·论 著·
冻存器官和甲醛固定石蜡包埋组织中RNA的定量表达
吕叶辉1，2，3，黎世莹2，李志宏1，陶瑞旸2，3，邵煜2，胡茜1，杨智昉1，陈忆九2，3
（1.上海健康医学院基础医学院，上海 201318；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；3.四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610065）
摘 要： 目的 定量分析并对比冻存器官和甲醛固定石蜡包埋（formaldehyde-fixed and paraffin-embedded，FFPE）组织中核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）的表达情况。方法 选取不同死亡时间人体脑、心肌和肝组织的冻存及FFPE样本，提取并检测RNA质量浓度，运用实时荧光定量反转录聚合酶链反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）技术分析各RNA指标的扩增效率及相对表达量。结果 与冻存样本相比，FFPE样本中所提取RNA的质量浓度和完整性相对较低。各RNA指标扩增效率与RNA种类及扩增产物长度有关，其中扩增产物较长的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）及β-肌动蛋白（β-actin，ACTB）扩增效率不理想，而5S核糖体RNA（5S ribosomal RNA，5S rRNA）扩增效率理想且在各组织中表达稳定，故选为内参指标。较长死亡时间的冻存样本及FFPE样本中扩增产物较长的GAPDH及ACTB表达量下降，而组织特异性微小RNA（microRNA，miRNA）以及扩增产物较短的GAPDH和ACTB在同一组织冻存和FFPE样本中表达具有一致性。结论 通过标准化RT-qPCR实验，选取合适的RNA指标及设计合适产物长度的引物，能够准确定量FFPE样本中RNA的表达水平。
关键词： 法医病理学；核糖核酸；石蜡包埋；冷冻保存；反转录聚合酶链反应；核糖核酸完整性指数
随着生物医学的不断发展及学科融合，核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）这一生物大分子在死亡时间（postmortem interval，PMI）推断、死亡原因分析、不同体液鉴定等方面的相关研究日益深入，已成为法医学研究焦点之一[1-3]。与信使RNA（messenger RNA，mRNA）相比，非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）不编码蛋白质，如微小RNA（microRNA，miRNA），其长度只有18～24 nt，在生物体内广泛存在，表达具有组织特异性和高度稳定性，是法医学研究理想的分子标志物[4-5]。
与冻存组织相比，甲醛固定石蜡包埋（formaldehyde-fixed and paraffin-embedded，FFPE）组织能保存多年，是法医病理学实践和回顾性研究中最常使用的样本。随着RNA提取技术的进步，已有研究[6-8]证实在FFPE样本中可提取到一定质量的RNA，并用于下游定量分析。但是，现有研究的FFPE样本主要集中在医院手术取材病理组织，缺乏法医学尸检来源FFPE样本中RNA提取及定量研究的相关报道。因此，本研究以不同PMI的人体组织为研究材料，定量检测管家基因mRNA、miRNA等多种RNA在同一组织冻存样本及FFPE样本中的表达情况。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
9700型PCR仪、7500型实时荧光定量PCR仪（美国AB公司），NanoDrop 2000分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司），2100生物分析仪（美国Agilent公司）。
RNAlater保护液（日本TaKaRa公司），TRIzolTM Plus RNA Purification试剂盒（美国Invitrogen公司），RNeasy FFPE试剂盒、miScriptⅡ RT试剂盒、Quanti-Nova SYBR Green PCR试剂盒（德国Qiagen公司），焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水。
利用Design-Expert8.0.6软件对表3进行多元回归拟合，得到山羊发酵乳水解度与菌种添加量/%（X 1）、后熟时间（X 2）、发酵时间（X 3）的二次方程模型为：Y=8.29+0.82X 1-0.069X 2+0.80X 3-0.33X 1X 2+0.57X 1X 3+0.092X 2X 3-1.10X 12-0.81X 22-0.84X 32回归模型的方差分析结果见表4。
1.2 样本收集及总RNA提取
