宗瑞谦[1]2003年在《猪囊尾蚴cDNA表达文库的构建、筛选及目的基因的克隆和鉴定》文中提出本研究从猪囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)中提取总RNA，并分离mRNA，进而构建了cDNA表达文库。鉴定结果表明：库容量为2×10~6，重组率为100％。利用抗血清作探针，对cDNA表达文库进行筛选，经初筛、复筛，最后确定了12个阳性克隆。对其中一个阳性克隆进行重组质粒、双酶切及PCR鉴定后，将双酶切产物与克隆载体连接并转化、测序，获得一含有1044bp的开放阅读框的完整基因。登录Genebank比较，此基因与已发表的cC1基因具有高度同源性，其核苷酸同源性为99.9％，氨基酸同源性为99.4％。
景志忠, 才学鹏[2]2004年在《猪囊尾蚴病免疫原的分子生物学研究进展》文中提出猪带绦虫有成虫、虫卵、六钩蚴、囊尾蚴不同形式的发育阶段和寄生状态 ,不同的虫体形式以独特的组织结构和生命活动规律满足其寄生在相应宿主体内的需要[1 ,2 ] 。研究发现 ,六钩蚴与囊尾蚴在虫体组成成分、生化指标以及代谢 (分泌 )产物等方面都有差异。SD
杨洁[3]2003年在《猪囊尾蚴特异性抗原基因的cDNA的分子克隆》文中研究表明目的：囊虫病是由囊尾蚴引起的人兽共患病，是一种世界上分布较广的寄生虫病。囊尾蚴常在脑、眼、心脏等重要器官寄生，其中以寄生于神经系统的脑囊虫病引起的临床症状最为严重，极大危害了人类健康。然而目前临床上对该病的诊断仍以CT或磁共振（MR）作为最主要的客观指标。但鉴于CT或MR高昂费用，因此单凭CT或MR作为标准进行疗效评价及大规模的流行病学普查是很不现实的。研制简便、快速、准确的诊断方法及诊断试剂已成为当前国内外医学专家攻克该病的工作的重点。随着基因工程技术手段不断完善，分离出特异性高、敏感性好的蛋白抗原已成为可能。本研究采用基因重组技术，以开发囊虫病特异性诊断用融合抗原和预防用疫苗为目的，从已构建的猪囊尾蚴cDNA文库中拟筛选出囊尾蚴特异性抗原基因，从而为进一步研究其蛋白质功能、结构奠定基础。 方法：1、病人血清的预处理：将经CT或磁共振（MR）确诊的脑囊虫病人血清按1：10比例稀释于TBS缓冲液中，稀释后血清与液氮反复冻融后的XL1-Blue-MRF'菌裂解液充分混合，室温放置4小时，500g离心10 min，取上清收获吸附后抗血清。2、cDNA文库免疫学筛选：用此血清作为一抗，以辣根过氧化酶标记的羊抗人抗体作为二抗，筛选已构建的猪囊尾蚴cDNA文库，获得含阳性cDNA的噬菌体，经液体培养后提取噬菌体DNA。3、阳性cDNA片<WP=4>段的PCR扩增：以筛选出的噬菌体DNA为模板，利用cDNA插入片段两端的通用引物T3 和T7进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，56℃退火1min，72℃延伸1 min, 30个循环结束72℃延伸10 min。4、cDNA片段的亚克隆：PCR扩增产物经低熔点琼脂糖凝胶回收纯化后，经EcoR I及Kpn I末端修饰与含相应粘性末端的PUC18质粒载体进行体外定向重组，连接产物转化感受态E.coli JM 109，在含氨苄青霉素、IPTG以及x-gal的LB培养基培养，根据β-半乳糖甘酶的α互补原则筛选重组子挑选白色菌落，按碱裂解法提取质粒后进行双酶切，鉴定是否含有插入片段，5、序列测定及同源性比较：用Sanger双脱氧末端终止法测定插入片段的核苷酸序列，用GENETYX软件分析推导核苷酸序列编码的氨基酸序列，并在NCBI中经过BLASTN及BLASTP进行核苷酸及氨基酸序列同源性检索，寻找同源片段。6、进行Northern 杂交分析确定该阳性片段mRNA大小：利用异硫氰酸胍一步法提取猪囊尾蚴总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法测定其完整性、纯度以及含量；走RNA变性电泳（甲醛变性凝胶电泳）分离RNA，以20 x SSC作为转移液经毛细管虹吸作用将变性凝胶中RNA转移至尼龙膜上，80℃干烤2小时固定RNA，以筛选出的阳性cDNA片段为模板按照随机引物标记法对其进行同位素标记制备杂交用探针，与尼龙膜上已经过预杂交的RNA进行杂交反应，洗膜后进行放射自显影，确定杂交信号大小。