包被浓度及GLYP抗体作用浓度的选择 |
| 3.2.2 抗原包被条件的选择 |
| 3.2.3 封闭液的选择 |
| 3.2.4 GLYP抗体作用条件的选择 |
| 3.2.5 酶标二抗作用条件的选择 |
| 3.2.6 酶底物作用条件的选择 |
| 3.2.7 标准曲线的建立 |
| 3.2.8 交叉反应率的测定 |
| 3.2.9 样品的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 抗原包被浓度及最适多克隆抗体浓度的确定 |
| 3.3.2 抗原包被条件的确定 |
| 3.3.3 封闭液的确定 |
| 3.3.4 GLYP抗体作用条件的确定 |
| 3.3.5 酶标二抗作用条件的确定 |
| 3.3.6 酶底物作用条件的确定 |
| 3.3.7 优化后的ic-ELISA检测程序 |
| 3.3.8 标准曲线 |
| 3.3.9 交叉反应率测定结果 |
| 3.3.10 精密度和准确度评价 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 基于AuNP-TDNs纳米耀斑探针的间接竞争荧光免疫分析方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂与耗材 |
| 4.1.2 主要仪器与设备 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 AuNPs的制备 |
| 4.2.2 TDNs的组装 |
| 4.2.3 TDNs的鉴定 |
| 4.2.4 AuNP-TDNs纳米耀斑探针的制备 |
| 4.2.5 SG浓度优化 |
| 4.2.6 AuNP-TDNs纳米耀斑探针的表征 |
| 4.2.7 检测条件的优化 |
| 4.2.8 标准曲线的建立 |
| 4.2.9 交叉反应率的测定 |
| 4.2.10 实际样品的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 TDNs的FRET鉴定结果 |
| 4.3.2 TDNs的Native-PAGE鉴定结果 |
| 4.3.3 最适SG浓度优化结果 |
| 4.3.4 AuNPs对TDNs-SG的荧光淬灭效率 |
| 4.3.5 AuNP-TDNs-SG探针的表征结果 |
| 4.3.6 检测条件优化结果 |
| 4.3.7 优化后的检测程序 |
| 4.3.8 标准曲线 |
| 4.3.9 交叉反应率测定结果 |
| 4.3.10 精密度和准确度评价 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 影响纳米耀斑探针的因素 |
| 4.4.2 Stern-Volumer曲线的线性和非线性 |
| 4.4.3 凝胶染色方法的选择 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 基于AuNP-dsDNA纳米耀斑探针的竞争荧光免疫分析方法的建立 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂与耗材 |
| 5.1.2 主要仪器与设备 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 AuNPs的制备 |
| 5.2.2 AuNP-dsDNA纳米耀斑探针的制备 |
| 5.2.3 AuNP-dsDNA纳米耀斑探针的表征 |
| 5.2.4 检测条件的优化 |
| 5.2.5 标准曲线的建立 |
| 5.2.6 交叉反应率的测定 |
| 5.2.7 实际样品的检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 AuNP-dsDNA探针的表征结果 |
| 5.3.2 检测条件优化结果 |
| 5.3.3 优化后的检测程序 |
| 5.3.4 标准曲线 |
| 5.3.5 交叉反应结果 |
| 5.3.6 精密度和准确度评价 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 凝胶染色方法的选择 |
| 5.4.2 硫醇化DNA对 AuNPs的修饰方法 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 基于双功能化AuNPs的条形码扩增检测方法的建立 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 主要试剂与耗材 |
| 6.1.2 主要仪器与设备 |
| 6.1.3 主要溶液配制 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 AuNPs的制备 |
| 6.2.2 AuNPs探针的制备 |
| 6.2.3 AuNPs探针制备条件的优化 |
| 6.2.4 AuNPs和 AuNP探针的表征 |
| 6.2.5 AuNP-BB-iPCR方法的优化 |
| 6.2.6 检测标准曲线的建立 |
| 6.2.7 交叉反应率的测定 |
| 6.2.8 实际样品的检测 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 AuNPs探针合成的最适抗体标记量 |
| 6.3.2 AuNPs探针合成的最适p H |
| 6.3.3 制备AuNPs探针capture DNA最适标记浓度的优化 |
| 6.3.4 AuNPs和AuNPs探针的TEM表征结果 |
| 6.3.5 AuNPs和AuNPs探针的UV-Vis表征结果 |
| 6.3.6 AuNPs探针上抗体标记量的确定 |
| 6.3.7 AuNPs探针上signal DNA标记量的确定 |
| 6.3.8 最适封闭剂 |
| 6.3.9 包被抗原和探针的最适浓度 |
| 6.3.10 优化后的AuNP-BB-iPCR检测程序 |
| 6.3.11 标准曲线 |
| 6.3.12 交叉反应结果 |
| 6.3.13 精密度和准确度评价 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 DNA序列的设计和探针制备条件的选择 |