选取4例上海市公安局物证鉴定中心的检案案例，每例均有详细的卷宗记录，编号为1、2、3和4，PMI分别为6h、17h、45h及70h。死者尸体解剖前未经冻融过程，解剖时取脑组织（左额叶皮质）、心肌组织（心尖）及肝组织（左叶），一部分保存在RNAlater保护液中后置于-80℃冻存备用，另一部分进行常规10%甲醛固定（固定时间为20h）、石蜡包埋处理后常规保存备用。本研究方案及样本取材通过伦理委员会审查，并均获得家属知情同意。对于冻存样本，精确称取50g组织按照试剂盒说明书提取总RNA并去除基因组DNA（genomic DNA，gDNA）；对于FFPE样本，保存1年后进行6 μm连续厚切片，每5片放入DEPC水灭菌的微量离心管后，使用RNeasy FFPE试剂盒提取总RNA并去除gDNA。使用NanoDrop 2000分光光度计测定RNA质量浓度及纯度，分别用ng/μL及260nm和280nm波长下的光密度比值（D260/D280）表示。使用2100生物分析仪测定RNA完整性，用RNA完整性指数（RNA integrity number，RIN）表示，10为RNA完整性最好，0为最差。
1.3 指标选择
本研究选择4种ncRNA作为指标，分别为脑组织特异性微小RNA-125b（microRNA-125b，miR-125b）、心肌组织特异性微小RNA-1（miR-1）、肝组织特异性微小RNA-122（miR-122）及5S核糖体RNA（5S ribosomal RNA，5S rRNA）。上述指标的下游引物为通用特异性引物（miScript primer），上游引物（5′→3′）分别为：miR-125b，TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA；miR-1，TGGAATGTAAAGAAGTATGTAT；miR-122，TGGAG TGTGACAATGGTGTTTG；5S rRNA，TCTCGTCTGAT CTCGGAAGC。此外，选择管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）及β-肌动蛋白（β-actin，ACTB），并根据文献[9-10]或设计不同产物长度的引物（较长的用“-L”标识，较短的用“-S”标识），具体如下：GAPDH前引物为共用的CCACATCGCTCAGACACCAT，GAPDHL（323 bp）后 引 物 为 AAGACGCCAGTGGACTCCA，GAPDH-S（71bp）后引物为ACCAGGCGCCCAATACG；ACTB前引物为共用的GCATGGGTCAGAAGGATTCC，ACTB-L（276 bp）后引物为 TGGATAGCAACGTACA TGGC，ACTB-S（58 bp）后引物为 AGGATGCCTCTCT TGCTCTG。
对各RNA指标Ct值进行内参标准化处理（ΔCt=Ct指标-Ct5SrRNA），并以1号冻存样本（PMI为6 h）为对照，运用2-ΔΔCt法计算各指标在冻存样本和FFPE样本中的相对表达量。以脑组织ACTB-S为例，其在不同样本中的相对表达量如图4所示，结果表明，同一组织冻存样本和FFPE样本中ACTB-S的相对表达量高度相关（r=0.945，P＜0.05），证实其在FFPE样本中能有效扩增，且其平均相对表达量（0.721±0.239）与冻存样本（0.795±0.232）相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.4 实时荧光定量反转录聚合酶链反应与标准曲线制备
在各组织冻存样本中（特别是肝组织），GAPDHL和ACTB-L的相对表达量均略低于其对应的短扩增产物的GAPDH-S和ACTB-S，进一步证实随PMI延长RNA降解增加、完整性下降。在FFPE样本中，GAPDH-L和ACTB-L的相对表达量较冻存样本显著下降，表明经FFPE处理后RNA降解明显；但是扩增产物较短的GAPDH-S、ACTB-S及各组织特异性miRNA（miR-125b、miR-1和miR-122）的表达情况与冻存样本相比下降不明显。
相应的，各RNA指标在各组织冻存和FFPE样本中的平均相对表达量如图5所示。
每例样本均检测其RIN，结果如图1所示。各组织冻存样本的RIN值与PMI（6h、17h、45h及70h）有关，随着PMI延长逐渐降低。各组织冻存样本的RIN值均明显高于同一组织FFPE样本的RIN值，表明经甲醛固定石蜡包埋处理后，RNA的完整性显著下降。
1.5 统计学分析
运用RefFinder工具[11]对各指标的Ct值进行统计学处理，筛选内参指标，并对其他RNA指标进行内参标准化处理（ΔCt=Ct指标-Ct内参）后，运用2-ΔΔCt法分析各指标的表达情况，使用SPSS 22.0软件对D260/D280、RIN及扩增效率进行统计分析，采用t检验和Pearson相关分析，检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 RNA质量浓度、纯度和完整性
两种样本提取所得的总RNA均经NanoDrop 2000分光光度计测量质量浓度和纯度，结果如下。在冻存样本中，脑组织所提取的RNA质量浓度为608ng/μL，心肌组织为 449 ng/μL，肝组织为 839 ng/μL，均高于FFPE样本所提取的RNA质量浓度［208 ng/μL（脑组织）、132ng/μL（心肌组织）及342ng/μL（肝组织），P＜0.05］。大部分样本RNA的D260/D280值在1.7～2.0，两种样本间差异无统计学意义（P＞0.05），表明所提取的RNA纯度均较高。