结果：从cDNA文库中筛选出长度为553bp的cDNA片段（命名为cYI），Northern 杂交结果也显示在0.6 kb 处<WP=5>有一杂交带。该基因片段含有一个开放读码框，位于2-484bp处，编码160个氨基酸，分子量为18.34kDa。序列5'端未发现起始密码子，末端有TAA组成的终止密码子位于第481 bp处； 3'端有poly（A）信号及poly（A）尾巴；其核苷酸序列中（A+T）%=56%，（G+C）%=44%；该片段含有限制性内切酶位点：第38位含有Pst I、83位中含有Sph I、74、283位中含有Rsa I限制性内切酶酶切位点。其氨基酸序列中疏水性残基占33.75%(54/160)、亲水性残基占46.88%(75/160)、中性残基占19.38%(31/160)。经过NCBI中的BLASTN及BLASTP同源序列分析表明cYI片段与编码猪囊尾蚴的一种免疫原性蛋白基因（命名为NC-9）同源性较高，对cYI基因与NC-9基因进行核苷酸序列及氨基酸序列比较发现：cYI基因序列从第8位开始包含了全部NC-9基因，其中仅有8个位点的碱基发生了改变，同源性高达98%；cYI编码的160个氨基酸残基，从第30位的氨基酸开始直到编码序列结束，共有130个氨基酸残基，仅有3个位点的氨基酸残基不同，同源性高达97%。同源序列分析中未发现大片段高同源性的其他物种的基因片段。结论：本实验从猪囊尾蚴cDNA文库筛选出一长553 bp的基因，此基因片段编码的蛋白质能与病人血清发生特异性反应。
广圣芳[4]2007年在《一个新的猪囊尾蚴蛋白的cDNA分子筛选、克隆、表达与鉴定》文中进行了进一步梳理目的:应用免疫学方法筛选猪囊尾蚴cDNA文库,以寻找新的编码猪囊尾蚴病诊断抗原候选分子基因。方法:采集猪囊尾蚴患者血清,用大肠杆菌裂解液吸附去除其中的大肠杆菌抗体:免疫学筛选猪囊尾蚴cDNA文库;在2次复筛阳性的克隆中选取9个进行插入片断的核苷酸序列测定,结果送GenBank进行同源性分析。根据序列测定结果,选取其中四个具完整开放阅读框架的基因,设计合成引物,进行PCR扩增,并将其克隆入PMD-18T载体,然后再亚克隆至原核表达载体PET28a(+)中。经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果:用抗血清初筛了约6.1×10~3个重组噬菌体,得到42个阳性克隆,对其中的18个克隆进行复筛,得到9个持续阳性反应克隆。选取其中有插入片段的4个重组噬菌体单克隆进行序列测定,获得的序列经GenBank进行同源性比较后发现4条序列均为未知的猪囊尾蚴序列,其中编号为5H克隆的插入序列与编码日本血吸虫核糖体样蛋白的基因具高度同源性,其具有一个528bp的完整开放阅读框。PCR法扩增该基因,克隆入载体PMD-18T,再亚克隆入原核表达载体PET28a中,所形成的质粒经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段。IPTG诱导后进行SDS-PAGE,发现在约24KDa位置出现一条表达条带,且随着表达时间的推移,表达产物量增大。Western-blot鉴定结果表明阳性病人的血清可特异性识别此条带。结论:从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选到一批血清学阳性的编码猪囊尾蚴蛋白质的CDNA分子,并对其中的5H进行了克隆、诱导表达和初步鉴定,为进一步将其用于免疫诊断奠定了基础。
黄丽[5]2007年在《猪囊尾蚴cDNA文库的免疫学筛选及基因的克隆、表达及鉴定》文中研究指明目的:从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选免疫学阳性的编码基因,克隆、表达并进行鉴定,为临床猪囊尾蚴患者的免疫学诊断提供特异的重组抗原。方法:经确诊脑囊尾蚴病人血清免疫学筛选猪囊尾蚴cDNA文库,阳性克隆经PCR技术扩增噬菌体载体中插入的DNA片段,并将其克隆入pMD-18T载体中,测序结果与应用EXPASY软件进行分析,获得完整开放阅读框(ORF)基因序列,设计并合成引物PCR法扩增,与T载体连接,转化入XL1-blue大肠杆菌,双酶切鉴定;再将其亚克隆入表达载体pET-28a(+),转化入BL21大肠杆菌,双酶切、测序鉴定后,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot方法观察表达结果。