| 6.4.2 Signal DNA扩增方式的选择 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（2）胞内劳森菌抗原候选蛋白表达及ELISA方法建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪增生性肠炎概述 |
| 1.1.1 胞内劳森氏菌病原学 |
| 1.1.2 流行特点 |
| 1.1.3 致病机制 |
| 1.1.4 临床症状 |
| 1.1.5 病理变化 |
| 1.1.6 检测方法 |
| 1.1.7 防控 |
| 1.2 立题目的与意义 |
| 第二章 胞内劳森氏菌抗原候选蛋白表达及纯化与复性 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌种、载体和细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验室仪器设备 |
| 2.1.4 主要溶液及培养基配制 |
| 2.2 方法及步骤 |
| 2.2.1 胞内劳森氏菌抗原候选蛋白的筛选 |
| 2.2.2 引物设计及合成 |
| 2.2.3 基因组提取 |
| 2.2.4 目的序列PCR扩增 |
| 2.2.5 重组质粒的构建 |
| 2.2.6 重组质粒酶切鉴定及测序 |
| 2.2.7 阳性菌液的获取 |
| 2.2.8 重组蛋白诱导表达及鉴定 |
| 2.2.9 重组蛋白的纯化及复性 |
| 2.2.10 Western blot试验鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 抗原候选蛋白的生物学分析 |
| 2.3.2 目的基因的扩增 |
| 2.3.3 重组质粒的构建 |
| 2.3.4 重组蛋白表达及鉴定 |
| 2.3.5 重组蛋白的纯化及复性 |
| 2.3.6 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 胞内劳森氏菌重组蛋白鉴定及免疫活性分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验室仪器设备 |
| 3.1.4 实验动物 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 兔阳性血清获取 |
| 3.2.2 鼠阳性血清获取 |
| 3.2.3 重组蛋白抗原性分析 |
| 3.2.4 多克隆抗体制备 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 兔阳性血清制备 |
| 3.3.2 鼠阳性血清制备 |
| 3.3.3 重组蛋白验证及抗原性分析 |
| 3.3.4 重组蛋白多克隆抗体制备 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 胞内劳森氏菌间接ELISA方法的建立及应用 |
| 4.1 鼠间接ELISA方法的建立及应用 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法与步骤 |
| 4.1.3 结果 |
| 4.1.4 讨论 |
| 4.2 猪血清中抗LI抗体检测的间接ELISA方法建立及应用 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法与步骤 |
| 4.2.3 结果 |
| 4.2.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）诺氟沙星抗体的制备及超灵敏检测技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 抗生素滥用 |
| 1.2 抗生素危害 |
| 2 诺氟沙星概述 |
| 2.1 诺氟沙星简介 |
| 2.2 诺氟沙星的作用 |
| 2.3 诺氟沙星的危害 |
| 3 研究进展 |
| 3.1 高效液相色谱法 |
| 3.2 微生物测定法 |
| 3.3 免疫分析法 |
| 4 研究内容和技术路线 |
| 4.1 研究内容 |
| 4.2 技术路线 |
| 第一部分 抗诺氟沙星小分子抗体的制备 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 3.1 完全抗原的制备 |
| 3.2 多克隆抗体的制备及纯化 |
| 4 结果 |
| 4.1 完全抗原合成 |
| 4.2 效价测定结果 |
| 4.3 抗体鉴定 |
| 4.4 抗体与小分子最佳结合浓度测定 |
| 5 小结 |
| 第二部分 化学发光法检测诺氟沙星技术的建立 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 3.1 半抗原生物素化 |
| 3.2 条件的优化 |
| 3.3 诺氟沙星检测技术的建立 |
| 3.4 特异性验证 |
| 4 结果 |
| 4.1 诺氟沙星-生物素鉴定 |
| 4.2 条件优化 |
| 4.3 氟喹诺酮类药物的含量测定 |
| 4.4 特异性测定 |
| 5 小结 |
| 第三部分 荧光、可视双读数检测诺氟沙星技术的建立 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 3.1 生物素标记合成 |
| 3.2 AuNPs,AuNPs@炔基和AuNPs@叠氮化物的制备 |
| 3.3 荧光和比色检测方法的建立 |
| 4 结果 |
| 4.1 AuNPs的描述,AuNPs@azi和AuNPs@alk表征 |
| 4.2 条件验证与优化 |
| 4.3 NOR样本检测 |
| 4.4 NOR特异性检测 |
| 5 小结 |
| 第四部分 检测方法的比对与验证 |
| 1 引言 |
| 2 方法 |
| 2.1 线性关系 |
| 2.2 精密度、准确度 |
| 2.3 回收率 |
| 3 结果 |
| 3.1 线性关系 |
| 3.2 精密度、准确度 |
| 3.3 回收率 |
| 4 与国标比较 |
| 5 小结 |
| 第五部分 讨论与展望 |
| 1 抗体制备 |
| 2 检测方法 |
| 3 方法比较 |