对维吾尔族306个第一前磨牙的解剖形态测量结果见表1。156个上颌和150个下颌第一前磨牙各测量项目的均值(mm)分别为：牙齿全长21.51±1.22、22.08±1.36，冠长8.74±1.06、9.08±0.25，根长13.02±1.22、14.03±0.23，冠近远中径7.68±0.33、7.58±0.43，冠唇(颊)舌径9.72±0.70、8.52±0.45，颈近远中径5.02±0.32、5.16±0.33，颈唇(颊)舌径8.49±0.46、7.42±0.75。
图1 案例1～4中各组织样本的RIN
2.2 RT-qPCR及扩增效率
在所有组织冻存样本中，对各RNA指标均进行RT-qPCR扩增并获得Ct值，观测其扩增曲线及溶解曲线，扩增曲线为标准“S”形曲线，溶解曲线呈单峰，且多样本重合度高，表明各样本RNA指标均成功特异性扩增。在FFPE样本中，总RNA亦均成功反转录并进行RT-qPCR定量，除GAPDH-L和ACTB-L在部分FFPE样本（3号案例的肝组织及4号案例的3种组织）中Ct值超过检测阈值，其余RNA指标均成功特异性扩增。
扩增效率计算使用标准曲线法，以冻存脑组织miR-125b为例，标准曲线如图2所示，k=-3.349，即miR-125b的扩增效率为98.9%。各RNA指标在不同样本中的平均扩增效率如图3所示。在冻存样本中，各指标的扩增效率都接近理想扩增效率（90%～110%）。在FFPE样本中，组织特异性miRNA和5S rRNA的扩增效率较高，与冻存样本类似；而管家基因mRNA的扩增效率与产物长度有关，GAPDH-S和ACTB-S的扩增效率较为理想，但GAPDH-L和ACTB-L扩增效率较差。
图2 冻存脑组织miR-125b的标准曲线
图3 各指标的扩增效率
2.3 内参指标筛选
在各组织样本中选取理想扩增效率的RNA指标作为候选内参指标，分别为：miR-125b、5S rRNA、GAPDH-S及 ACTB-S（脑组织）；miR-1、5S rRNA、GAPDH-S及 ACTB-S（心肌组织）；miR-122、5S rRNA、GAPDH-S及ACTB-S（肝组织）。运用Ref-Finder软件对上述指标的Ct值进行统计学分析，得到各指标的综合稳定度排序为：脑组织中，ACTB-S＞5S rRNA＞miR-125b＞GAPDH-S；心肌组织中，5S rRNA＞ACTB-S＞miR-1＞GAPDH-S；肝组织中，5S rRNA＞miR-122＞GAPDH-S＞ACTB-S。其中，5S rRNA在各组织中稳定性都相对较高，故选为本研究内参指标。
2.4 定量表达情况分析
初始状态下公共负荷为100 Ω,线路电阻分别为8 Ω,5 Ω,2 Ω,0.8 Ω。I1,I2,I3,I4分别表示1#～4#变流器输出的直流电流;P1,P2,P3,P4分别表示1#～4#变流器输出的有功功率。由图6可看出,系统运行约0.3 s时,电流和有功功率分配误差逐渐减少达到均衡,0.8 s时公共负荷突然减少至50 Ω,1.6 s时又突然增加至70 Ω。根据本文提出的控制策略,系统在扰动后能迅速切换到新的工作运行点,实现了分布式电源间输出电流和输出功率的均匀分配,满足负荷可靠供电,系统稳定运行,验证了本控制方法的有效性。
图4 ACTB-S在脑组织冻存和FFPE样本中的表达情况
标准曲线制备：分别将4例冻存或FFPE混合样本的cDNA进行10倍连续梯度稀释后作为制备标准曲线的cDNA模板，进行上述qPCR反应并绘制标准曲线。标准曲线的主要参数包括斜率（k）、截距（b）及决定系数（R2），并通过公式E=（10-1/k-1）×100%计算样本的扩增效率（E）。
实时荧光定量反转录聚合酶链反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）：按照说明书，使用miScriptⅡ RT试剂盒对总RNA进行反转录（reverse transcription，RT），合成的互补DNA（complementary DNA，cDNA）置于-20℃备用；使用QuantiNova SYBR Green PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR，按照试剂盒说明书配制20μL反应体系，并应用7500型实时荧光定量PCR仪进行扩增。每个样本重复3次，结果由系统自动生成，从而得到各RNA指标的循环阈值（cycle threshold，Ct）。
提取所得总RNA的质量检测一般分为浓度、纯度与完整性3项。与前期多数研究[14-15]一致，在FFPE样本中提取所得到的RNA浓度低于对应冻存样本，但可满足后续实验用量。纯度分析结果表明，从所有样本中提取得到的RNA纯度均较高，可用于下游反转录及RT-qPCR实验。完整性分析采用RIN表示，在冻存样本中，RIN值随PMI延长而下降，证实RNA随PMI延长会发生不同程度的降解，导致完整性下降。此外，同一案例中，心肌、脑组织的RIN值均高于肝组织，表明肝组织中RNA较易降解，与前期研究[16]结果一致。与冻存样本相比，FFPE样本RNA的完整性相对较低，表明RNA均发生不同程度降解导致完整性下降，分析与甲醛引起RNA与蛋白质交联及化学修饰有关[17-18]。因此，运用RT-qPCR对FFPE样本中各RNA指标进行定量分析时，一定要按照标准的流程进行。
图5 各RNA指标在冻存和FFPE样本中的相对表达量
3 讨 论