结果:经cDNA文库筛选,初步确定NC膜上深黄色单个噬菌斑为阳性克隆;用上下游载体臂上通用引物PCR法扩增出了200～1800bp不同大小的DNA片断;将其克隆入PMD-18T载体,测序结果应用EXPASY软件分析,获得一个681bpORF DNA序列;PubMed中blast程序确定为一个新基因(命名为Ts1),录入号为EU009656;PCR法扩增出了一个681bp左右的DNA片断,将重组质粒pMD-18T-Ts1、pET-28a(+)-Ts1分别作BamHⅠ和HindⅢ双酶切,均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片断,对插入片断的测序结果表明,Ts1具有一个长度为681bp的ORF,编码227个氨基酸,理论分子量25.86kDa,理论等电点(pI)为6.68;用IPTG诱导重组质粒pET-28a(+)-Ts1,产物行SDS-PAGE,可得到一分子量约28.0kDa融合蛋白,Western-blot法鉴定该蛋白能被脑囊尾蚴病人血清所识别。结论:本试验成功地筛选、克隆和表达了猪囊尾蚴Ts1基因,所获得的目的蛋白有望成为猪囊尾蚴病诊断抗原,其免疫学诊断价值值得进一步研究。
李海龙[6]2006年在《猪囊尾蚴T24基因的克隆、表达与免疫原性分析》文中研究指明从猪囊尾蚴中提取总RNA,用Oligo软件设计T24基因特异性引物,通过RT-PCR扩增出716bp的片段,扩增产物连接到pGEM-T Easy载体中,经酶切鉴定、PCR分析和测序后证明,所克隆的716bp片段含T24蛋白基因完整的开放阅读框(ORF),其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与Genbank登录的T24基因相应序列的同源性分别是98%和100%。将重组质粒pGEM-T24和原核表达载体pGEX-4T-1分别用EcoRⅠ和SalⅠ酶切,亚克隆T24基因至原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,经酶切、PCR和测序鉴定证明,T24基因正确插入到pGEX-4T-1载体。用ITPG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE和Western-blotting分析证实T24基因在大肠杆菌中成功表达,目的蛋白与GST形成融合形式,分子量大小为40ku左右,能被猪囊尾蚴阳性血清所识别;将表达产物免疫小鼠,进行间接ELISA检测,其抗血清能与猪囊虫粗抗原及纯化的T24重组融合蛋白产物发生免疫学反应。将重组质粒pGEM-T24和真核表达载体pPIC9K分别用EcoRⅠ和NotⅠ酶切,亚克隆T24基因至真核表达载体pPIC9K中,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆提取pPIC9K-T24。用SalⅠ内切酶线性化重组质粒pPIC9K-T24,然后电转化毕赤酵母GS115。采用G418浓度梯度法对所有在营养缺陷型选择培养基MD上生长出的转化子进行筛选,获得的高拷贝重组菌株。用PCR检测表明有目的基因整合。用1%甲醇诱导表达重组菌株,通过SDS-PAGE、Western-blotting对表达产物进行分析,结果表明T24基因在毕赤酵母中成功表达,表达产物的分子量为21ku左右,能被人囊虫阳性血清所识别。本研究克隆了猪囊尾蚴T24基因,分别在原核和真核表达系统中进行了表达,证实其表达产物具有免疫原性,从而为研制猪囊尾蚴基因工程疫苗提供了理论依据和实验材料。
