（1陕西中医学院第二附属医院；2咸阳职业技术学院；3.陕西中医学院第一附属医院 陕西 咸阳712000）
【摘要】目的 观察脑泰通颗粒对血管性痴呆（VD）大鼠海马CA1区神经细胞凋亡和Bcl-2及Bax蛋白表达的影响，探讨其作用机理。方法 采用高脂喂养及不同时点分别结扎左、右颈总动脉制备痰瘀阻窍VD模型。设空白组、假手术组、模型组、都可喜组、脑泰通小、中、大剂量组，根据不同要求灌胃4周。结果 脑泰通颗粒大、中、小剂量组能升高大鼠海马CA1区BCL-2蛋白表达，降低Bax蛋白表达，同时能减少细胞凋亡，与模型组比较有显著差异（P<0.05，P<0.01）；结论 脑泰通颗粒治疗VD的机理可能与上调海马CA1区Bcl-2蛋白表达下调Bax蛋白表达从而减少细胞凋亡有关。
【关键词】脑泰通颗粒；血管性痴呆；Bcl-2与Bax蛋白表达的影响
Abstract：Objective To investigate the effect of Naotaitong particles on apoptosis in CA1 region of vascular dementia (VD) rat nerve cells and Bcl-2 and Bax protein expression, and to explore its mechanism. Methods Fat diet and ligated different time left to prepare phlegm orifices VD model the right common carotid artery. And blank group, sham operation group, model group, both gratifying group, Naotaitong small, medium and large dose group, according to the different requirements of 4 weeks. Results Naotaitong particles large, medium and small dose group increased BCL-2 protein expression in hippocampal CA1 area of rats, reduced Bax protein expression, while reducing apoptosis, there was a significant difference between the model group (P <0.05, P <0.01); Conclusion Naotaitong Treated VD mechanism may be related to increases in hippocampal CA1 region downregulation of Bcl-2, Bax expression thereby reducing apoptosis.
Key words Naotaitong particles; vascular dementia; Bcl-2 and Bax protein expression
本实验通过观察该方对痰瘀阻窍血管性痴呆（VD）大鼠海马CA1区细胞凋亡和BCL-2、Bax蛋白表达的影响，探讨其对VD大鼠的疗效和作用机理。
1材料与方法
1.1实验动物
清洁级SD大鼠90只，雌雄各半，体重（240±20）g，由陕西中医学院实验动物中心提供。大鼠在实验前适应性饲养1周。
1.2试剂与仪器
都可喜由施维雅(天津)制药有限公司生产，国药准字H20054931，每片含二甲磺酸阿米三嗪30 mg、萝巴新10 mg。脑泰通颗粒由陕西中医学院附属医院制剂中心提供，批号021026。兔抗Bcl-2多克隆抗体、兔抗Bax多克隆抗体试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。凋亡TUNEL试剂盒购自SantaCurz公司。Morris水迷宫由张家港生物医学仪器厂生产。
1.3VD大鼠模型制备及动物分组
90只大鼠按重量编码，采用随机数字表法分成空白组（n=10）、高脂饮食组（n=80）。高脂饮食组大鼠给予高脂喂养2w后，采用不同时点分别结扎左、右颈总动脉制备VD模型[1]。术后切口外涂红霉素软膏，并肌注青霉素20万U/d，连续3天，预防感染。从高脂饮食组随机选取10只为假手术组，仅分离双侧颈总动脉，不结扎。造模术中死亡6只大鼠（主要为手术中损伤交感、迷走神经和麻醉过量造成），按VD入选标准9只大鼠不合格，剔除实验。将造模成功的55只VD模型大鼠按随机原则分为模型组、都可喜组、脑泰通小剂量组、脑泰通中剂量组、脑泰通大剂量组，每组各11只。
1.4入选标准
造模7d后，用Morris水迷宫对造模大鼠进行学习记忆能力测试，连续测5d，记录错误反应次数，最后1d反应错误次数大于8次作为大鼠痴呆标准。
1.5给药方法
术后第13天开始灌胃给药，根据药品说明书常用量，按体重计算给药剂量。都可喜组：都可喜以0.0895g/kg.d,溶于3ml生理盐水灌胃；脑泰通颗粒大、中、小剂量组分别以脑泰通颗粒2.985、1.893、0.946g/kg.d溶于3ml生理盐水灌胃；空白组、假手术组、模型组每早晚3ml生理盐水灌胃。7组均早晚灌胃，持续4w。
1.6样本采集处理
灌胃4w后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉各组大鼠，4%多聚甲醛灌注后断头取脑，置于4%多聚甲醛溶液中固定8h后取出，依次进行脱水、透明，石蜡包埋，连续冠状切片，厚4-5um。
1.7检测指标
TUNEL法检测细胞凋亡：按TUNEL试剂盒说明书进行。在光学显微镜下观察海马CA1区细胞形态、大小、染色情况，经图像分析仪（每个切片随机选择5个视野）观察计数，结果取平均值。
免疫组织化学法检测BCL-2、Bax蛋白表达：按BCL-2、Bax试剂盒说明书进行。在光镜下随机选择5个视野，取平均值作为海马CA1区BCL-2、Bax蛋白表达。
1.8统计学分析
应用SPSS17.0统计软件分析，所有数据用均数加减标准差（±S）表示，采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果 见表1。
与假手术组比较* P<0.01，与模型组比较⊙P<0.05，⊙⊙P<0.01，与空白组比较⊿P<0.05，⊿⊿P<0.01，与都可喜组比较●P<0.05，与小剂量组比较★P<0.05，★★P<0.01。
3.讨论
VD属中医“中风痴呆”范畴，多由中风发展而来。导师李军教授认为VD主要病理机制是痰瘀阻窍，治疗以“涤痰活血开窍“为原则，并在多年临床研究经验基础上自创脑泰通颗粒方剂，组成主要有：半夏、丹参、蝉蜕、石菖蒲、冰片等中药。前期研究已表明，脑泰通颗粒有防治VD的作用，其机理之一可能与改善血清高胰岛素状态有关[2]。本实验在原有基础上，进一步探讨脑泰通颗粒治疗VD的作用机制。
研究结果显示，VD模型组大鼠海马CA1区可见大量凋亡细胞，且Bcl-2与Bax蛋白表达均升高。脑泰通颗粒小、中、大剂量组海马CA1区Bcl-2蛋白表达升高，Bax蛋白表达降低，凋亡细胞明显减少。本实验表明，脑泰通颗粒治疗VD的机制可能与诱导海马CA1区Bcl-2蛋白表达及降低Bax蛋白表达从而减少细胞凋亡有关。
参考文献：
[1]黄新武，李华，秦大莲，等. 不同时点分别结扎左右颈总动脉建立大鼠血管性痴呆模型[J].中国老年心脑血管病杂志，2010；12（6）：497-498
[2]袁有才，高碧峰，李军. 脑泰通颗粒对血管性痴呆大鼠认知功能影响的实验研究[J].陕西中医学院学报，2006；29（3）：49
论文作者:付小燕1 徐长青2 赫光中2 袁有才3
论文发表刊物:《徐州医学院学报》2015年11月第35卷总第21期
论文发表时间:2016/4/28
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