龚勇[1]2000年在《来源于链霉菌的新型纤溶酶的纯化、特性和基因克隆与表达的研究》文中研究表明链霉菌(Streptomyces sp．)C3662是本实验室筛选到的能产生多种纤溶活性物质的菌株，本文报道了从其发酵液中纯化一种纤溶酶Sfp-1的方法，纤溶酶Sfp-1的理化及纤溶性质，并用反向遗传学及鸟枪克隆等两种方法对编码纤溶酶基因的克隆与表达进行了探索。 链霉菌C3662的发酵液经硫酸铵分级盐析，DEAE-Sepharose阴离子交换层析和CM-Sepharose阳离子交换层析分离后纯化获得了一种纤溶酶Sfp-1。经HPLC检测其纯度为93.25％，SDS-PAGE显示为单一的条带，分子量约为25kD。 测定纤溶酶Sfp-1的N末端氨基酸序列为Val-Val-Gly-Gly-Thr-Arg-Ala-Ala-Gln-Gly-Glu-Phe。Sfp-1在4-37℃温度范围和pH4-9的酸碱范围内稳定性良好，其最适温度为37℃，最适pH为7.5。Sfp-1的活性可被10mmol／L的PMSF所抑制，而不被EDTA抑制，表明Sfp-1纤溶酶可能是一种丝氨酸蛋白酶，而不是金属蛋白酶。 在不含纤溶酶原的纤维蛋白平板上，Sfp-1也具有纤溶活性，表明Sfp-1可以直接降解纤维蛋白，是一种蛋白水解酶，而非纤溶酶原激活剂。血小板凝集实验显示Sfp-1可在体外阻止血小板聚集，具有很好的抗凝活性。小白鼠尾静脉注射Sfp-1的急性毒理实验显示其毒性极低。 根据Sfp-1的N末端序列设计了一组同义寡聚核苷酸序列作为探针GTC(G)TGCGGCGGCACG(C)CGC(G)GCC(G)GCC(G)CAG(C)GGC，用这一
吕凤霞[2]2009年在《内生多粘芽孢杆菌纤溶酶的纯化、性质及其基因的克隆与表达》文中指出血栓栓塞性疾病严重危害人类健康和生命,溶栓疗法是治疗血栓栓塞性疾病最为有效并且可靠的手段。目前临床应用的溶栓药物疗效肯定,明显降低了患者的死亡率和致残率,但还存在特异性不高、半衰期短、易出血及再栓塞等缺点。因此迫切需要研制开发高效、特异、安全、副作用小、价廉的新型溶栓药物。已有研究表明,许多中药具有抗血小板聚集、抗血栓形成的作用,包括生物碱类、黄酮类以及皂甙等化合物,尤其是活血化瘀中草药具有不同程度的抗凝血、血小板聚集及溶解血栓的作用。生活在植物组织内的内生菌,由于内生菌与宿主植物长期协同进化过程中,彼此构成了稳定的生态关系,使内生菌具有产生某些与植物相同或相似化合物的能力。鉴于此,从中药植物内生菌资源中可寻找和发现一些新型的溶栓药物。本研究首次在内生细菌中筛选分离到一株具有纤溶活性较高和良好体外溶栓效果的EJS-3菌株,对其进行了形态特征、生理生化特征和分子生物学鉴定,并对内生多粘芽孢杆菌纤溶酶的分离纯化及其性质进行深入的研究。同时,采用基因工程技术将内生多粘芽孢杆菌纤溶酶基因克隆到表达载体上,实现内生多粘芽孢杆菌纤溶酶异源表达,并对表达产物的提纯和重组酶的酶学性质作了初步探讨,为研制和开发新型的溶栓药物提供重要理论依据。主要研究结果分述如下：1.采用酪蛋白平板和纤维蛋白平板初筛、摇瓶复筛的筛选策略,从金银花、黄芩、蒲公英、黄连、连翘、爬山虎、鱼腥草、百部等植物的根、茎、叶分离筛选到7株具有纤溶活性的内生菌。其中从百部中分离到的内生菌株EJS-3酶活最高,达110 IU/mL。通过对其形态特征、生理生化特征进行鉴定,初步判断该菌株为多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。对菌株EJS-3的16S rDNA进行PCR扩增,对得到的1500bpPCR产物纯化和序列测定,利用GenBank数据库进行同源搜索,并构建N-J系统发育树,结果表明：菌株EJS-3的16S rDNA序列(DQ120522)与多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的16S rDNA序列的同源性均达98%以上,亲缘关系最近。结合常规的形态特征、生理生化特征鉴定,表明该菌株在细菌系统分类学上属于多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。