余招锋[7]2004年在《猪带绦虫45W-4B基因在大肠杆菌和家蚕中的表达及45W蛋白结构和功能的初步研究》文中认为猪带绦虫 ４５Ｗ 基因家族是由一群结构和功能相似的基因组成的。４５Ｗ 基因在反式剪接作用下产生 Ａ、Ｂ 和 Ｃ 叁型转录本，其中 Ａ 型转录本是由外显子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组成；Ｂ 型转录本由Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ组成；Ｃ 型转录本由Ⅰ和Ⅳ组成，在不同的转录本中的同一外显子有高度的同源性，也存在变异。 ４５Ｗ 基因已被认为是预防猪囊尾蚴病的基因工程疫苗侯选基因之一。本试验成功地从六钩蚴中克隆到 ４Ｂ 基因。通过对 ４Ｂ 基因序列的比较，发现 ４Ｂ 基因是 ４５Ｗ 基因中较为特殊的一个基因，该基因与 ４５Ｗ 其他相关基因之间变异范围为 １７．８％－２０．６％，但该基因在不同虫株间和不同克隆间高度保守。为了研究 ４Ｂ 蛋白的结构和功能，并为研制和开发有效的猪带绦虫基因工程疫苗打下基础，本研究将 ４Ｂ 基因及其 ３′－端的剪切片段克隆到 ｐＥＴ－２８ａ 载体中，并在大肠杆菌 ＢＬ２１ 中成功地表达，与预期分子大小一致，为 １８ ｋＤａ，经 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测，表达的重组蛋白能被猪囊尾蚴病人血清识别，为开发高效猪囊尾蚴基因工程疫苗打下了基础。 ４５Ｗ 基因的这独特的交替剪接形式引起了寄生虫学家们的广泛兴趣。为了研究４Ｂ 蛋白在猪囊尾蚴组织中的结构和功能，试验中利用大肠杆菌表达系统表达的 ４Ｂ 重组蛋白，分子量约为 １８ ｋＤａ，腹腔注射免疫小白鼠，经两次免疫后，采血，并用该血清与猪囊尾蚴组织匀浆蛋白做免疫印迹，发现在 ５０ ｋＤａ 处有一明显的印迹条带，而 １８ ｋＤａ 处没有。表明在猪囊尾蚴组织蛋白中 ４５Ｗ 蛋白各型蛋白可能以同型或异型寡聚体形式存在。用计算机软件分析发现 ４Ｂ 蛋白的抗原性很好，用蛋白质结构数据库 （Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ， ＰＤＢ）比较，发现 ４Ｂ 蛋白（包括 ４５Ｗ 其他型）存在纤连蛋白（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ， ＦＮ）结构域。４５Ｗ 蛋白寡聚体形式组成与纤链蛋白的组织构成十分相似，推测 ４５Ｗ 蛋白与猪囊尾蚴囊壁的形成有关。 家蚕表达系统通过将外源目的基因插入家蚕核多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）多角体启动子（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）的下游，外源基因利用多角体启动子进行转录表达，并分泌到细胞外，从而在细胞上清获得重组目的蛋白。家蚕表达系统（ｓｉｌｋｗｏｒｍ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ， ＢＥＶＳ）表达的目的蛋白能够进行正确的加工、修饰，使目的蛋白更接近于天然蛋白。同时家蚕细胞能识别哺乳动物的分泌蛋白的信号肽序列。４Ｂ 基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体 ｐＶＬ１３９３ 中，通过与家蚕杆状病毒（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ， ＢｍＮＰＶ）在家蚕 Ｂｍ 细胞中共转染，重组到 ＢｍＮＰＶ 中，通过筛选纯化，获得重组病毒。重组病毒感染家蚕细胞和 ５龄家蚕，表达 ４Ｂ 蛋白，分子量约为 １６ ｋＤａ， 与预测的大小相吻合。并用 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ<WP=6>鉴定该重组蛋白能识别猪囊虫病人（猪）阳性血清。４Ｂ 基因在家蚕细胞中的表达对进一步研究 ４５Ｗ 基因的结构功能，并开发出更可行、方便的基因工程疫苗打下基础。
