胥全彬[1]2000年在《RAPD鉴别片形吸虫及相关应用研究》文中指出片形吸虫属于片形科（Fasciolidae Raillet，1895）的片形属（Fasciola Linnaeus，1758）。据Yamaguti（1972）分类记载，该属吸虫有6个种，其中寄生在家畜和人体的主要是肝片吸虫（Fasciola hepaticaLinneuus，1758）和大片吸虫（Fasciola gigantica Cobbold，1855）。两虫不仅危害大，而且形态极相似。本实验室在南京市江宁县采集的片形吸虫中，发现了一些形态不典型的片形吸虫。为了确认该虫的分类地位，本实验室从形态学方法及RAPD技术对该片吸虫进行区分。此外还就RAPD的重复性等方面作了一些探讨，结果如下： （1）本实验以来自广西、广州、内蒙、黑龙江、江苏、英国、德国等形态典型的片形吸虫为对照，以虫体的肩部、体长、体宽及其比值为标准，对采自江苏江宁县的肩部特征不典型片形吸虫进行形态学研究。从虫体的体长、体宽及其比值来看，该片形吸虫介于肝片形吸虫和大片形吸虫之间；而从虫体的肠分支来看，则应为大片形吸虫。 （2）随机扩增多态性DNA（RAPD）技术，对6株片形吸虫总DNA进行扩增，结果10条中有8条引物能产生扩增图谱，电泳图谱经聚类分析后，与传统的分类结果一致，表明来自江宁的片形吸虫既有形态典型的肝片形吸虫也有形态不典型的大片形吸虫。 （3）RAPD的重复性一直是研究人员关注的问题。本实验以江宁肝片形吸虫为试验材料，探讨了PCR仪、不同批次的Taq酶对RAPD重复性的影响。结果表明不同PCR仪对试验存在影响，而不同批次的Taq酶对试验的影响则未检测出来。 此外，本实验还运用RAPD技术对肝片形吸虫、长菲策吸虫及日本血吸虫进行扩增，结果筛选到三条RAPD条带，分别为三种吸虫所特有，可望发展成蠕虫学中具有虫卵鉴别意义的探针。
唐远菊[2]2008年在《SSR标记和SCAR标记对片形吸虫的分类鉴别研究》文中研究表明片形吸虫是一种危害牛羊等反刍兽和人类的寄生性蠕虫,常见的有两个种:肝片吸虫(Fasciola hepatica)和大片吸虫(Fasciola gigantica)。牛、羊片形吸虫病呈全球性流行,在全球每年造成约20亿美元的经济损失。同时该病的人畜共患性也给疫区人民的身体健康带来严重危害。两种片形吸虫在形态上及其相似,但在虫体抗原性、免疫原性、对宿主的致病性、对药物的敏感性等方面均存在差异,所以正确鉴别片形吸虫的种类,不仅是研究片形吸虫的基础及前提,且也对防治片形吸虫病具有重要意义。长期以来,片形吸虫的分类鉴定主要依据成虫的形态、生活史、流行病学等特征来进行,这在分类学的发展上曾经起了重要的作用。但由于片形吸虫种内个体差异较大,同一虫种又因宿主种类、宿主反应的不同而异,导致虫体的形态不规则。鉴于传统分类方法的局限性,研究人员不得不另辟途径。随着细胞学、分子生物学的发展,学者们开始从细胞、分子水平探讨片形吸虫的遗传变异及分类,其中分子遗传学分类方法是近年来的研究热点。虽然研究者建立了多种分类方法,但得到的结果却存在一定差异,所以人们不得不转向其它的分类方法。SSR标记和SCAR标记是近年来发展起来的新型分子标记。SSR由于种类多、分布广泛、高度多态性、杂合性高、重组率低、按孟德尔共显性方式遗传等优点,非常适用于寄生虫虫种的鉴别和分类学的研究。SCAR标记是一种十分稳定的分子标记,方便、快捷、可靠,可以快速检测大量个体,结果稳定性好,重现性高,这两种标记为片形吸虫的分类提供了思路。