目前,国内外内生多粘芽孢杆菌产纤溶酶的研究尚未见报道。2.内生菌株EJS-3发酵液经离心除菌,硫酸铵分级沉淀,Hiprep phenyl FF疏水层析,RESOURCEM Q离子交换层析和Sephacryl S-300HR凝胶过滤,获得电泳纯的多粘芽孢杆菌纤溶酶(PPFE-Ⅰ), HPLC为单一峰,纯度为94.1%。每升发酵液中可获得1.6 mg活性蛋白,每毫克蛋白活力达2096 IU,纯度提高了14.5,回收率为3.3%。3. SDS-PAGE测定PPFE-Ⅰ的相对分子质量为63 KDa, MALDI-TOF质谱法准确测定其相对分子质量为63.3 KDa。该酶最适反应温度37℃,最适反应pH7.5,具有较好的热稳定性和pH稳定性。金属离子Cu2+和Ca2+能抑制其纤溶活性, Mg2+, Fe2+和Zn2+对该酶存在明显的激活作用。1 mmol/L PMSF完全抑制其纤溶活性,EDTA能部分抑制纤溶活性,这表明PPFE-Ⅰ属于丝氨酸蛋白酶,此酶还可能是一种金属蛋白酶。4.利用几种人工合成的底物测定水解酰胺键活性的高低。结果表明,PPFE-Ⅰ的最适底物是枯草杆菌蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的最适底物,即N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe -pNA;水解生色底物N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA的米氏常数Km为0.20 mM,表明PPFE-Ⅰ对该底物有较好的亲和性；PPFE-Ⅰ在普通纤维蛋白平板和加热平板上测定的纤溶活性没有显著的差别,这表明PPFE-Ⅰ对纤维蛋白具有直接的降解作用,不具有激活纤溶酶原形成纤溶酶的活性,因而PPFE-Ⅰ是一种纤溶酶,而不是纤溶酶原激活剂；通过PPFE-Ⅰ对人血纤维蛋白原的体外降解过程的研究,结果表明纤溶酶PPFE-Ⅰ最先降解α链,其次是β链,而对γ链降解最缓慢,1-4 h逐渐降解至完全；通过体外血凝块的溶解作用实验,结果表明当PPFE-Ⅰ酶溶液对血凝块作用24h时,其对体外血凝决的溶解率91.33%,表明PPFE-Ⅰ有明显的体外溶栓作用,直接溶解作用的结果,同时具有显著的抗凝活性,并且抗凝血效果优于尿激酶。5.为了实现内生多粘芽孢杆菌纤溶酶的异源高效表达,以内生菌株EJS-3基因组DNA为模板,运用PCR扩增PPFE-Ⅰ基因,并克隆到pMD-19T载体上,构建克隆载体pMD-PPFE-Ⅰ,经测序正确后,将PPFE-Ⅰ克隆至表达载体pET-DsbA上,成功构建了pET-DsbA/PPFE-Ⅰ重组表达质粒,将其转化E. coli BL21(DE3)中,在IPTG诱导下实现了融合蛋白DsbA-PPFE-Ⅰ的表达,表达产物酶活性达228 IU/mL.表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。SDS-PAGE电泳检测融合蛋白主要以可溶形式表达,占菌体总蛋白的18.4%。Western blot结果表明在相应分子量处有一条特异性条带,证实该蛋白为DsbA-PPFE-Ⅰ融合蛋白。6.表达产物通过Ni亲和柱、凝血酶酶切及Sephadex G-100等步骤进行分离纯化,并用MALDI-TOF质谱对重组酶进行了鉴定。纯化后的表达产物在纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶活性。对纯化的重组纤溶酶进行最适温度及其稳定性、最适pH及其稳定性以及蛋白酶抑制剂、金属离子的影响等性质的研究,结果表明,重组酶与天然纤溶酶是一致的。7.为了进一步探讨内生多粘芽孢杆菌纤溶酶基因异源表达特性,从内生菌株EJS-3总DNA中PCR扩增出PPFE-Ⅰ基因,将PPFE-Ⅰ基因克隆到本实验室构建大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pHPQ中,并转化枯草杆菌WB800中进行了分泌表达,在含氯霉素10μg/mL.红霉素10μg/mL的LB液体培养基中培养32h,纤溶酶活性为60 IU/mL.