| 4 创新与不足 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 基于LSPR的比色法用于食品检测的研究进展 |
| 1 前言 |
| 2.原理及概况 |
| 2.1 LSPR基本概念和原理 |
| 2.2 比色技术的概念 |
| 2.3 金属纳米粒子概况 |
| 2.4 基于LSPR的比色法 |
| 3 基于LSPR比色法在食品安全中的应用 |
| 3.1 基于LSPR比色法在检测微生物方面的应用 |
| 3.2 基于LSPR比色法在检测毒素方面的应用 |
| 3.3 基于LSPR比色法在检测食品添加物方面的应用 |
| 4 讨论及展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读硕士期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（4）牛IRF7蛋白的表达及对牛病毒性腹泻病毒增殖的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究目的及意义 |
| 2 文献综述 |
| 2.1 牛病毒性腹泻病毒概述 |
| 2.2 BVDV与持续感染 |
| 2.3 抗病毒天然免疫概述 |
| 2.4 BVDV与天然免疫关系的研究 |
| 2.5 IRF7蛋白概述 |
| 2.6 IRF7的研究进展 |
| 3 研究内容与技术路线 |
| 3.1 研究内容 |
| 3.2 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 IRF7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 IRF7基因生物信息学分析 |
| 2.2 BoIRF7原核表达及蛋白纯化 |
| 2.3 IRF7兔多克隆抗体制备 |
| 3 讨论 |
| 3.1 BoIRF7生物信息学分析 |
| 3.2 BoIRF7蛋白原核表达系统优势 |
| 3.3 IRF7兔多克隆抗体制备 |
| 4 小结 |
| 试验二 BoIRF7真核表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 LV5-IRF7慢病毒载体的构建及鉴定 |
| 2.2 慢病毒系统质粒抽提 |
| 2.3 慢病毒包装 |
| 2.4 慢病毒滴度的测定 |
| 2.5 过表达/干扰慢病毒在MDBK细胞上的鉴定 |
| 2.6 IRF7-shRNA干扰效率的探索 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同转染方法的比较 |
| 3.2 慢病毒载体及其安全性 |
| 3.3 慢病毒包装 |
| 4 小结 |
| 试验三 BoIRF7蛋白对NCP BVDV病毒增殖的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 BVDV病毒感染宿主细胞后对BoIRF7表达的影响 |
| 2.2 BoIRF7过表达和干扰对BVDV病毒增殖的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 选用MDBK细胞的必要性 |
| 3.2 BoIRF7与BVDV病毒复制之间的关系 |
| 4 小结 |
| 第三章 全文总结 |
| 第四章 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录一 氨基酸序列 |
| 附录二 康为世纪超纯RNA提取试剂盒说明书 |
| 附录三 DH5α感受态细胞的制备 |
| 附录四 天根TIANGEN普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 |
| 附录五 天根TIANGEN质粒小提试剂盒说明书 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（5）β-丙内酯灭活肺炎支原体的安全性及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 肺炎支原体的培养及ELISA定量检测方法建立 |
| 引言 |
| 一、实验材料 |
| 1 支原体标准菌株、抗体 |
| 2 实验试剂和耗材 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 耗材 |
| 3 仪器及设备 |
| 二、实验方法 |
| 1 肺炎支原体大量培养及优化 |
| 1.1 菌株复苏 |
| 1.2 CCU和CFU计数 |
| 1.3 肺炎支原体的培养与收集优化 |
| 1.4 肺炎支原体的大量培养 |
| 2 肺炎支原体双抗体夹心ELISA检测方法的建立 |
| 2.1 单克隆抗体的制备 |
| 2.2 ELISA体系建立 |
| 三、实验结果 |
| 1.肺炎支原体大量培养及优化结果 |
| 2.肺炎支原体双抗体夹心ELISA检测方法的建立结果 |
| 2.1 鼠抗MP单克隆抗体纯化结果 |
| 2.2 双抗体夹心ELISA建立结果 |
| 2.3 MP标准品EU含量测定 |
| 四 本章小结 |
| 第二部分 甲醛和β-丙内酯灭活灭活肺炎支原体比较 |
| 前言 |
| 一、实验材料 |
| 1 实验动物 |
| 2 试剂和耗材 |
| 3 仪器设备 |
| 二、实验方法 |
| 1 甲醛和β-丙内酯灭活条件研究 |
| 1.1 菌体灭活条件研究 |
| 1.2 肺炎支原体的灭活及纯化 |
| 1.3 灭活样品蛋白含量测定 |
| 1.4 灭活样品抗原EU测定 |
| 1.5 灭活样品蛋白电泳检测 |
| 2 动物实验比较不同灭活条件免疫效果 |
| 2.1 灭活样品免疫BALB/c小鼠 |
| 2.2 小鼠采血及解剖 |
| 2.3 肺组织病理切片观察 |
| 2.4 肺灌洗液活菌计数 |
| 2.5 不同条件灭活样品兔疫后血清对肺炎支原体生长抑制抗体效价测定 |
| 三、实验结果 |
| 1 甲醛和β-丙内酯灭活条件结果 |
| 1.1 两种灭活剂不同浓度灭活时间的测定结果 |
| 1.2 不同条件灭活样品蛋白含量测定结果 |
| 1.3 不同条件灭活样品抗原EU测定结果 |
| 1.4 不同条件灭活样品蛋白电泳检测结果 |
| 1.5 Western-Blot结果 |