FFPE组织样本是法医病理学研究和实践中重要的材料来源，具有来源充足、可长期保存、疾病类型较多、病理信息丰富等优势。近年来，RNA（特别是小分子miRNA）在死亡原因分析、PMI推断及损伤时间推断等方面的作用也受到法医学者的重视，因此，如能在FFPE样本中提取到高质量的RNA，并准确定量及获取相关基因表达信息，对于上述研究具有重要的科研价值。近年来，随着RNA提取技术的进步和商业化试剂盒的更新，已有研究[12]证实在FFPE样本中可有效提取RNA，并能通过RT-qPCR技术检测各类RNA的表达情况，甚至还可进行高通量分析。此外，法医学尸检组织均经过一定的PMI，而PMI对新鲜（冻存）组织及其对应FFPE样本的影响也值得探究。已有研究[8，13]证实，FFPE样本中RNA的质量与甲醛固定时间和样本保存时间有关，因此，为了对比不同PMI的冻存及同一组织FFPE样本中RNA的质量，并分析管家基因mRNA及ncRNA的定量表达情况，本研究中各样本固定时间与保存时间均是一致的。
如果建立起设计人员和造价人员之间良好的沟通机制，就可以相应减小这种情况带来的问题。从设计开始到设计结束，都要进行技术和经济的权衡，从而最终保证项目设计方案在满足技术指标的同时又能够保证项目建设的经济性。当然，解决问题的关键是在人才培养机制方面下功夫，培养一批既懂设计又懂经济的复合型高素质人才。
本研究RT-qPCR实验严格按照MIQE指南[19]（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）进行，包括标准化的RNA提取、gDNA去除、选取同样量的RNA进行反转录、标准曲线和溶解曲线检验引物特异性、定量PCR反应3次重复、建立标准曲线计算扩增效率及筛选内参指标等，确保定量结果的准确性和可重复性。为了更好地分析mRNA和ncRNA在FFPE样本中的表达情况，除常用管家基因GAPDH和ACTB外，本研究还选择了3种分别在脑、心肌及肝组织中特异性表达的miRNA及常用的内参指标5S rRNA，上述指标均具有一定的代表性。此外，本研究还对管家基因mRNA指标设计了不同扩增片段的引物，以进一步探究各组织样本中RNA的降解程度及产物长度对定量结果的影响。
她的一番话说得罗瑞透心凉，他停下脚步想了一会儿，对他妹妹说：“不行，这事儿不对，咱们得好好想想。走，回家找姐姐商量商量。”
RT-qPCR结果表明，除GAPDH-L和ACTB-L在PMI较长（45h及70h）的FFPE样本中未检出外，其余RNA指标均成功扩增并获得Ct值，但是不同RNA指标的扩增效率在冻存样本和FFPE样本中有差异。冻存样本中各RNA指标的扩增效率都较为理想，而FFPE样本中GAPDH-L和ACTB-L的扩增效率较差，这一方面与PCR受到抑制有关[15，20]，另一方面也表明FFPE样本中RNA发生了不同程度的碎片化，片段较小的miRNA及产物长度较短的mRNA指标可有效扩增[9，21]。
这时，他发现就在十几米处，出现了日本鬼子！战士们纷纷举枪射击。经过一瞬的犹豫，他也开始对着日本鬼子疯狂射击。
RT-qPCR定量分析结果的可靠性与内参指标密切相关，为了筛选出在所有样本均能稳定表达的内参指标，本研究运用能综合分析的RefFinder工具进行筛选，结果表明5S rRNA在所有样本中综合稳定度最高，其表达水平也与各因素无关，是理想的内参指标。之后，对各候选RNA指标进行内参标准化处理，以准确定量各指标在冻存样本和FFPE样本中的表达水平。研究发现，各指标表达情况与其扩增效率有一致性，扩增效率接近理想的RNA指标，其定量结果在两组样本中也高度相关（如脑组织的ACTB-S，r=0.945）。与国内外研究结果[14-15，22]一致，扩增产物较长的管家基因GAPDH-L和ACTB-L在FFPE样本中的表达量显著降低，表明FFPE样本中长链线性RNA的碎片化是不可避免的；而扩增产物较短的mRNA指标（GAPDH-S和ACTB-S）及小分子miRNA，相对不受PMI及FFPE处理的影响，在两组样本中表达具有一致性。
综上所述，尽管FFPE组织样本中的RNA会发生不同程度的降解和碎片化，但通过标准化的RT-qPCR、选取合适的RNA指标及设计合适产物长度的引物，可有效地在组织样本中对管家基因RNA和miRNA进行准确定量，并能在一定程度上反映相关基因的真实表达水平。在后续研究中，本课题组将进一步扩大样本量及扩充指标选择范围，并探讨不同固定时间及保存条件下FFPE样本中RNA的质量及定量表达水平。
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Quantitative Expression of RNA from Frozen Organs and Formaldehyde-fixed and Paraffin-embedded Tissues
LÜ Ye-hui1,2,3,LI Shi-ying2,LI Zhi-hong1,TAO Rui-yang2,3,SHAO Yu2,HU Qian1,YANG Zhi-fang1,CHEN Yi-jiu2,3
（1.School of Basic Medical Sciences,Shanghai University of Medicine&Health Sciences,Shanghai 201318,China；2.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Academy of Forensic Science,Shanghai 200063,China；3.West China School of Basic Medical Sciences&Forensic Medicine,Sichuan University,Chengdu 610065,China）