王骏[3]1997年在《链霉菌产生的新型纤溶酶的纯化、性质和基因克隆的研究以及溶栓机制的初步探讨》文中研究表明本文报道了从一株土壤链霉菌(Streptomyces sp.)Y405的发酵液中分离纯化到一种新型的具有纤溶活性的蛋白酶SW-1，并对其基本结构和理化性质、纤溶机理、初步药效以及基因克隆进行了研究。 链霉菌Y405的96小时发酵液经硫酸铵分级盐析(40-80％饱和度)、290树脂脱色、Sephadex G75凝胶过滤、DEAE Sephadex A25阴离子交换层析(0-1.0mol／L NaCl线性梯度洗脱)和Lysine Sepharose 4B亲和层析(0-0.5mol／L NaCl线性梯度洗脱)，获得链霉菌纤溶酶SW-1。每升发酵液中可获得4.2mg SW-1纯品，回收率为12.0％，每毫克蛋白活力达2952.3尿激酶单位，纯度提高230.6倍，经HPLC检测纯度约为83.5％。该纯化流程已成功地扩大，用于制备纯品。 链霉菌纤溶酶SW-1在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中是单肽链蛋白，分子量为30kDa，等电点为8.5，经HPLC纯化的蛋白测定其N-末端氨基酸序列为Arg／Asn／Phe-Pro／Asp-Gly-Met-Thr-Met-Thr-Ala-Ile-Ala-Asn-Gln-Asn-Thr-Gln-Ile-Asn，具有N端序列的不均一性，同时测定了蛋白的氨基酸组成。 链霉菌纤溶酶SW-1的纤溶活性可被10mmol／L PMSF、1mmol／L EDTA和1mol／L赖氨酸完全抑制，表明SW-1可能是一种丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，其赖氨酸结合位点与活性有关。SW-1的纤溶活性在4-37℃和pH4.0-9.0具有很好的稳定性，最适pH为8.0。 在纤维蛋白加热平板上，SW-1和它与纤溶酶原的混合物表现出相同的纤溶活性，在试管凝块溶解实验中，不加入纤溶酶原也不会影响SW-1对试管中纤维蛋白凝块的溶解，表明SW-1对纤维蛋白具有直接的降解作用，而不具有激活纤溶酶原的活性。SW-1还可降解纤维蛋白原，阻止试管中凝块的形成，表现出抗凝活性，可能是由于降解产物中产生了某种抗凝活性物质。 在大鼠腹腔静脉血栓模型中，与生理盐水相比，SW-1(4000u／kg)对血栓具有极显著的溶解效果(P＜0.001)，而与同剂量的尿激酶相比，溶栓效果无差异(P＞0.05)，说明SW-1溶栓活性与尿激酶相当。对大鼠血浆中多种纤溶系统因子的检测显示，SW-1可能促进了内源性t-PA的产生，进而激活纤溶酶原，产生内源性纤溶酶。SW-1和内源性纤溶酶的共同作用引起血浆中纤溶酶
肖璐[4]2004年在《溶栓酶基因的克隆及表达》文中认为通过纤维蛋白平板筛选、纤溶活性测定和体外溶栓分析相结合的方法,成功地从环境中筛选到一株纤溶活性较高的细菌菌株。利用细菌分类鉴定方法对其形态和生理生化特征进行了研究,发现其与藤黄微球菌的特征相符。根据细菌16S rDNA的保守序列设计1对引物,采用PCR技术扩增出该菌的16S rDNA片段,对该序列克隆后测序,并与已报道的序列进行比对,结果表明:它与藤黄微球菌的16S rDNA序列的同源性高达99%。此结果进一步表明,该菌在系统分类学上属于微球菌属(Micrococcus Cohn)藤黄微球菌(Micrococcus luteus),将其命名为ML-909。 根据解淀粉芽孢杆菌的豆豉溶栓酶(DFE)全基因、前肽-成熟肽(proDFE)序列、成熟肽编码序列设计3对引物,以ML-909菌株的总DNA为模板进行PCR扩增,扩增结果表明,从ML-909 DNA中扩增出编码成熟肽的DNA片段。测序结果显示,该片段大小为828bp,与豆豉溶栓酶(DFE)成熟肽基因片段大小完全相同,同源性达到99%,仅有2个碱基的差异,并导致1个氨基酸的变异。该序列编码由275个氨基酸残基组成的酶蛋白,命名为藤黄微球菌溶栓酶(MLFE)。 为了进一步探讨溶栓酶基因的异源表达特性,根据豆豉溶栓酶基因前肽-成熟肽的N-端和C-端编码序列分别设计2对引物,并在引物N-端和C-端分别引入EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ识别序列,分别以解淀粉芽孢杆菌及藤黄微球菌基因组DNA为模板,扩增出豆豉溶栓酶的前肽.成熟肽序列(1059bp)和MLFE成熟肽编码区(828bp)。扩增产物克隆到pMD18-T载体中,所获重组质粒经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后,将其克隆到大肠杆菌高效表达质粒pMAL-p2X中,构建溶栓酶基因-麦芽糖结合蛋白基因相融合的表达质粒pMAL-pDFE及