| 2 不同灭活条件动物实验免疫 |
| 2.1 不同灭活条件免疫效果 |
| 2.2 肺组织病理切片 |
| 2.3 肺灌洗液活菌计数 |
| 2.4 不同条件灭活样品免疫后血清对肺炎支原体生长抑制抗体效价结果 |
| 四 本章小结 |
| 第三部分 β-丙内酯灭活肺炎支原体动物免疫策略探索 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 1 肺炎支原体灭活样品制备 |
| 2 免疫剂量探索 |
| 3 免疫剂次探索 |
| 三、实验结果 |
| 1 动物免疫免疫剂量实验结果 |
| 1.1 不同免疫剂量小鼠血清抗体效价(GMT) |
| 1.2 不同免疫剂量小鼠血清IgG抗体水平 |
| 1.3 不同免疫剂量的MP清除率 |
| 1.4 组织病理切片观察结果 |
| 2 不同免疫剂次实验结果 |
| 2.1 不同免疫剂次小鼠血清IgG抗体水平 |
| 2.2 不同免疫剂次小鼠血清抗体效价GMT |
| 2.3 不同免疫剂次小鼠攻毒后MP清除率 |
| 2.4 组织病理组织切片观察 |
| 四 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 主要溶液及培养基的配制 |
| 综述 肺炎支原体的病原生物学研究进展 |
| 参考文献(References) |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）片形吸虫病早期诊断靶标的筛选及诊断方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫的生物学特征和生活史 |
| 1.1.1 片形吸虫的主要生物学特性 |
| 1.1.2 片形吸虫的生活史 |
| 1.2 片形吸虫病的临床表现和流行趋势及危害 |
| 1.2.1 片形吸虫病的临床表现 |
| 1.2.2 片形吸虫病的流行趋势及危害 |
| 1.3 片形吸虫病的治疗和预防 |
| 1.4 片形吸虫病诊断研究进展 |
| 1.4.1 经典方法 |
| 1.4.2 分子生物学诊断方法 |
| 1.4.3 免疫学诊断 |
| 1.5 片形吸虫诊断抗原研究进展 |
| 1.5.1 排泄分泌物抗原ESP |
| 1.5.2 脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding proteins FABP) |
| 1.5.3 谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase GST) |
| 1.5.4 鞘脂激活蛋白样蛋白(Saposin-like protein SAP) |
| 1.5.5 亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase LAP) |
| 1.5.6 组织蛋白酶(Cathepsin proteases CAT) |
| 1.5.7 其他抗原 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 第二章 诊断靶标的筛选、表达纯化及间接ELISA方法的建立和优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 载体与菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 肝片吸虫总RNA的提取 |
| 2.2.2 反转录步骤 |
| 2.2.3 引物的设计与合成 |
| 2.2.4 Ann CUB目的基因的合成 |
| 2.2.5 Ann CUB克隆载体的构建 |
| 2.2.6 Ann CUB表达载体的构建 |
| 2.2.7 Ann、CUB、CL7、LAP原核表达和纯化 |
| 2.2.8 Ann、CUB、LAP、CL7 Western blotting免疫反应性分析 |
| 2.2.9 筛选最佳抗原靶标 |
| 2.2.10 计算统计 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Ann、CUB目的基因的合成和Ann、CUB、CL7双酶切鉴定 |
| 2.3.2 Ann、CUB、LAP、CL7表达载体测序结果 |
| 2.3.3 Ann、CUB、LAP、CL7重组蛋白的表达和纯化 |
| 2.3.4 Ann、CUB、LAP、CL7重组蛋白的免疫反应性 |
| 2.3.5 Ann、CUB、LAP、CL7多种间接ELISA方法建立 |
| 2.3.6 LAP、Ann+LAP、CL7三种ELISA方法特异性实验 |
| 2.3.7 CL7 iELISA方法的评价 |
| 2.3.8 CL7 iELISA方法田间样本检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 CL7单克隆抗体的制备及夹心ELISA方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与细胞 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 CL7抗原的序列上传和生物学分析 |
| 3.2.2 BALB/c小鼠免疫 |
| 3.2.3 鼠单克隆抗体制备 |
| 3.2.4 单抗腹水制备和纯化 |
| 3.2.5 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.2.6 兔多克隆抗体制备 |
| 3.2.7 夹心ELISA方法的建立 |
| 3.2.8 夹心ELISA方法的评价 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CL7生物学分析 |
| 3.3.2 CL7单克隆抗体的制备 |
| 3.3.3 CL7兔多克隆抗体制备 |
| 3.3.4 CL7夹心ELISA方法的建立和评价 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（7）紫草素/双硫仑仿生递药系统的构建及脑胶质瘤治疗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脑胶质瘤的研究现状 |
