1南华大学医学院 湖南衡阳 421001；2南华大学外科学总论教研室 湖南衡阳 421001
摘要：目的 研究辛伐他汀对人胃低分化腺癌细胞SGC7901增殖的影响及其可能的分子机制。方法 培养SGC7901细胞，再用各浓度辛伐他汀处理细胞48小时，采用MTT法检测细胞增殖抑制情况；RT-PCR法和Western Blot法观察RECK、MMP-2、MMP-9的表达。结果 辛伐他汀能抑制SGC7901细胞增殖，且呈浓度依赖性。MTT检测显示10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L辛伐他汀组细胞增殖抑制率分别为（23.37±1.50）%、（36.17±2.54）%、（46.39±2.38）%，与对照组增殖抑制率（1.60±0.38）%相比，增殖抑制率显著增强（P<0.05）。不同浓度的辛伐他汀作用后能显著增强SGC7901细胞RECK mRNA和蛋白的表达，降低MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表达（P<0.05）。结论 辛伐他汀呈浓度依赖性的抑制胃癌SGC7901细胞的增殖，其机制可能是与上调RECK下调MMP-2、MMP-9表达有关。
关键词：辛伐他汀；RECK；MMP-2；MMP-9
Effect of Simvastatin on proliferation in human gastric cancer cell line SGC7901
WEI Jian-xu1，LI Qing-ling1，HUANG Liang2，WANG Fang2，WANG Han-qun2，ZHU Meng-xia2 △
（1.MedicalCollege，University of South China 2.Dept of Operative Surgery，University of South China，Hengyang Hunan 421001，China）
[ABSTRACT] Objective：To investigate the effects of Simvastatin on proliferation in human gastric lower-differentiation adenocarcinoma cell line SGC7901 and then to explore its potential molecular mechanismes.Methods：First，gastric SGC7901 cells were cultured and cells of exponential phase of growth were used for experiment.Different concentrations of Simvastatin roled in SGC7901，48 hours later，MTT assay was used to detect the inhibition rates and proliferation of SGC7901，the expression of RECK、MMP-2、MMP-9 was tested by RT-PCR and Western-Blot assay.Results：Simvastatin could inhibit the proliferation of gastric cell line SGC7901 in a dose-dependent manner.MTT method showed that，Simvastatin（10μmol/l，20μmol/l，40μmol/l）role in SGC7901 for 48 hours，the Growth inhibition rates of the three groups were（23.37±1.50）%、（36.17±2.54）%、（46.39±2.38）%，Growth inhibition rate of the control group was（1.60±0.38）%，the experimental groups were significantly higher than the control group（P<0.05）.Different concentrations of Simvastatin could promote the expression of mRNA and protein of RECK，reduce the expression of mRNA and protein of MMP-2、MMP-9 in SGC7901 cells（P<0.05）.Conclusions：Simvastatin can inhibit the proliferation of gastric cell line SGC7901 in a dose-dependent manner.One of the possible mechanisms of the growth inhibition is that Simvastatin can improve the expression of RECK and reduce the expression of MMP-2、MMP-9.
[Key words] Simvastatin，RECK，MMP-2，MMP-9；
胃癌是最常见恶性肿瘤之一，在我国胃癌发病率和死亡率占肿瘤整体发病率及死亡率的第三位 [1]，在治疗上以手术、放化疗和辅助药物等综合治疗为主，而其中，辅助药物治疗手段仍有较大研究空间。近些年研究他汀类药物时发现，其能显著抑制多种肿瘤，如前列腺癌、乳腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、间皮瘤等的发展过程 [2]，而辛伐他汀作为最广泛运用的他汀类药之一，也被认为具有潜在的抗肿瘤作用。本研究通过观察辛伐他汀对胃癌SGC7901细胞增殖的影响，并检测RECK、MMP-2、MMP-9等基因的表达，初步探索可能机制。
1 材料与方法
1.1试剂材料 辛伐他汀购于海正药业股份有限公司，溶解后调整浓度10μmol /L，-20℃冷藏。胰蛋白酶、RPMI1640培养基购于Gibco公司，噻唑蓝（MTT）购于美国Sigma公司，小牛血清购于杭州四季青公司，RECK、MMP-2、MMP-9抗体购于武汉博士德公司，β-actin抗体购于Santa Cruz 公司。
1.2 细胞培养和分组 SGC7901细胞置于含有100ml/L小牛血清、100U/ mL青霉素、100U/ mL链霉素的RPMI 1640培养基中，并放于37 ℃、含50ml/LCO2的孵箱内培养。实验时，取指数生长细胞。接种约3×105个细胞于培养瓶内，孵育至约70%融合时，更换培养液继续培养约24小时。