孙志斌[5]2016年在《产纤维蛋白酶和淀粉酶抑制剂放线菌Streptomyces sp.CC5的筛选及其产物的特性研究》文中进行了进一步梳理放线菌是一类具有菌丝、主要以孢子繁殖的革兰氏阳性原核生物,其形态分化是原核生物中最为复杂的一类,具有球状、杆状、分支状等多种形态。放线菌广泛分布于不同的自然环境之中,可产生多种天然活性物质,是一类具有广泛实际用途和巨大经济价值的微生物资源。放线菌产生的活性产物包括抗菌物质、酶、酶抑制剂、抗氧化剂等,广泛应用于医药、农业和工业等领域。本论文经过对不同生境土壤样品中的放线菌进行分离筛选,并通过菌落形态观察、16SrRNA基因酶切分型去重复、16SrRNA基因测序的方法对所分离到的放线菌进行菌属归类,同时从淀粉酶抑制剂和纤维蛋白酶两个主要角度寻找其发酵上清液中具有生物活性的代谢产物。最终从来源于全国40个土样中一共分离出10个属,406株放线菌,包括:链霉菌属(Streptomyces),野野村菌属(Nonomuraea),小单孢菌属(Micromonospora),小双孢菌属 (Microbispora),诺卡氏菌属(Nocardia),假诺卡氏菌属(Pseudonocardia ),马杜拉菌属(Actinomadura),动单孢菌属(Planomonospora),分支杆菌属(Mycobacterium) 和小链孢菌属(Caaellatospora)。通过碘和淀粉显色法、α-gal-G2-CNP法以及纤维蛋白平板法分别从中筛选出18株放线菌发酵液具有纤维蛋白水解活性和10株放线菌发酵液具有淀粉酶抑制活性。其中Streptomyces sp. CC5可以同时产生高活性的纤维蛋白酶和α-淀粉酶抑制剂,并产生纤溶酶原激活剂和抗菌物质等天然活性产物。纤维蛋白酶可以直接快速溶解血栓,用于心血管疾病的治疗,其中对急性心肌梗塞、肺栓塞等急性血栓效果更加明显。通过大孔树脂吸附、凝胶离子交换树脂脱色素、硫酸铵分级沉淀和Superdex 200凝胶层析等方法从CC5菌株发酵液中分离纯化到一种对纤维蛋白具有较强水解活性的碱性丝氦酸蛋白酶AfeE,其分子量为29984 Da。通过肽指纹图谱分析和基因克隆技术获得全长为1305 bp的基因(afeE)。结合高分辨率质谱和信号肽分析,发现AfeE可能存在翻译后加工的现象。afeE共编码434个氨基酸,前36个氨基酸为信号肽,在尾部320G-321T位之间被未知蛋白酶特异切割,成熟肽AfeE由中间的284个氨基酸组成,与源于 S. griseus的氨肽酶(SGAP)有80%的相似性,但部分生化性质与SGAP存在明显不同。AfeE的最适反应条件范围为40℃, pH 7.0-12.0,表明AfeE为碱性蛋白酶。苯甲基磺酰氟(PMSF)、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、N-甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲基酮(TLCK)和甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)对AfeE均有很强的抑制效果,说明AfeE为丝氨酸蛋白酶;此外,AfeE可以使蛋白酶抑制剂亮肽素失活,说明AfeE可能属于亮肽素失活蛋白酶。Cu2+, Co2+和Zn2+可以部分抑制酶活。AfeE具有一定的底物水解特异性,对纤维蛋白的水解速率明显快于对纤维蛋白原、牛血清蛋白、血红蛋白和卵清蛋白的水解速率,对纤维蛋白原的水解方式为Aα链>Bβ链>γ链。AfeE在含有纤溶酶原的纤维蛋白平板上呈现的水解活性大于在纤溶酶原失活的纤维蛋白平板上的活力,说明AfeE可能还存在纤溶酶原激活活性。利用动物实验对AfeE抗血栓性能进行评估。通过角叉菜胶诱导的小鼠尾部血栓模型溶栓实验结果表明:剂量为0.5 mg/kg AfeE的溶栓效果强于剂量为20 mg/kg尿激酶的溶栓效果,说明AfeE具有很强的溶栓活力。在抗凝实验中,AfeE对大鼠血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)均有明显的时间延长,8μgAfeE可使PT凝血时间超出计时范围(>180s),4μgAfeE可使APTT凝血时间超出计时范围,TT只需2 μgAfeE即可超出凝血时间计时范围,表明AfeE具有很强的抗凝血能力。小鼠出血时间实验表明,注射剂量为1 mg/kg的AfeE对小鼠断尾出血时间没有明显影响,而阳性对照尿激酶组(20 mg/kg)出血时间显著延长,有40%的小鼠出血时间超出1800 s。这一结果表明相比尿激酶,AfeE可能存在较低的出血风险。细胞毒性实验表明,320μg/孔AfeE (大约相当于单只小鼠溶栓剂量的32倍)对所培养的人脐带静脉内皮细胞没有剧烈毒性。