| 1.2 脑胶质瘤免疫疗法研究进展 |
| 1.3 传统中医药在治疗肿瘤上的独特优势 |
| 1.4 双硫仑概述 |
| 1.5 肿瘤细胞能量代谢的替代途径 |
| 1.6 基于营养转运蛋白的仿生脑靶向策略 |
| 1.6.1 基于白蛋白的仿生递药 |
| 1.6.2 基于乳铁蛋白的仿生递药 |
| 第二章 目标代谢酶基因表达的生信分析与联合治疗方案的优化 |
| 2.1 材料和仪器 |
| 2.1.1 仪器及试剂 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 基因表达差异分析 |
| 2.2.2 基因表达与生存状态相关性分析 |
| 2.2.3 胶质瘤细胞系和正常脑细胞系基因表达差异 |
| 2.2.4 肿瘤组织和正常组织中蛋白表达差异验证 |
| 2.2.5 DSF和SHK的酶抑制活性 |
| 2.2.6 联合治疗最佳比例确定 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 2.3 实验结果及讨论 |
| 2.3.1 基因表达差异及其与生存状态相关性分析 |
| 2.3.2 表达差异在小鼠胶质瘤组织上的验证 |
| 2.3.3 肿瘤细胞系上验证DSF和SHK的代谢酶抑制活性 |
| 2.3.4 最佳联合用药比例的确定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 仿生递药策略设计及白蛋白/乳铁蛋白嵌合纳米粒的制备和表征 |
| 3.1 仪器与材料 |
| 3.1.1 材料与试剂 |
| 3.1.2 仪器 |
| 3.1.3 细胞系 |
| 3.1.4 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Cy5-BSA与Cy5-LF合成与纯化 |
| 3.2.2 纳米粒(未载药)制备 |
| 3.2.3 纳米载体的体内药动学研究 |
| 3.2.4 纳米载体的体内靶向性研究 |
| 3.2.5 体外药物分析方法的确立 |
| 3.2.6 白蛋白/乳铁蛋白嵌合纳米粒的制备 |
| 3.2.7 纳米粒的表征 |
| 3.2.8 统计分析 |
| 3.3 实验结果及讨论 |
| 3.3.1 仿生递药策略设计 |
| 3.3.2 药物的体外分析方法 |
| 3.3.3 纳米粒的影响因素 |
| 3.3.4 BOX-Behnken试验优化纳米粒处方 |
| 3.3.5 纳米粒的表征 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 白蛋白/乳铁蛋白嵌合纳米粒的体外抗肿瘤研究 |
| 4.1 材料和仪器 |
| 4.1.1 材料和试剂 |
| 4.1.2 仪器 |
| 4.1.3 细胞系 |
| 4.1.4 实验动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞摄取实验 |
| 4.2.2 肿瘤细胞增殖抑制实验 |
| 4.2.3 药物诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡 |
| 4.2.4 免疫原性细胞死亡刺激树突状细胞成熟 |
| 4.2.5 免疫原性细胞死亡激活T细胞免疫 |
| 4.2.6 乳酸抑制DC细胞成熟和T细胞免疫激活 |
| 4.2.7 嵌合纳米粒调控M2型巨噬细胞 |
| 4.2.8 纳米粒调控肿瘤细胞的能量代谢 |
| 4.2.9 统计分析 |
| 4.3 实验结果及讨论 |
| 4.3.1 细胞摄取 |
| 4.3.2 肿瘤细胞增殖抑制活性 |
| 4.3.3 药物诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡 |
| 4.3.4 免疫原性细胞死亡刺激树突状细胞成熟 |
| 4.3.5 免疫原性细胞死亡激活T细胞免疫 |
| 4.3.6 乳酸抑制DC成熟和T细胞免疫 |
| 4.3.7 纳米粒调控M2型巨噬细胞 |
| 4.3.8 纳米粒调控肿瘤细胞的能量代谢 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 白蛋白/乳铁蛋白嵌合纳米粒的体内药效学研究 |
| 5.1 材料和仪器 |
| 5.1.1 材料和试剂 |
| 5.1.2 仪器 |
| 5.1.3 细胞系 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 BSA/LFNP体内分布 |
| 5.2.2 肿瘤组织内纳米粒与营养转运蛋白共定位 |
| 5.2.3 药物组织内分布 |
| 5.2.4 体内药效学研究 |
| 5.2.5 肿瘤组织中免疫细胞亚群检测 |
| 5.2.6 肿瘤组织中乳酸和ATP检测 |
| 5.2.7 肿瘤代谢和免疫互动调控验证 |
| 5.2.8 统计分析 |
| 5.3 实验结果及讨论 |
| 5.3.1 体内分布 |
| 5.3.2 脑组织中纳米粒与营养转运蛋白的共定位 |
| 5.3.3 药物在肿瘤组织内分布 |
| 5.3.4 体内药效学研究 |
| 5.3.5 肿瘤组织中的免疫细胞分析 |
| 5.3.6 肿瘤组织中的ATP水平变化 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 仿生白蛋白递药系统治疗耐药非小细胞肺癌脑转移 |
| 6.1 材料和仪器 |
| 6.1.1 试剂与材料 |
| 6.1.2 仪器 |
| 6.1.3 细胞系 |
| 6.1.4 实验动物 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 联合治疗方案的优化 |
| 6.2.2 纳米粒制备与表征 |
| 6.2.3 体外细胞实验 |
| 6.2.4 纳米粒的体内分布 |
| 6.2.5 纳米粒的体内药效及抗肿瘤机制研究 |
| 6.2.6 巨噬细胞介导的抗耐药疗法 |
| 6.2.7 统计分析 |
| 6.3 实验结果及讨论 |
| 6.3.1 耐药性验证级最佳联用比例的确定 |
| 6.3.2 纳米粒的表征 |
| 6.3.3 细胞摄取研究 |
| 6.3.4 体外抗肿瘤活性 |
| 6.3.5 药物对巨噬细胞表型和功能的调控 |