本课题从重庆、四川、广西采集不同宿主片形吸虫成虫样本,并用SSR标记和SCAR标记对其进行研究。一、用SSR标记进行研究:提取片形吸虫DNA,利用网上搜寻的SSR引物对其进行扩增,PAGE电泳,根据电泳结果进行片形吸虫的遗传多样性分析和聚类分析;二、用SCAR标记进行研究:提取片形吸虫DNA,利用6种ISSR引物对其进行扩增,从中寻找片形吸虫的特异片断,并回收克隆测序,根据测序结果重新设计SCAR引物进行转化,使其能有效区分不同种的片形吸虫。获得的主要结果如下:1.网站http://bioinformaties.pbebase.latrobe.edu.au cgi-bin/ssr提供各种物种的EST-SSR序列及其引物,从中搜索片形吸虫的SSR序列,得到4条,由于数量太少,所以我们同时搜索了近源种日本血吸虫和曼氏血吸虫SSR序列,分别得到了6183条和8133条序列。通过设定筛选条件,共筛选了17对SSR引物,其中片形吸虫SSR引物4对,日本血吸虫SSR引物6对,曼氏血吸虫SSR引物7对。用这17对SSR引物对8个来自重庆、四川和广西的不同宿主的片形吸虫样本进行扩增,PAGE电泳,结果显示有13对SSR引物能够进行有效扩增。13对SSR引物总共检测到了79个等位基因,每对SSR引物能检测到4-10个,平均为6.2个,反映了片形吸虫的遗传多态性较高。2.根据SSR条带,构建0,1矩阵,并用NTSYS-pc软件计算8个片形吸虫样本之间的遗传相似系数。结果表明,片形吸虫种间差异为0.425—0.5,肝片吸虫种内差异为0.2—0.4,两株大片吸虫种内差异为0.3625,说明片形吸虫种间差异大于种内差异,种内变异也比较明显。3.根据相似系数用NTSYS-pc软件对本研究的8个片形吸虫样本进行聚类,8个样本被聚为两类,第一类为大片吸虫,包括广西水牛源样本和重庆水牛源暂定种样本,第二类为肝片吸虫,包括重庆奶牛源、黄牛源、水牛源和黄羊源样本以及四川牦牛源样本。第二类又可以分为两个亚类,第一亚类为四川牦牛源样本,第二亚类包括除重庆水牛源暂定种样本外其他采自重庆不同宿主的片形吸虫样本。初步说明SSR标记不仅能够区分大片吸虫和肝片吸虫,还能够区分出片形吸虫的不同地理株。4.用6种ISSR引物对来源重庆、四川以及广西的片形吸虫进行PCR扩增,结果发现引物(GACA)_4和引物(AG)_8能够扩增出特异片断,其中引物(GACA)_4能在肝片吸虫中扩增出两条900bp左右的特异片断,命名为ISSRF.h1和ISSRF.h2,能在大片吸虫中扩增出一条约900bp的特异片断,命名为ISSRF.g;引物(AG)_8能够在肝片吸虫中扩增出一条300-400bp的特异片断,命名为ISSRF.h3。将这些片断回收克隆测序,序列结果显示,ISSRF.h1片断长919bp,ISSRF.h2片断长806bp,ISSRF.h3片断长364bp,ISSRF.g片断长845bp。5.根据测序结果,在片断两端包括ISSR引物再延伸4-7bp设计了4对SCAR引物,其中3对肝片吸虫SCAR引物,命名为SCARF.h1、SCARF.h2、SCARF.h3,1对大片吸虫SCAR引物,命名为SCARF.g。以所采集的样本进行验证实验,结果表明,3对肝片吸虫SCAR引物均能在肝片吸虫中产生一条特异条带,在大片吸虫中均没有扩增;1对大片吸虫SCAR引物能在大片吸虫中产生一条特异条带,在肝片吸虫无扩增。表明4个SCAR标记均转化成功,它们能有效区分不同种的片形吸虫。6.从重庆地区的水牛体内采集到一株片形吸虫,它具有不典型形态,体长＞3cm,长宽比＞3,肩不明显,后端钝圆,睾丸占体长的2╱3,难以判定其种别,怀疑为“中间型”。经SSR标记和SCAR标记鉴定,我们认为这是一株形态不典型的大片吸虫。