一系列初步的抗血栓评估实验表明AfeE具有较强的溶栓活性,对出血时间和细胞活性无明显影响,具有成为一种新型溶栓药物的潜能。α-淀粉酶抑制剂可以特异抑制α-淀粉酶的活力,可作为生物杀虫剂控制以谷物等淀粉类作物为食的害虫;在医药上可以用于减缓餐后肠道对淀粉的消化,从而减慢机体对糖分吸收,降低血糖,普遍用于II型糖尿病和肥胖的预防与治疗。通过大孔吸附树脂、离子交换、硫酸铵分级沉淀和Superdex 75凝胶层析等一系列分离纯化手段从CC5菌株中分离到一种蛋白源α-淀粉酶抑制剂AAI-CC5。MALDI-TOF分析显示AAI-CC5分子量为8212Da; N端前15个氨基酸序列为DTGSPAPECVEYFQS,和已报道的蛋白源淀粉酶抑制剂序列不同。AAI-CC5可以特异抑制哺乳动物来源的α-淀粉酶活力,未检测到对链霉菌、解淀粉芽孢杆菌、粘细菌和大蜡螟源淀粉酶的抑制活性。AAI-CC5对热及酸碱环境稳定,在pH 2.0-10.0处理24 h或80℃处理1 h均未检测到明显抑制活力丧失;在沸水浴20分钟内依然可以保持一半的抑制活性。根据N端序列分析和数据库相关蛋白序列比对分析,利用染色体步移技术克隆到AAI-CC5的编码基因aaiE,aaiE共编码110氨基酸,前34个为信号肽,后76个为成熟肽AAI-CC5,与来源于S.parvulus的Parvulustat有82%的相似性,属于WRY修饰的蛋白类淀粉酶抑制剂,这一类淀粉酶抑制剂的抑制活力是已报道的淀粉酶抑制剂中抑制活性最强的类群之一。AAI-CC5对猪胰腺淀粉酶的半抑制浓度IC50和抑制常数Ki分别为6.43×10-11和4.45×10-11。AAI-CC5成功在大肠杆菌中异源表达,重组淀粉酶抑制剂rAAI-CC5分子量为9404 Da,其抑制活性和稳定性与野生菌中分离获得的基本一致。
张红丽[6]2011年在《枯草芽孢杆菌BS-3纤溶酶的分离纯化及其基因的克隆表达》文中研究说明血栓性疾病严重危害人类的健康和生命,研制开发特异、高效、安全的溶血栓药物,成为近年来人们研究的热门课题。微生物是溶栓药物的重要来源之一,微生物中的益生菌株所产生的纤溶酶具有溶栓效果好,无毒副作用,不引起内出血,半衰期长等优点。因此,开发微生物纤溶酶制剂具有极为广阔的前景。本研究从土壤中分离筛选出一株具有较高纤溶活性的菌株BS-3,通过生理生化反应及16S rDNA基因序列分析对BS-3菌株进行了鉴定。生理生化反应显示BS-3菌株大部分特征与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)相似。将16S rDNA序列在NCBI网站中进行同源性比较,利用Neighbor-Joining法绘制系统发育树,结果显示BS-3菌株与Bacillus subtilis的16S rDNA序列同源性达到100%,所以,结合生理生化反应及16SrDNA基因序列分析鉴定BS-3为Bacillus subtilis。对Bacillus subtilis BS-3菌株进行发酵条件优化,优化后发酵培养基组成为：玉米粉5g/L,豆饼粉10g/L, CaCl2-2H2O 0.5 g/L, NaCl 0.5 g/L, NaH2PO4·2H2O 2 g/L, Na2HPO4·12H2O 4 g/L, MgSO4·7H2O 0.2 g/L;最佳发酵工艺条件为：发酵培养基初始pH值7.0,装瓶量50mL/250mL,接种量为4%,发酵温度37℃,旋转摇床转速200r/min,发酵周期60 h,在该条件下发酵液中纤溶酶酶活力为624.159 U/mL,是初始发酵培养基的4.3倍。通过硫酸铵盐析的方法提取纤溶酶,等电聚焦电泳检测纤溶酶的等电点,DEAE-Sepharose阴离子交换层析和聚丙烯酰凝胶电泳等方法,对纤溶酶进行分离纯化,得到两个单一活性组分(BsFE-1和BsFE)。SDS-PAGE测得BsFE-1的分子量为48kD,BsFE分子量为43 kD。测得BsFE N-端15个氨基酸序列为AKLDETLTMLKDLTD.纤溶酶BsFE属于含二硫键和金属离子的丝氨酸蛋白酶类,作用最适温度为37℃,最适pH值为8.0,Ca2+、Na+对BsFE有激活作用。分别用胰蛋白酶、胃蛋白酶、胆盐体外处理BsFE,结果显示,胰蛋白酶和胆盐对BsFE活性无影响,在pH 3.0环境下BsFE被胃蛋白酶水解后纤溶活性略有降低。利用酶促反应动力学测得BsFE的Km值为2.6 mg/mL,最大反应速度Vmax为1.0mol/(L-min)。根据氨基酸编码序列的同源性设计引物,并且在5’端分别加入EcoRⅠ和Xho I的酶切位点,以BS-3菌株的基因组DNA为模板,利用设计的引物进行PCR,获得一个完整的纤溶酶基因bsfe,并且两头含有酶切位点。用EcoRⅠ和Xho I双酶切载体pET-30a和bsfe基因,并连接构建了重组质粒pET-30a-bsfe,并对其进行了测序。结果表明：bsfe基因全长约1086 bp,编码361个氨基酸。将重组质粒pET-30a-bsfe利用热激转化法转化大肠杆菌ER2566,经IPTG低温诱导后,SDS-PAGE检测胞外含有表达条带,表达产物相对分子量大小为43 kD,与BsFE大小一致。大量发酵含有重组质粒pET-30a-bsfe的大肠杆菌ER2566, IPTG诱导后,用镍柱亲和层析的方法对表达蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示在43 kD有单一条带。经纤维蛋白平板法检测,表达产物具有纤溶酶活性。