| 6.3.6 体内分布 |
| 6.3.7 肿瘤组织内纳米粒与营养转运蛋白共定位 |
| 6.3.8 皮下瘤模型体内药效学及抗肿瘤机制研究 |
| 6.3.9 脑转移瘤模型的药效学及抗肿瘤机制研究 |
| 6.3.10 安全性初步评价 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 结论及创新性分析 |
| 7.1. 全文讨论 |
| 7.2. 创新性分析 |
| 7.3. 研究结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 符号/缩略词说明 |
| 附录二 研究涉及的溶液/试剂配方 |
| 附录三 Western blot及定磷法具体步骤 |
| 附录四 药物组织分布方法学研究 |
| 附录五 脑胶质瘤和正常脑组织中ALDH1L1及PKM2表达数据 |
| 附录六 脑胶质瘤患者ALDH1L1表达及生存期数据 |
| 附录七 脑胶质瘤患者PKM2表达及生存期数据 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）嗜水气单胞菌溶血素基因的功能及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 嗜水气单胞菌概述 |
| 1.1.1 嗜水气单胞菌的生物学特性 |
| 1.1.2 嗜水气单胞菌的致病性及危害 |
| 1.1.3 嗜水气单胞菌的主要毒力因子 |
| 1.2 鱼类感染免疫的转录组学研究 |
| 1.2.1 转录组学研究 |
| 1.2.2 转录组学在鱼类感染免疫应答机制方面的研究 |
| 1.3 运用CRISPR/Cas9 技术编辑细菌基因 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9 基因编辑概述 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9 在细菌基因编辑中的应用 |
| 1.3.3 嗜水气单胞菌基因编辑技术发展现状 |
| 1.4 本论文的研究目的、内容及创新点 |
| 第二章 溶血素的原核表达、纯化及免疫原性分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 菌株与载体 |
| 2.2.2 实验动物 |
| 2.2.3 仪器与设备 |
| 2.2.4 试剂 |
| 2.2.5 主要溶液的配制 |
| 2.2.6 引物序列 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 克隆载体的构建及鉴定 |
| 2.3.2 表达载体的构建及鉴定 |
| 2.3.3 重组蛋白表达条件及表达形式的分析 |
| 2.3.4 重组蛋白的变性、纯化、复性与浓缩 |
| 2.3.5 复性蛋白的生物学活性测定 |
| 2.3.6 兔多克隆抗体的制备 |
| 2.3.7 兔多克隆抗体的检测 |
| 2.3.8 重组蛋白的免疫原性分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 克隆载体的构建及鉴定 |
| 2.4.2 表达载体的构建及鉴定 |
| 2.4.3 重组蛋白的诱导条件及表达形式分析 |
| 2.4.4 重组蛋白的纯化与复性 |
| 2.4.5 重组蛋白生物学活性分析 |
| 2.4.6 兔源多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.4.7 重组蛋白免疫原性分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 溶血素感染锦鲤的脾脏转录组分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 仪器与设备 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 引物序列 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 溶血素的制备 |
| 3.3.2 免疫程序 |
| 3.3.3 样品采集 |
| 3.3.4 锦鲤脾脏组织RNA的提取与检测 |
| 3.3.5 构建cDNA文库及进行Illumina测序 |
| 3.3.6 转录组从头组装及结果分析 |
| 3.3.7 qRT-PCR验证 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 建立动物感染模型 |
| 3.4.2 RNA样品质量检测 |
| 3.4.3 Illunina测序和序列组装 |
| 3.4.4 Unigene的功能注释 |
| 3.4.5 差异表达基因的分析 |
| 3.4.6 锦鲤脾脏应答溶血素的免疫相关基因的分析 |
| 3.4.7 qRT-PCR验证 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 嗜水气单胞菌溶血素敲除质粒的构建 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 菌株与载体 |
| 4.2.2 仪器与设备 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 溶液的配制 |
| 4.2.5 引物序列 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 构建单质粒敲除系统 |
| 4.3.2 构建双质粒敲除系统 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 单质粒敲除系统的构建 |
| 4.4.2 双质粒敲除系统的构建 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 后续展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
| 附录 |
| 附表 1 与免疫相关的差异表达基因统计表 |