郭田田[3]2016年在《云南大理市片形吸虫的分子鉴定及部分线粒体DNA的序列研究》文中研究指明[目 的]对云南省大理市片形吸虫的种类进行分子鉴定,并对其部分线粒体DNA序列进行研究,旨在从分子水平上揭示我国云南省大理市片形吸虫的种类、遗传结构及生物学特性。[方法]1、收集成虫样品及形态学鉴定：片形吸虫成虫取自云南省大理市病牛的肝胆管内,根据体形、肩部特征、虫体的长宽比例、肠管的分支等形态学特点将其初步分成两种,即肝片形吸虫与巨片形吸虫。2、基因组DNA的提取及鉴定：取一个虫体的1/3,用生理盐水反复进行冲洗,再用超纯水反复冲洗4-5次,置于一已消毒的1.5m1的离心管中。用组织剪尽可能的将虫体剪成碎块后再用组织研磨仪进行充分研磨,加入Buffer GL 180μl、Proteinase K 20μl、RNase A10μl,将得到的组织混合液置于56℃水浴箱中过夜,按照TaKaRa MiniBest Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0试剂盒说明书提取基因组DNA,并用紫外分光光度计检测其纯度,于-20℃冰箱保存。3、PCR扩增及测序：用PCR扩增技术对片形吸虫核糖体ITS-2及线粒体cox1、nadl、nad5基因序列进行扩增,并将PCR产物送至昆明硕擎生物科技公司进行测序。4、序列分析及构建系统进化树：用DNAStar7.0软件将得到的序列与已报道的片形吸虫核糖体ITS-2线粒体cox1、nadl、nad5基因序列进行相似性比较,并用MegAlign软件对线粒体cox1、nadl、nad5基因序列构建系统进化树。[结果]1、以核糖体ITS-2作为遗传标记将来自云南省大理市的6个片形吸虫样品鉴定为两种,即肝片形吸虫和巨片形吸虫。2、获得了云南省大理市片形吸虫线粒体cox1、nadl、nad5片段的基因序列,经分子Marker(DL2000)和测序鉴定,三个基因片段大小分别为385bp、380bp、303bp,与预期目的基因大小相符。3、序列相似性分析显示各序列片形吸虫的种间分歧度分别为6.5%-7.4%、8.7%-9.4%、13.2%-14.8%;种内分歧度分别为0.3%-1.0%、0-2.6%、0.3%-3.6%。4、三个基因片段的分子进化树显示：云南省大理市肝片形吸虫样品与GeneBank中已发表的其它不同地域肝片形吸虫种株较紧密的聚集在一起,没有明显的分化；巨片形吸虫样品与其它不同地域巨片形吸虫种株较紧密的聚集在一起,分化不明显,但肝片形吸虫和巨片形吸虫种问分化则比较明显,且系统进化树显示结果与序列分析结果一致。[结论]1、云南省大理市至少存在肝片形吸虫与巨片形吸虫两种片形吸虫。2、云南省大理市片形吸虫存在着不同程度的遗传变异,其种内变异不明显,种间分化则比较显著。