Abstract： Objective Quantitative analysis and comparison of the expression of ribonucleic acid（RNA）from frozen organs and formaldehyde-fixed and paraffin-embedded（FFPE） tissues.Methods Frozen specimens of human brain,myocardium and liver tissues as well as FFPE samples at different postmortem intervals were collected and mass concentration of RNA was extracted and detected.Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction（RT-qPCR）technology was used to analyze the amplification efficiency and relative expression of each RNA marker.Results The mass concentration and integrity of RNA extracted from FFPE samples were relatively low compared with frozen specimens.The amplification efficiency of RNA markers was related with RNA species and the length of amplification products.Among them,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）and β-actin （ACTB） with relatively long amplification products failed to achieve optimal amplification efficiency,whereas 5S ribosomal RNA（5S rRNA）achieved ideal amplification efficiency and showed quite stable expression across various tissues,therefore it was chosen as internal reference marker.The expression quantity of GAPDH and ACTB in frozen specimens with longer postmortem intervals and in FFPE samples with relatively long amplification products was decreased.The expressions of tissue-specific microRNAs（miRNAs）,GAPDH and ACTB with relatively short amplification products had consistency in the same tissues and FFPE samples.Conclusion Through standardizing the RT-qPCR experiment,selecting the appropriate RNA marker and designing primers of appropriate product length,RNA expression levels of FFPE samples can be accurately quantified.
Keywords： forensic pathology；ribonucleic acid；paraffin embedding；freeze preservation；reverse transcription-polymerase chain reaction；ribonucleic acid integrity number
中图分类号： DF795.1
文献标志码： A
doi： 10.12116/j.issn.1004-5619.2019.04.001
文章编号： 1004-5619（2019）04-0387-06
基金项目： 上海健康医学院种子基金资助项目；上海市法医学重点实验室开放课题资助项目（KF1902）
作者简介： 吕叶辉（1989—），男，博士研究生，主要从事基础医学及法医学教学和科研；E-mail：yeyeliushu@163.com
通信作者： 陈忆九，男，主任法医师，研究员，主要从事法医病理学研究；E-mail：chenyj@ssfjd.cn
（收稿日期 ：2018-07-12）
（本文编辑：张建华）
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