（9）基于sfTSLP/1fTSLP平衡的麻芥巴布膏“经皮治肺”调控过敏性鼻炎的体内外研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献研究 |
| 综述一 张仲景对鼻鼽辨治及后世医家穴位贴敷外治思路探究 |
| 1 鼻鼽病名释义 |
| 2 张仲景鼻鼽辨治思路 |
| 3 后世医家穴位贴敷外治鼻鼽思路 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 TSLP及其亚型相关研究进展 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究进展 |
| 3 总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 sfTSLP对OVA诱导过敏性鼻炎小鼠的作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 体外麻芥巴布膏对sfTSLP/lfTSLP平衡的直接影响 |
| 实验一 lfTSLP多克隆抗体的制备 |
| 实验二 体外麻芥巴布膏对sfTSLP/lfTSLP平衡的直接影响 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）环境中有机污染物的生物分析新方法的研究及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 生物分析技术 |
| 1.2 免疫分析法 |
| 1.2.1 酶联免疫吸附法 |
| 1.2.2 实时荧光定量免疫PCR分析 |
| 1.2.2.1 聚合酶链式反应 |
| 1.2.2.2 免疫PCR方法 |
| 1.2.2.3 实时荧光定量免疫PCR |
| 1.2.3 与复合探针结合的生物分析法 |
| 1.3 基于毒性信号通路的体外生物分析法 |
| 1.4 本课题研究对象 |
| 1.4.1 多溴二苯醚 |
| 1.4.1.1 多溴二苯醚现状 |
| 1.4.1.2 多溴二苯醚危害 |
| 1.4.1.3 多溴二苯醚现有分析方法及面临问题 |
| 1.4.2 合成麝香 |
| 1.4.2.1 合成麝香现状 |
| 1.4.2.2 合成麝香危害 |
| 1.4.2.3 合成麝香现有分析方法及面临问题 |
| 1.4.3 多环芳烃 |
| 1.4.3.1 多环芳烃现状 |
| 1.4.3.2 多环芳烃危害 |
| 1.4.3.3 多环芳烃现有分析方法及面临问题 |
| 1.4.4 研究对象的生物分析方法现状总结 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.6 研究内容及技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 BDE-47、AHTN半抗原、全抗原及抗体制备 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验药品与仪器 |
| 2.2.1 实验主要试剂配制 |
| 2.2.2 实验药品 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 BDE-47半抗原的制备与表征 |
| 2.3.2 BDE-47人工全抗原的制备与表征 |
| 2.3.3 AHTN半抗原的制备与表征 |
| 2.3.4 AHTN全抗原的制备与表征 |
| 2.3.5 BDE-47、AHTN蛋白偶联物测定 |
| 2.3.6 BDE-47、AHTN免疫实验 |
| 2.3.7 BDE-47、AHTN多克隆抗体纯化 |
| 2.3.8 多克隆抗体特异性与亲和性 |
| 2.3.9 酶联免疫测定抗体效价 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 BDE-47中间体及半抗原的红外光谱和核磁共振氢谱表征 |
| 2.4.2 AHTN与半抗原的红外光谱和核磁共振氢谱表征 |
| 2.4.3 免疫原及包被原的鉴定 |
| 2.4.4 免疫原、包被原蛋白浓度测定 |
| 2.4.5 抗体效价及蛋白浓度测定 |
| 2.4.6 抗体亲和性与特异性 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 间接竞争BS-ELISA测定AHTN、BDE-47 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验药品与仪器 |
| 3.2.1 实验主要试剂配制 |
| 3.2.2 实验药品与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 制备生物素化多克隆抗体 |
| 3.3.2 间接竞争BS-ELISA分析方法建立 |
| 3.3.3 间接竞争BS-ELISA分析方法的优化 |
| 3.3.4 间接竞争BS-ELISA标准曲线 |
| 3.3.5 重复性检测 |
| 3.3.6 样品采集与处理 |
| 3.3.7 样品分析 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 间接竞争BS-ELISA测定BDE-47条件优化 |
| 3.4.2 间接竞争BS-ELISA测定AHTN条件优化 |
| 3.4.3 间接竞争BS-ELISA标准曲线 |
| 3.4.4 GC-ECD、GC-MS法测定BDE-47、AHTN |
| 3.4.5 间接竞争BS-ELISA重复性 |
| 3.4.6 化妆品中AHTN含量与加标回收实验 |
| 3.4.7 灰尘中BDE-47含量与加标回收实验 |
| 3.4.8 PM_(2.5)中BDE-47的浓度水平和变化 |
| 3.4.9 PM_(2.5)中BDE-47与大气常规污染物的关系 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 基于复合探针的间接竞争ELISA测定BDE-47 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验药品与仪器 |
| 4.2.1 实验主要试剂配制 |
| 4.2.2 实验药品与仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 生物素化羊抗兔IgG预处理 |