侯俊玲[8]2014年在《猪带绦虫基因组和转录组测序及Wnt基因家族的分析研究》文中研究表明猪带绦虫(Taenia solium)是扁形动物门寄生虫。成虫仅寄生于人体肠道；幼虫则寄生在人或猪的脑、眼和肌肉等组织,引起囊尾蚴病。人脑囊尾蚴病常导致患者出现癫痫等中枢神经系统病症,重则致死。该病呈世界性分布,在中美洲、拉丁美洲、东南亚及非洲环撒哈拉沙漠的一些落后国家和地区广泛流行。该病主要在我国西南等省的部分落后地区流行,直接威胁着食品安全和人民健康。目前,猪带绦虫的基础研究还相对滞后,使其应用研究也遇到一定的困难。我们期待通过基因组测序,从分子水平上揭示猪带绦虫的相关科学问题。本研究利用454和Solexa测序技术相结合的方法,对猪带绦虫进行了全基因组从头测序,获得了高质量和高覆盖度的基因组草图,测序覆盖度达45x,基因组大小为131Mb。注释出11,902个基因。此外,还利用Solexa的RNA测序技术,对经人工肠液激活和未激活的猪囊尾蚴进行了转录组测序。共鉴定出2,766个差异表达基因,其中在激活猪囊尾蚴时期转录上调的基因有1,904个,下调的基因有862个。进一步分析这些差异的基因,发现有68.8%的基因表达明显上调,有31.2%的基因则明显下调。其中,Wnt基因家族及其信号途径变化明显,通过注释发现猪带绦虫Wnt基因家族共有6个成员,Wnt4和Wnt11b在激活后表达明显上调。通过RT-PCR、5'-和3'-RACE克隆获得猪带绦虫Wnt家族基因。Wntl长3,316bp,存在可变剪接形成两种转录本Wntl-1ORF框为1,599bp,由6个外显子组成；Wnt1-2ORF框为1,515bp,由5个外显子组成：Wnt2长21,355bp, ORF框为1,746bp,由6个外显子组成：Wnt4长10,741bp,在5’端也存在不同的剪切形式,但它们的ORF框完全相同,均为1,473bp,由4个外显子组成；Wnt5长12,272bp, ORF框为1,095bp,由5个外显子组成；Wnt11a长3,746bp, ORF框为1,263bp,由6个外显子组成；Wnt11b长14,537bp, ORF框为1,608bp,由6个外显子组成。生物信息学分析发现,猪带绦虫Wnt基因均有信号肽和二硫键,存在多个保守的半胱氨酸、天冬酰胺和甘氨酸位点,具有N-糖基化、磷酸化和N-豆蔻酰化修饰。利用不同物种的Wnt氨基酸序列构建系统进化树发现,扁形动物寄生虫Wntl与其他物种的Wntl不能聚类,而是被单独分为一群,Wnt2、Wnt4、Wnt5、Wnt11a和Wnt11b则在物种进化的过程中较为保守,且扁形动物寄生虫在进化过程中,Wnt家族基因发生了丢失,这种变化可能是寄生虫高度适应寄生生活的结果。筛选确定GAPDH为内参基因,以激活前后的猪囊尾蚴为样本,通过相对定量qPCR实验,发现猪囊尾蚴被激活后,Wnt4和Wnt11b及Wnt经典途径的靶分子LEF1和非经典途径的靶分子NFAT都明显上调,结果与转录组测序结果一致。我们在体外合成了Wnt4cRNA探针,对激活前后的猪囊尾蚴进行RNA原位杂交检测,在激活的猪囊尾蚴尾部检测到Wnt4mRNA信号,推测Wnt4可能通过调控Wnt经典信号途径参与了猪带绦虫幼虫向成虫发育过程中体节的分化。
刘立军[9]2009年在《TSOL18基因的克隆及其表达产物的抗原性与毒性研究》文中研究指明猪囊虫病(Cysticercosis cellulosae)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫—猪囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)感染猪或人而引起的人畜共患寄生虫病。是公认的经济病之一。该病在我国流行广泛,严重危害人体健康,并制约着养猪业发展,因此有效预防控制和诊断猪囊虫病是世界各国普遍关注的焦点。本研究从孵化并激活的猪带绦虫六钩蚴提取总RNA,利用RT-PCR技术成功克隆到猪带绦虫六钩蚴疫苗侯选基因Tsol18基因,构建原核表达载体。为明确Tsol18重组抗原免疫小鼠后的抗体消长情况,将构建的原核表达载体pGEX-4T-Tsol18进行了大量诱导表达,表达产物用琼脂糖凝胶FF柱进行了纯化,采用SDS-PAGE和Western blot分别进行了GST-Tsol18重组蛋白的纯度和活性分析;纯化后的重组蛋白经皮下接种免疫BALB/c小鼠,用ELISA法对免疫后不同时间的小鼠血清进行了测定。结果显示,GST-Tsol18重组蛋白主要以可溶性形式表达;可以被猪囊尾蚴阳性血清识别,ELISA检测结果显示在免疫后第7d能够检测到相应的抗体,由于免疫剂量不同,在免疫后各组抗体水平的峰值出现的时间不同,但都集中在第28～49d,表明GST-Tsol18重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。对接种免疫的BALB/c小鼠进行临床观察,并在不同时间采集小鼠的的内脏器官和接种部位的肌肉组织,通过HE染色镜检,除接种部位肌肉组织在接种初期出现少量炎症外,未发现明显的病理变化,临床观察未见小鼠异常反应和变化。说明该重组抗原对小鼠无毒害作用。可以作为猪囊虫病的诊断抗原和疫苗侯选抗原。