董世娟[4]2004年在《我国片形吸虫核糖体DNA及线粒体DNA多态性的研究》文中研究说明本文对来自我国广西、四川、贵州、江苏、甘肃、黑龙江等省的不同宿主的76株片形吸虫进行核糖体DNA和线粒体DNA多态性的研究，用法国的肝片吸虫做对照样本，并将测序结果与GenBank~(TM)中已发表的片形吸虫DNA序列进行比较，旨在从基因水平上明确我国片形吸虫的遗传变异水平。 根据Huang等发表的片形吸虫核糖体DNA(rDNA)的第二内转录间隔区(ITS-2)序列，设计两对特异性引物，优化PCR反应条件，建立特异PCR方法来鉴别片形吸虫的种类，并评价此方法的特异性和敏感性。结果76株片形吸虫经特异PCR鉴定被分为三“类”，即肝片吸虫、大片吸虫和两个虫种的“中间型”，而且三“类”代表性样品ITS-2部分片段的测序结果也证实了上述结论；此方法与寄生于牛或羊的其它虫体如前后盘吸虫、胰阔盘吸虫、日本分体吸虫、牛弓首蛔虫无交叉反应性；能检测到的大片吸虫最低DNA量是350pg，能检测到的肝片吸虫最低DNA量是110pg。 选择经特异PCR方法鉴定的三“类”片形吸虫的代表性样品36株，参照基因库已发表的肝片吸虫第一内转录间隔区(ITS-1)序列设计一对保守引物，首先扩增出ITS-1部分序列，再经单链构象多态性(SSCP)分析方法进行分析，结果SSCP显示三种带型，第一种为大片吸虫的带型，第二种为肝片吸虫带型，第三种为两种带形的混合带型。对代表性样品的ITS-1进行测序，结果ITS-1全长为422bp，共有5个变异位点；根据ITS-1序 广西大学硕十论文我国片形吸虫核糖体DNA及线粒体DNA多态性的研究列变异位点可区分出两种片形吸虫;表现为混合带型的样品在变异位点具有肝片吸虫和大片吸虫的碱基重叠现象。此结果和特异pCR方法鉴定的结果相互支持，表明!Ts一1片段亦可作为遗传标记来研究片形吸虫的多态性。 在研究核糖体DNA的基础上，对76株片形吸虫线粒体基因组细胞色素氧化酶亚基1基因部分序列(pcoxl)和线粒体NAOH脱氢酶亚单位1基因部分序列(pnadl)进行PCR扩增及DNA单链构象多态性(SSCP)分析。结果76株虫体均成功地扩增出约450bp的peoxl基因片段和约200bp的pna引基因片段;SSCP分析显示出不同地区或同一地区的不同样品在p coxl和pna川的SSCP带型上均存在多态性:将18个代表性样品的p coxl基因和11个代表性样品的pna川基因分另lJ进行测序，测序结果显示我国片形吸虫Pcoxl序列和pnadl序歹IJ种间差异均大于种内变异，且两段基因的遗传图谱相似，样品的分类情况相同。除了南京「hNJG4和甘肃「hGSGI两个样品外，经特异PCR鉴定为“中间型”的样品的p coxl和pna川序歹Ij全部和大片吸虫的相应序列相似性高，这个结果和韩国、日本片形吸虫的研究结果相似，提示大片吸虫有可能是“中间型”片形吸虫的母性祖先。 本项目通过对我国片形吸虫核糖体DNA和线粒体DNA多态性的研究，阐明了我国片形吸虫的遗传变异水平。特异P保方法敏感性好高、特异性好，为片形吸虫的分子流行病学调查、片形吸虫的分类学及种群遗传结构研究奠定了基础。
王冬英[5]2006年在《广西片形吸虫流行情况，在中间宿主体内的发育与分类学的初步研究》文中研究指明本文采用胆囊检查法对广西水牛和黄牛片形吸虫的感染情况进行了调查，并对片形吸虫在中间宿主体内的发育过程以及三种片形吸虫的形态学及PCR鉴定进行了研究。 从屠宰场收集水牛和黄牛胆囊，在收集胆囊的过程中粗略地观察肝脏病变，胆囊检查主要检查胆囊中是否有片形吸虫虫体或虫卵，以及胆囊是否有病变，结果发现有虫或虫卯的判为阳性，有眼观病变但无虫及虫卵的定为可疑，无眼观病变且无虫卯的为正常。结果水牛阳性率为57.24％，可疑28.96％，正常13.8％；黄牛阳性率为52.8％，可疑为7.87％，正常为39.33％。 