【摘要】 目的 探讨硫化氢(H２S)合成酶胱硫醚－β－合成酶(CBS)在自发性高血压大鼠(SHR大鼠)延髓外侧区的表达及意义.方法 用雄性WKY大鼠作为SHR大鼠同种系正常对照组;免疫印迹方法观察雄性SHR大鼠及雄性WKY大鼠延髓外侧区的CBS表达水平差异.结果 CBS在SHR和WKY大鼠中枢延髓腹外侧均有表达(Fig．１．５,Fig．１．６),且１７周SHR大鼠CBS的表达水平在延髓腹外侧低于WKY大鼠(p＜０．０５).结论 内源性H２S生成减少可能与原发性高血压的形成有关. 【关键词】 硫化氢;胱硫醚－β－合成酶;高血压【中图分类号】R７４３．３【文献标识码】B 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０１３２－０２
内源性硫化氢(hydrogensulfide,H２S)是一种具有臭鸡蛋气味的气体,无色有毒.但是通过近２０年来的研究,研究者发现H２S是人体内继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后发现的第三类气体信号分子[１],通过深入研究发现内源性H２S与多种心血管系统疾病密切相关[２].内源性H２S在人体内主要由胱硫醚－β－合酶(CBS)、胱硫醚－γ－裂解酶(CSE)和半胱氨酸转移酶催化半胱氨酸产生.CBS主要存在于神经系统内,一般认为,延髓是心血管活动的基本中枢,延髓头端腹外侧部是交感缩血管中枢和心交感中枢所在的部位, 观察CBS在SHR 大鼠延髓外侧区的表达,判断H２S在自发性高血压的中枢效应.本研究旨在探讨硫化氢(H２S)合成酶胱硫醚－β－合成酶(CBS)在自发性高血压大鼠(SHR大鼠)延髓外侧区的表达及意义.
１ 材料与方法
１．１ 实验动物与主要试剂２０只清洁级雄性１７周龄自发性高血压大鼠(SHR 大鼠)和WKY大鼠２０只,体重２５０－３００g(中科院实验动物中心提供).分为WKY大鼠对照组和SHR大鼠组.２组大鼠分笼喂养,自由饮水和摄食.BCA 试剂盒(上海碧云天生物公司),小鼠抗大鼠CBS抗体(Abnova公司).
１．２ 试验方法 免疫印迹实验(Western－blot)２组大鼠快速断头处死,取出延髓外侧区,称重,切小块放入管中,加入蛋白质抽提试剂(２５０mg组织中加入１ml抽提试剂),用匀浆器每次３０秒低速匀浆至组织完全裂解,４℃、１４,０００r/min离心１５分钟后取上清液,按BCA 试剂盒操作说明书操作计算出蛋白浓度.使用BioRad电泳装置,分离蛋白,分离后转移至PVDF 膜上.膜在５％BSA 溶液中室温孵育１小时以封闭膜上的非特异结合.封闭过的膜加入一级抗体４℃过夜,抗原抗体结合.TBST洗膜３次,每次５分钟.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准, 室温孵育膜１小时.TBST洗膜３次,每次５分钟.KC 化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液.将膜置于反应液中室温孵育３分钟.去除过量的溶液,将膜夹在两塑料薄膜之间,以X光胶片曝光.图片扫描保存为电脑文件,并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化.所测蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值表示CBS含量.
１．３ 统计学处理 采用SPSSl３．０统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(`x??x±s)表示,组间采用单因素方差分析及q检验进行差异显著性分析,P＜０．０５为差异有统计学意义.２ 结果结果显示:CBS在SHR和WKY大鼠中枢延髓腹外侧均有表达(Fig．１．５,Fig．１．６),且１７周SHR大鼠CBS的表达水平在延髓腹外侧低于WKY 大鼠(p０５)差异有统计学意义.
３ 讨论现代研究表明,CBS和CSE的表达具有组织特异性.中枢神经系统内,内源性H２S主要由CBS催化生成.实验研究证实,脑组织中生成的H２S可以被CBS抑制剂所阻断,而不被CSE抑制剂所阻断,内源性H２S在CBS缺乏的小鼠中表达明显减少[３].内源性H２S与NO 和CO 一样,是一种小分子物质,能自由穿越膜结构,不依赖与膜受体发挥作用.H２S在体内有两种存在形式,一种是以未溶解的形式存在,占１/３,另一种是以NaHS的形式存在,占２/３,两种存在形式保持动态平衡.其分子特性决定了H２S能在多环节上参与调控心血管作用.内源性H２S通过能舒张血管平滑肌、抑制血管重塑、减少血管炎性反应和对心脏的负性肌力及负性心率作用,降低血压及延缓高血压的进展[４]. 近年来有文献报道内源性H２S在大脑对中枢心血管系统有重要的调节作用.研究已证实延髓头端腹外侧部是重要的心血管中枢,它通过整合来自下丘脑室旁核、延髓孤束核等心血管相关核团的投射,是中枢神经系统对心血管活动调节的最后通路[５－７]. 我们研究结果显示,CBS在SHR和WKY大鼠中枢延髓腹外侧均有表达, 且１７周SHR大鼠CBS的表达水平在延髓腹外侧低于WKY 大鼠(p＜０．０５). 说明内源性H２S生成减少可能与原发性高血压的形成有关. 综上所述,H２S作为第三种气体信号分子参与了心血管疾病的多个病理生理过程,但其参与原发性高血压发病的作用机制仍不完全清楚.随着对内源性H２S不断研究,其潜在的心血管疾病的治疗作用将是未来研究重点,开发H２S的药用价值,具有重要的理论及临床意义. 参考文献[１] Wang,R．,Two＇scompany,three＇sacrowd:canH２SbethethirdendogＧ[ enousgaseoustransmitter[J]?FASEBJ,２００２．１６(１３):１７９２－１７９８． ２] Dawe,G．S,etal．HydrogensulphideinthehypothalamuscausesanATP－sensitiveK＋ channel－dependentdecreaseinbloodpressureinfreely[ movingrats[J]．Neuroscience,２００８．１５２(１):１６９－１７７． ３] EtoK,KimuraH．Anovelenhancingmechanismforhydrogensulfideproducingactivityofcystathionineβ－synthase[J]．JBiolChem,２００２,[ ２７７:４２６８０－４２６８５． ４] 柳子静,钟光珍,高明明．新型气体信号分子硫化氢与高血压发病[J]．国际心血管病杂志,２０１０,３７(１):４９－５２． [５] 于云海,马红,曹银祥等．硫化氢对SHR大鼠的中枢心血管效应及其机制探讨[J]．中国分子心脏病学杂志,２０１１,１１(４):２３５－２４０． [６] Guyenet,P．G．,Thesympatheticcontrolofbloodpressure[J]．NatRev[ Neurosci,２００６．７(５):３３５－３４６． ７] Sved, A．F．,S．Ito and J．C．Sved,Brainstem mechanisms ofhypertension:role of the rostral ventrolateral medulla [J]．CurrHypertensRep,２００３．５(３):２６２－２６８．
论文作者:董金虎
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年12月供稿
论文发表时间:2016/3/2
标签：延髓论文; 大鼠论文; 高血压论文; 中枢论文; 硫化氢论文; 心血管论文; 内源性论文; 《中国综合临床》2015年12月供稿论文;