牛术敏[7]2008年在《枯草芽孢杆菌BS-26菌株的发酵及纤溶酶的分离纯化》文中提出血栓性疾病严重威胁人类生命和健康,近年来发病率有增加趋势。溶栓疗法是血栓性疾病安全且有效的治疗手段。目前临床使用的溶栓药物主要是纤溶酶原激活剂类,尽管这些药物的疗效肯定,但还存在许多缺陷,而且价格昂贵。因此研制高效、快速、价廉的新型溶栓药物的需求迫切。本研究的主要目的是对实验室分离保存的纤溶酶产生菌株芽孢杆菌BS-26的发酵产酶条件进行了优化,并研究了该菌株产生的纤溶酶的部分性质及酶的分离纯化。通过对芽孢杆菌BS-26菌株的形态和生理生化特征以及16S rDNA分析,将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对枯草芽孢杆菌BS-26菌株产纤溶酶的液态发酵条件进行优化,首先采用单因子试验,筛选出了最佳碳源为糊精、氮源为酵母粉、无机盐为CaCl2、MgSO4·7H2O,然后设计了这四个因素的三水平正交试验,确定最佳培养基配方为糊精3%、酵母粉1%、CaCl20.02%、MgSO4·7H2O 0.07%;采用单因子试验,优化了发酵工艺参数,最佳培养条件为初始pH7.0,接种量为6%,装液量为70／250(mL／mL),摇床温度37℃,转速180r／min,发酵时间60h,在该条件下产酶酶活可达593.03U／mL,是原发酵培养条件下产酶活力的4.5倍。用硫酸铵沉淀枯草芽孢杆菌BS-26菌株发酵液中的蛋白质,透析、真空冷冻干燥后用纤维蛋白平板法检测纤溶活性,并对其性质进行了研究。该纤溶酶在50℃以下和pH5.0-11.0范围内具有较好的稳定性,最适作用温度为42℃；最适作用pH值为9.0；Mg2+、Ca2+对此酶有明显的激活作用,而Cu2+能完全抑制酶的活性；1.0 mg／mLPMSF.1.0mg／mLCHOM和10 mg/mLSBTI能完全抑制酶活性,说明此酶属于丝氨酸蛋白酶类；体外溶纤作用表明,该酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。通过硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和聚丙烯酰胺制备电泳等步骤,从该菌株的发酵液中获得了一种纤溶酶组分,比活力达8750U／mg,回收率为3.2%,所获得样品纯度相对于发酵液提高了41倍,该酶在SDS-PAGE中是单肽链蛋白,分子量为32 kDa。
李圆[8]2013年在《柞蚕溶茧酶的分离纯化、酶学性质表征及其基因克隆与表达》文中研究指明血栓性疾病日益威胁着人们的生命健康,现有的抗栓或溶栓药物种类繁多,根据作用机制不同,发挥着重要的作用。然而这些药物普遍存在半衰期短、纤维蛋白亲和力差或出血风险大等缺陷,因此开发新型溶栓药物仍然十分必要。柞蚕(Antheraea pernyi)属鳞翅目大蚕蛾科,是典型的吐丝营茧昆虫之一。在蚕蛹羽化过程中,下颚腺会分泌吐出液,水解茧壳中的丝胶,蚕蛾便可“脱茧而出”了。在其吐出液中含有一种酶,称其为溶茧酶(cocoonase),不仅可以水解丝胶,还具有精氨酸酯酶活力,与胰蛋白酶性质相近,有望开发成为一种新型溶栓药物。根据前人的初步研究,利用CM-Sepharose FastFlow弱阳离子交换层析和SephadexG-50两步法从柞蚕吐出液中分离得到柞蚕溶茧酶。通过精氨酸酯酶活力测定了其酶动力学参数和最适温度及pH值,利用纤维蛋白原降解实验和纤维蛋白平板实验初步验证了其溶栓功能。根据N端测序的氨基酸序列,设计简并引物,利用RACE技术克隆得到柞蚕溶茧酶基因全长,并利用大肠杆菌和Bac to Bac昆虫杆状病毒表达系统分别进行了原核表达和真核表达。实验结果表明,成功纯化出柞蚕溶茧酶,其酶动力学参数Km值和Vmax分别为2.577×10-3mol/L和4.09×10-3μmol/L/s,且其最适温度和最适pH值分别为30℃和pH8.0。克隆溶茧酶基因全长783bp,编码261个氨基酸,通过BLAST同源性比对发现,柞蚕溶茧酶含有胰蛋白酶家族保守序列"IVGG"。利用MEGA5.0软件进行系统发育树分析,发现柞蚕溶茧酶与家蚕溶茧酶具有62%的相似度,属于同一进化分支。