片形吸虫在中间宿主体内的发育情况研究：三种片形吸虫毛蚴分别感染广西小土蜗螺，每只螺感染1～5条毛蚴，另设对照组，感染前后用去氯离子水饲养，用生菜饲喂。结果在水温20～28℃(室温22.5～32℃)，其中有两天为16，17℃时，对照组和感染肝片形吸虫组的没检查到各期幼虫，感染大片形吸虫和中间型片形吸虫毛蚴的在感染后28天见螺体内有自由的尾蚴，34～36天开始有尾蚴从螺体逸出。 在种类鉴别方面，可以根据虫体的形态将片形吸虫大体分为三类：肝片形吸虫，大片形吸虫和中间型片形吸虫。ITS-2特异PCR也已初步证实
胥全彬, 沈永林, A, Daugschies[6]2001年在《片形吸虫DNA随机扩增多态性分析》文中研究指明为区别从南京市江宁县采集的片形吸虫非典型形态虫体 ,应用随机扩增多态性 DNA( RAPD)技术 ,对6株片形吸虫总 DNA进行了扩增。结果 ,1 0条引物中有 8条能产生扩增图谱 ,电泳图谱经聚类分析 ,与传统的分类结果一致 ,并表明来自江宁的片形吸虫既有形态典型的肝片形吸虫 ,也有形态不典型的大片形吸虫
唐梦婷, 周岩, 程娜, 许学年[7]2019年在《片形吸虫分类鉴定的研究进展》文中研究指明片形吸虫是牛羊及其他哺乳动物胆管内常见寄生虫,主要有肝片形吸虫和巨片形吸虫,两者形态相似,对其鉴定一直是研究的热点之一。近年来现代生物学技术已广泛运用于寄生虫的分类学研究,本文拟阐述染色体分析、蛋白质多态性以及分子遗传学技术用于片形吸虫种类鉴定的研究进展,揭示片形吸虫的种内差异,种间差异和亲缘关系。
沈永林, 胥全彬, 张洪英[8]2002年在《片形吸虫种类鉴定的分子生物学研究进展》文中研究说明片形吸虫是反刍动物的重要病原 ,主要有肝片吸虫和大片吸虫 ,两者形态极相似 ,故对其鉴定一直是研究的热点。近年来应用分子生物学技术 ,由蛋白质、染色体、特定基因组 DNA等不同分子水平鉴定片形吸虫种类的研究报道较多 ,揭示了片形吸虫的种内差异 ,种间差异和亲缘关系 ,从而为片形吸虫 (尤其是中间种和亲缘种 )种类鉴定提供了新途径。就此进展作一概述。
郭莉[9]2003年在《四种后睾科吸虫的遗传多态性研究》文中提出本试验以台湾次睾吸虫(Metorchis taiwanensis)、鸭对体吸虫(Amphimerus anatis)、华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)及截形微口吸虫(Microtrema truncatum)为材料，应用随机扩增多态性DNA技术对这四种后睾科吸虫基因组DNA进行遗传多态性研究。试验采用改进的酚／氯仿法进行基因组DNA的提取，结果表明所提DNA完整，没有断裂或降解，大小均在23.1kb左右，经DNA纯度鉴定OD_(260)／OD_(280)值在1.8左右，符合要求；试验对RAPD扩增条件进行优化，对模板、Taq酶、dNTP的浓度、退火温度及退火时间等影响因素进行梯度筛选，经过反复的试验，确定了RAPD最佳扩增体系及反应程序。采用该扩增体系和程序，在严格控制反应条件、规范操作，保证反应条件前后一致的前提下，获得了稳定的、可重复的结果。试验从40条随机引物中筛选出20条多态性及重复性好的引物，共扩增出310个DNA谱带，其中多态带为307条，多态率为99.03％。单个引物扩增片段数在6～23之间，扩增出的条带大小在202～2460bp之间，扩增条带最多的引物是S22，为23条，最少的引物是S477，为6条。引物S130、S232和S341各扩增出一条共同条带；用AVERAGE(平均距离法)进行遗传距离聚类分析，结果表明：鸭对体吸虫和华支睾吸虫的遗传距离为0.7944，两者亲缘关系最近，最先聚在一起，截形微口吸虫与台湾次睾吸虫的遗传距离最大，为0.9306，亲缘关系最远，最后聚在一起，与传统分类结果基本一致。