| 4.3.2 复合探针制备 |
| 4.3.3 复合探针的链霉亲和素标记率 |
| 4.3.4 复合探针SA-B-IgG-CNTs-HRP活性测定 |
| 4.3.5 间接竞争ELISA分析方法建立 |
| 4.3.6 基于复合探针的间接竞争ELISA法的条件优化 |
| 4.3.7 间接竞争ELISA法的标准曲线 |
| 4.3.8 样品采集与处理 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 复合探针的表征 |
| 4.4.2 基于复合探针的间接竞争ELISA法的条件优化 |
| 4.4.3 基于复合探针的间接竞争ELISA法测定BDE-47 |
| 4.4.4 基于复合探针的间接竞争ELISA方法的重复性 |
| 4.4.5 BDE-47实际样品测定与加标回收实验 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 基于复合探针的直接竞争Rt-iPCR法测定AHTN、BDE-47 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验药品与仪器 |
| 5.2.1 实验主要试剂配制 |
| 5.2.2 实验药品与仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 金纳米颗粒的制备及表征 |
| 5.3.2 一抗复合探针的制备 |
| 5.3.2.1 金纳米复合探针制备 |
| 5.3.2.2 碳纳米管复合探针制备 |
| 5.3.3 一抗复合探针的蛋白标记率 |
| 5.3.4 一抗复合探针活性 |
| 5.3.5 基于一抗复合探针的直接竞争rt-iPCR分析法建立 |
| 5.3.6 基于复合探针的直接竞争Rt-iPCR方法的优化 |
| 5.3.7 基于复合探针的直接竞争Rt-iPCR标准曲线 |
| 5.3.8 样品采集与处理 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 一抗复合探针的表征 |
| 5.4.1.1 金纳米复合探针 |
| 5.4.1.2 碳纳米管复合探针 |
| 5.4.2 直接竞争Au NPs-rt-iPCR条件优化 |
| 5.4.2.1 直接竞争Au NPs-rt-iPCR条件优化 |
| 5.4.2.2 直接竞争CNTs-rt-iPCR条件优化 |
| 5.4.3 直接竞争rt-iPCR测定AHTN、BDE-47 |
| 5.4.3.1 直接竞争Au NPs-rt-iPCR测定AHTN |
| 5.4.3.2 直接竞争CNTs-rt-iPCR测定BDE-47 |
| 5.4.4 直接竞争rt-iPCR方法的重复性 |
| 5.4.5 实际样品测定与加标回收实验 |
| 5.4.5.1 直接竞争AuNPs-rt-iPCR测定AHTN |
| 5.4.5.2 直接竞争CNTs-rt-iPCR测定BDE-47 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 AhR-CALUX测定多环芳烃 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验药品与仪器 |
| 6.2.1 实验主要试剂配制 |
| 6.2.2 实验药品与仪器 |
| 6.2.3 H1L7.5c1细胞系 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 细胞培养 |
| 6.3.2 细胞接种 |
| 6.3.3 CALUX条件优化 |
| 6.3.4 样品处理 |
| 6.3.5 CALUX分析 |
| 6.3.6 数据分析 |
| 6.3.7 重复性检测 |
| 6.4 实验结果与讨论 |
| 6.4.1 细胞接种 |
| 6.4.2 边缘效应及重复测定次数 |
| 6.4.3 培养基、培养时间优化 |
| 6.4.4 样品稀释倍比 |
| 6.4.5 CALUX测定程序 |
| 6.4.6 CALUX测定BaP的标准曲线 |
| 6.4.7 AhR-CALUX重复性及加标回收实验 |
| 6.4.8 水样测定及实验结果分析 |
| 6.4.9 梯度扩散薄膜技术与CALUX结合展望 |
| 6.5 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 研究结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 未来工作展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 博士研究期间科研论文发表情况 |
| 博士研究期间专利申请情况 |
| 博士研究期间学术会议参加情况 |
| 致谢 |
四、用实验动物制备多克隆抗体Ⅰ.免疫方案的优化（论文参考文献）
- [1]基于AuNPs-寡聚核苷酸探针的草甘膦免疫学检测技术研究[D]. 关乃瑜. 吉林大学, 2021
- [2]胞内劳森菌抗原候选蛋白表达及ELISA方法建立[D]. 张昆. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]诺氟沙星抗体的制备及超灵敏检测技术研究[D]. 韩振宇. 内蒙古医科大学, 2021(02)
- [4]牛IRF7蛋白的表达及对牛病毒性腹泻病毒增殖的影响研究[D]. 张超. 石河子大学, 2021(02)
- [5]β-丙内酯灭活肺炎支原体的安全性及其免疫原性研究[D]. 刘瑶. 昆明医科大学, 2021
- [6]片形吸虫病早期诊断靶标的筛选及诊断方法的建立[D]. 龚静芝. 扬州大学, 2021
- [7]紫草素/双硫仑仿生递药系统的构建及脑胶质瘤治疗的研究[D]. 赵鹏飞. 南京中医药大学, 2021(01)
- [8]嗜水气单胞菌溶血素基因的功能及其作用机制的研究[D]. 李丹. 电子科技大学, 2021(01)
- [9]基于sfTSLP/1fTSLP平衡的麻芥巴布膏“经皮治肺”调控过敏性鼻炎的体内外研究[D]. 杜茜蕾. 北京中医药大学, 2020(04)
- [10]环境中有机污染物的生物分析新方法的研究及应用[D]. 张晓寒. 上海交通大学, 2020(01)