1.3 MTT法检测SGC7901细胞生长抑制率
取细胞用胰酶消化后，用含10%胎牛血清的RPM1640培养基稀释细胞浓度为5×104个/ml，接种于96孔板，饥饿培养24h，按分组加入浓度为10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L辛伐他汀，对照组加含DMSO的培养基200μL，每组设6个复孔，然后继续培养。48 h后，每孔中加入20μL（5g/L）MTT，继续培养4h后终止反应，每孔加入DMSO 150μL孵育15min。应用酶联免疫仪测定每孔的吸光度（Absorbance，A值），选择检测波长490nm，用对照孔的A值设为调零孔校正零点。用每组6孔的A值计算出生长抑制率，生长抑制率=（1-药物处理组吸光度值/溶媒对照组吸光度值）×100%。
1.4 RT-PCR观察RECK、MMP-2、MMP-9 mRNA表达
不同组继续培养48h后，分别收集细胞，加入Trizol 试剂，然后按照说明书操作步骤提取RNA，1.5%琼脂糖电泳鉴定RNA完整性。逆转录合成cDNA后扩增RECK、MMP-2、MMP-9和β-actin。RT反应：RT体系20μl，含5倍RT缓冲液4 μl、RNA 4μl、Rasin（50 U/μl）1μl、dNTP（10 μmol/L）2 μl、M-MLV RT酶1μl、DEPC水7 μl、随机引物1μl，条件为42℃ 60 min，95℃ 10 min。PCR反应：引物设计如下：RECK：上游5ˊ-TTCAGAACCCCAACTACTG-3ˊ，下游5ˊ-ATGCAAGATGCTTTGATGC-3ˊ； MMP-2：上游5ˊ-AGACATACATCTTTGCTGGAGACA-3ˊ，下游5ˊ-CTTGAAGAAGTAGCTGTGACCG-3ˊ；MMP-9：上游5ˊ-ACAT CACCTATTGGATCC -3ˊ，下游5ˊ- TGGGTGTAGAGTCTCTCGCT -3ˊ。扩增长度分别为：378bp、289bp、267bp。
总反应体系25 μl，反应条件为：94℃ 4 min，94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 延伸5 min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，然后系统扫描照相。
1.5 Western Blot观察RECK、MMP-2、MMP-9蛋白定量表达
将细胞接种至孔板，加入处理因素，培养48h后，每孔均加入细胞裂解液，提取总蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后电转移蛋白至 PVDF 膜，按抗体说明书加入RECK、MMP-2、MMP-9抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗。电泳条带使用化学发光和X线曝光显示。以各条带的灰度值比间接代表各蛋白表达量。
1.6 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，其中计量数据用x±s表示，多组均数比较使用单因素方差分析，多组均数两两比较用LSD法检验。用P<0.05判断统计差异有无显著性。
2.结果
2.1 MTT法检测辛伐他汀对胃癌SGC7901细胞增殖的影响
MTT法检测结果显示，10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L辛伐他汀组与对照组相比以及各实验组之间相比，增殖抑制率均有显著性差异（P<0.01），增殖抑制率随辛伐他汀浓度增加而明显增强。
表1 辛伐他汀对SGC7901细胞增殖的影响（x±s）
3.讨论
随着对他汀类药物的不断研究，发现他汀类同时具有多方面非降脂作用，如：治疗骨质疏松症[3]、抗炎症[4]等，并且还具有一定程度的抗肿瘤效应。其抗肿瘤作用可能与促凋亡、抑制增殖和转移、影响肿瘤血管形成等密切相关。细胞增殖是人体的重要生命特征，细胞通过分裂生成和本身相同的细胞群体，用来补充体内衰老和死亡的细胞，是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。细胞增殖受多种基因调控，这些基因包括了RECK、MMP-2、MMP-9等。肿瘤细胞作为异常分化的细胞，保持持续的分裂增殖能力而不断生长。
胃癌是全球范围内常见的消化道恶性肿瘤之一，有研究发现，肿瘤抑制基因RECK表达上调与抑制胃癌的发生发展密切相关，其作用可能与下调MMP-2和MMP-9的表达有关[5]。MMP-2和MMP-9属于基质金属蛋白酶（MMPs）家族，其异常调节可释放与基质相关的生长因子，或加速基质屏障的降解。目前各类研究证实，MMP-2和MMP-9的失调与胃肠道肿瘤[6]、葡萄膜黑色素瘤[7]等肿瘤的增殖、凋亡等密切相关。辛伐他汀是当今最常用的他汀类药物之一，除了调脂以外，近些年出现了大量关于辛伐他汀可以通过调节肿瘤细胞的不同基因或通路[8]发生作用的研究报道，这些报道指出该类药物可以通过影响肿瘤发生发展对肺癌[9]、子宫内膜癌[10]、乳腺癌[11]、卵巢癌[12]等多种肿瘤起到辅助治疗的作用。在该研究中，我们通过检测不同浓度辛伐他汀处理过的胃癌SGC7901细胞的部分增殖相关指标后，发现其可以抑制SGC7901细胞增殖，且该过程伴有RECK基因、蛋白表达增加和MMP-2、MMP-9基因、蛋白表达的下降，且这种变化与辛伐他汀的作用浓度密切相关。本次实验证实了辛伐他汀可以呈浓度依赖性的抑制胃癌SGC7901细胞增殖，其作用机制可能是与影响RECK、MMP-2、MMP-9的表达有密切的相关性。
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作者简介：魏建绪（1995-），男，在校学生，E-mail：51718121@qq.com
通讯作者：△朱梦霞（1987-），女，硕士，讲师，E-mail：mengky0904@163.com
基金项目：2016年湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目：《辛伐他汀对胃癌SGC7901细胞增殖的影响及其作用机制的研究》
论文作者:魏建绪,李晴玲,黄靓,王芳,王汉群,朱梦霞
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年第24期
论文发表时间:2018/10/15
标签：辛伐他汀论文; 细胞论文; 抑制论文; 胃癌论文; 浓度论文; 肿瘤论文; 作用论文; 《中国误诊学杂志》2018年第24期论文;