鲁琨[10]2008年在《猪囊尾蚴10kD基因的克隆、表达及重组蛋白ELISA方法的建立》文中研究说明猪囊尾蚴病是一种重要的人畜共患寄生虫病,不但引起猪肉品质下降,而且给人类健康造成重大危害。目前,猪囊尾蚴病的免疫诊断和免疫预防是国内外学者的关注的热点。本研究通过基因工程方法克隆猪囊尾蚴囊液10kD基因,构建重组表达载体,得到高效表达;利用镍亲和层析方法纯化高效表达蛋白;利用蛋白建立间接ELISA方法来检测猪囊尾蚴病抗体。为猪囊尾蚴病检测试纸条、试剂盒的研制提供重要参考依据。1、利用PCR技术对猪囊尾蚴囊液10kD基因进行扩增,得到258bp的基因片断。将10kD基因克隆入表达载体pET32a中,构建载体PET32a-TS10-1;经过PCR扩增和双酶切鉴定及测序分析,证明该基因正确插入到克隆载体中,且阅读框正确;序列分析证明该基因与排泄分泌抗原B抗原基因同源性为100%,从而证明该基因与排泄分泌抗原之间存在较近的亲缘关系。重组的pET32a-TS10-1质粒转化至BL21(DE3)宿主菌中;经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达后,在SDS-PAGE鉴定中可见表达产物分子质量约为29kD,与理论推测蛋白分子量一致;经Western blot证明该表达蛋白可以被兔抗囊尾蚴囊液多抗血清特异性识别,该表达蛋白可作为基因工程诊断抗原。2、经过收集诱导表达菌体、超声波裂解后,证明该蛋白属于可溶性表达;通过经过镍鳌合层析柱对于该蛋白进行纯化。通过改变咪唑浓度﹑调整流速、作用温度等极大地提高了纯化蛋白的纯度和回收量;在Western blot试验中,不需经过酶切的可溶性蛋白可与兔抗囊尾蚴多抗血清表现特异性结合,说明融合蛋白具有较好的反应性,为囊尾蚴病快速诊断提供研究基础。3、用纯化的表达蛋白作为包被抗原包被酶标板,初步建立快速检测猪囊尾蚴病的间接ELISA方法。抗原包被浓度为3.145μg?mL-1;抗体稀释度为1:20,37℃作用45min;羊抗猪酶标二抗稀释度为1:2000,37℃作用45min;底物溶液室温显色10min;经过特异性﹑敏感性试验进一步表明,建立的间接ELISA方法特异性强﹑灵敏度高。为进一步组装诊断试纸条﹑试剂盒奠定了物质基础,也为囊尾蚴病的诊断与检测提供一种简便﹑快捷﹑价格低廉的技术手段。
参考文献：
[1]. 猪囊尾蚴cDNA表达文库的构建、筛选及目的基因的克隆和鉴定[D]. 宗瑞谦. 甘肃农业大学. 2003
[2]. 猪囊尾蚴病免疫原的分子生物学研究进展[J]. 景志忠, 才学鹏. 中国兽医科技. 2004
[3]. 猪囊尾蚴特异性抗原基因的cDNA的分子克隆[D]. 杨洁. 河北医科大学. 2003
[4]. 一个新的猪囊尾蚴蛋白的cDNA分子筛选、克隆、表达与鉴定[D]. 广圣芳. 安徽医科大学. 2007
[5]. 猪囊尾蚴cDNA文库的免疫学筛选及基因的克隆、表达及鉴定[D]. 黄丽. 安徽医科大学. 2007
[6]. 猪囊尾蚴T24基因的克隆、表达与免疫原性分析[D]. 李海龙. 石河子大学. 2006
[7]. 猪带绦虫45W-4B基因在大肠杆菌和家蚕中的表达及45W蛋白结构和功能的初步研究[D]. 余招锋. 西北农林科技大学. 2004
[8]. 猪带绦虫基因组和转录组测序及Wnt基因家族的分析研究[D]. 侯俊玲. 中国农业科学院. 2014
[9]. TSOL18基因的克隆及其表达产物的抗原性与毒性研究[D]. 刘立军. 甘肃农业大学. 2009
[10]. 猪囊尾蚴10kD基因的克隆、表达及重组蛋白ELISA方法的建立[D]. 鲁琨. 河南农业大学. 2008
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