通过PROSITE蛋白数据库分析发现,氨基酸34-260为丝氨酸蛋白酶家族保守域,并且发现多个丝氨酸蛋白酶家族特有的模型。通过细胞毒性试验发现,当样品浓度达200mg/ml时,Hela细胞形态出现变化,活细胞数有所减少。皮内注射柞蚕溶茧酶实验发现,其出血活性(MHD)为2.5mg/kg体重。体外溶血试验中,当加入30μg溶茧酶时,24mg血块几乎全部溶解。在出血活性安全范围内,体内溶栓实验中,注射剂量分别为50、100、150、200μg时,小鼠尾部血栓比例呈逐渐减小的趋势,分别为25.45±4.28%、20.21±7.50%、13.98±4.05%和7.52±1.12%。这表明,柞蚕溶茧酶具有较好的溶栓效果,有望开发成为一种新型溶栓药物。
彭勇[9]2002年在《豆豉溶栓酶的纯化及其基因的克隆与表达研究》文中研究表明利用纤维蛋白平板筛选、纤溶活性测定和体外溶栓实验相结合的方法，成功地从豆豉中筛选到2株纤溶活性较高和具有良好体外溶栓效果的细菌菌株DC-2和DC-4。通过形态观察和生理生化特征分析，DC-2被鉴定为枯草杆菌(Bacillus subtilis)，DC-4被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。它们产生的溶栓酶分别命名为枯草杆菌豆豉溶栓酶(BS-DFE)和解淀粉芽孢杆菌豆豉溶栓酶(BA-DFE)。尚未见有关解淀粉芽孢杆菌能产生溶栓酶的报道。 利用单因素实验和正交分析方法，优化了解淀粉芽孢杆菌DC-4产生BA-DFE的发酵条件，其结果是：接种量为7％；发酵培养基组分为纤维蛋白2.0％，蛋白胨0.5％，糊精2.0％，酵母膏0.15％，K_2HPO_40.4％，NaH_2PO_40.04％，CaCO_30.3％，pH7.0；培养温度为32℃；250mL三角瓶装量为50mL；210rpm振荡培养72h,，在此发酵条件下，该菌产生的纤溶活性可达到820U／mL。 通过硫酸铵分级沉淀、CM-Sepharose Fast Flow和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析和Sephadex G-50凝胶过滤等方法，从解淀粉芽孢杆菌DC-4的发酵液中分离纯化出电泳纯的BA-DFE。对其性质研究结果表明，BA-DFE是单链蛋白质，分子量28kD，等电点8.0，最适反应温度48℃，最适反应pH9.0，具有较好的热稳定性和pH稳定性。该酶属于丝氨酸蛋白酶，其最适底物是Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA。BA-DFE能直接降解纤维蛋白，不能激活纤溶酶原形成纤溶酶。蛋白质测序结果显示，该酶N-端24个氨基酸序列为AQSVPYGVSQIKAPALHSQGFTGS。 根据BA-DFE的N-端序列与Subtilisin BPN高度同源设计引物，PCR扩增出BA-DFE成熟肽编码区片段。测序结果发现，其成熟肽编码区有825bp,编码275个氨基酸残基，推导的N-端序列与测得的该酶N-端序列完全一致，证明了 M川人学博【：学位论文该片段确实是BA．DFE成熟肽编码区。同源性分析表明，BA．DFE基因的核昔酸和氨基酸序列与日本纳豆激酶相应序列分别仅有80刀％和 86．5％的同源性，提示豆鼓溶栓酶可能是一种新型的溶栓酶。 将 BA0FE成熟肽编码区序列克隆到原核表达载体 pET刁 进行了融合与非融合表达。lmmol／L IPTG诱导时，融合表达时产生分子量约为 30kD、带有HIS标签的BA－DFE融合蛋白，非融合表达时则产生分子量为28kD的BA－DFE。表达量都高达菌体可溶性蛋白的40％，主要以包涵体的形式存在，没有检测到纤溶活性。 根据前面研究结果，BA－DFE成熟肽编码区与 Subtilisin BPN的核昔酸同源性高达96厂％，于是设计了一对新的引物，PCR扩增出1．skb的DNA片段。序列分析显示，该片段的核昔酸序列中含有1146hp的开放阅读框，可编码382个氨基酸残基的BA－DFE前体蛋白，包括30个氨基酸残基组成的信号肽、77个氨基酸组成的前导肽和275个氨基酸残基组成的成熟肽。其中，成熟肽编码区序列与前面克隆的序列完全一致，这证明了克隆的DNA片段是BA0FE基因。 将BA0FE基因克隆到大肠杆菌一枯草杆菌穿梭载体pSUGV4中，得到重组质粒pSUGV－BADFE，然后转化到枯草杆菌WB600中进行了分泌表达。转化子WB600（pSUG羽ADFE）在纤维蛋白培养基平板上可产生清晰的水解圈。在LBK液体培养基中培养时，上清液中纤溶活性可以达到 50 IU／mL。对该转化子的发酵液进行了初步分离纯化，测定了BA－DFE的酶学性质，结果与原菌株产生的BA－DFE基本一致，只是用比色法测得的该酶最适反应温度为60℃，与用纤维蛋白平板法测定的数值有差异。 为了探索从我国豆鼓中筛选到的具有较强纤溶活性的枯草杆茵DC－2是否存在与纳豆激酶（NK）基因同源的基因，根据NK基因序列设计引物，PCR扩增出BS｛）FE编码区序列。序列分析表明，该序列也含有825hp，编码275个氨基酸残基，与NK的相应序列分别有 93．4％和 94．5％的同源性。将该片段插入表达载体1）＊＊兄4＊1 中得到重组质粒… ＊x＊S＊＊E，转化大肠杆菌JM109后，经lmnlol／L IPTG诱导4h，大量表达分子量为53kD的GST－BSDFE融合蛋白，表达量约占菌体可溶性蛋白的26％，表达产物主要形成包涵体。
周波[10]2011年在《枯草芽孢杆菌Na-002纳豆激酶基因的克隆、表达及定点突变研究》文中进行了进一步梳理纳豆激酶是从日本传统的大豆发酵食品——纳豆中发现的新型纤溶酶。这种酶具有较高的纤溶活性，无毒副作用，不引起内出血，在体内半衰期长。纳豆激酶无论作为抗血栓药物还是预防血栓栓塞性疾病的保健食品，都具有重要的开发价值。天然的纤溶酶活性往往较低，通过利用体外DNA分子改造等基因操作技术，构建高比活力的工程菌是实现产业化的重要途径。本研究主要进行了以下工作：（1）通过酪蛋白平板初筛和血纤维蛋白平板复筛结合的方法，从豆豉、纳豆样品中筛选到了21株纤溶酶产生菌，获得了一株高产纤溶酶菌株Na-002，纤溶酶活性可达10875U/g，比相关报道的出发菌株活性都要高。（2）通过形态鉴定、生理生化鉴定和16SrDNA序列分析等多项分类法，对Na-002进行了鉴定，确定其属于枯草芽孢杆菌。（3）通过PCR扩增技术，克隆获得了纤溶酶基因，与公布的11株纳豆激酶的核苷酸序列相似性达到99.8%~99.2%，氨基酸序列相似性达到98.6%~99.7%，说明该纤溶酶基因是纳豆激酶系列的一种，该基因的序列保守性强。（4）通过PCR技术克隆得到pro-NK基因，并分别构建pET-32a(+)表达载体、pWB980表达载体与pPIC9K表达载体，实现了在大肠杆菌BL21（DE3）、枯草芽孢杆菌WB800和毕赤酵母GS115中进行表达。实验表明，大肠杆菌表达的酶蛋白表达量高，易于纯化，但是多以包涵体形式存在，需要通过变性复性的方法才能获得有活性的酶；枯草芽孢杆菌表达活性最好，但是表达量少，纯化难度大；毕赤酵母表达系统的纯度高，但存在活性低，表达量相对较小的缺点。（5）通过定点突变的方法，从pH稳定性的角度对该酶基因进行了定点突变研究，获得了S182L、S182W、S182K、L203E、L203K等5个突变体，并实现了毕赤酵母表达。通过对该酶最适pH的测定发现，该酶最适pH的变化与碱基替换呈现出相关性：酸性氨基酸有利于酶在pH值为酸性范围内稳定，而碱性氨基酸有利于酶在pH值为碱性范围内稳定。（6）通过同源建模，推测该酶具有两个结构域：结合结构域（CBM）和催化结构域（CD）。CBM是结合在底物表面的，位于N端，用1scjB（同源性97.183%）作为模板，构建CBM的三维结构，它是由第7个氨基酸到第77个氨基酸共71个氨基酸构成，形成了两个α螺旋和3个β折叠；CD的三维结构用1scjA (同源性98.545%)作为模板来构建,由第78个氨基酸到第352个氨基酸共275个氨基酸构成，形成了一个(β/α)7桶状结构。本研究丰富了纳豆激酶的酶学基础理论知识，并为进一步的基因水平酶分子进化理论的研究以及口服溶栓药物的开发和应用奠定了基础。
参考文献：
[1]. 来源于链霉菌的新型纤溶酶的纯化、特性和基因克隆与表达的研究[D]. 龚勇. 中国协和医科大学. 2000
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[3]. 链霉菌产生的新型纤溶酶的纯化、性质和基因克隆的研究以及溶栓机制的初步探讨[D]. 王骏. 中国协和医科大学. 1997
[4]. 溶栓酶基因的克隆及表达[D]. 肖璐. 四川大学. 2004
[5]. 产纤维蛋白酶和淀粉酶抑制剂放线菌Streptomyces sp.CC5的筛选及其产物的特性研究[D]. 孙志斌. 南京农业大学. 2016
[6]. 枯草芽孢杆菌BS-3纤溶酶的分离纯化及其基因的克隆表达[D]. 张红丽. 河北农业大学. 2011
[7]. 枯草芽孢杆菌BS-26菌株的发酵及纤溶酶的分离纯化[D]. 牛术敏. 河北大学. 2008
[8]. 柞蚕溶茧酶的分离纯化、酶学性质表征及其基因克隆与表达[D]. 李圆. 大连理工大学. 2013
[9]. 豆豉溶栓酶的纯化及其基因的克隆与表达研究[D]. 彭勇. 四川大学. 2002
[10]. 枯草芽孢杆菌Na-002纳豆激酶基因的克隆、表达及定点突变研究[D]. 周波. 山东农业大学. 2011
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