郭明佳[10]2016年在《青海藏羊片形吸虫生物学特性研究》文中研究说明本研究以青海藏羊体内片形吸虫和片形吸虫中间宿主椎实螺为研究对象,结合形态学和分子分类学方法进行了螺体内蚴虫以及成虫的虫种分类、鉴定。采用压片镜检的方法对青海省部分地区中间宿主螺、螺体内蚴虫感染率进行了调查,同时,用大蒜素和苦参碱两种植物提取物对椎实螺进行了急性毒性试验,以在实验室条件下,筛选出杀死中间宿主螺的有效药物,结果如下:1.在椎实螺中收集到雷蚴、尾蚴并在培养青海萝卜螺的水中收集到囊蚴。经形态学初步鉴定三种蚴虫均为肝片吸虫蚴虫,进一步提取寄生于蚴虫基因组DNA,对18S r RNA基因片段进行克隆与测序,对收集到的蚴虫进行分子分类学鉴定,所测片段长度为1805bp,用DNAMAN进行序列比对分析,显示与Gen Bank中的大片吸虫(Fasciola gigantica)18S r RNA基因序列相似性为92.03%,与肝片吸虫(Fasciola hepatica)的相似性为99.12%。综合同源进化树图谱可以进一步确定所收集的蚴虫为肝片吸虫的蚴虫。2.传统的形态学鉴定方法无法对肝片吸虫及大片吸虫的中间种类进行分类鉴定,本试验对其成虫采用18S r RNA基因克隆及序列分析的方法,测出目的片段大小为1834bp。并将测得序列用DNAMAN软件与Gen Bank中已发表的大片吸虫的18S r RNA基因序列比对,其相似性为92.92%,与肝片吸虫的18S r RNA基因序列相似性为99.78%,结合同源进化树图谱可以确定所采成虫样品为肝片吸虫。3.试验中发现所调查地区的椎实螺主要有三个种,分别为青海萝卜螺(Radix cucnnorica)、椭圆萝卜螺(Radix swinhoei)和狭萝卜螺(Radix lagotis)。通过对螺体进行压片镜检及在实验室条件下培养椎实螺,结果发现:椭圆萝卜螺体内未发现肝片吸虫蚴虫寄生,狭萝卜螺体内发现雷蚴寄生,感染率较低,10%。青海萝卜螺体内发现有雷蚴和尾蚴寄生,感染率较高,达41.33%,随后在培养青海萝卜螺的器皿中成功收集到囊蚴,而在狭萝卜螺和椭圆螺的培养过程中并未收集到囊蚴。表明青海藏羊肝片吸虫的主要中间宿主螺为青海萝卜螺。4.利用大蒜素和苦参碱两种植物提取物对椎实螺在实验室条件下浸杀灭螺效果进行了试验,研究发现,大蒜素经48h,浓度为8mg/L的条件下,死亡率为70%;苦参碱经96h,浓度为24mg/L的条件下,死亡率为100%。这两种提取物的48h的半数致死浓度(LC50)分别为6.02mg/L和45.55mg/L。表明大蒜提取物对椎实螺的灭杀效果较苦参提取物的灭杀效果好,即椎实螺对大蒜提取物的抵抗能力比对苦参提取物的抵抗能力弱。
参考文献：
[1]. RAPD鉴别片形吸虫及相关应用研究[D]. 胥全彬. 南京农业大学. 2000
[2]. SSR标记和SCAR标记对片形吸虫的分类鉴别研究[D]. 唐远菊. 西南大学. 2008
[3]. 云南大理市片形吸虫的分子鉴定及部分线粒体DNA的序列研究[D]. 郭田田. 昆明医科大学. 2016
[4]. 我国片形吸虫核糖体DNA及线粒体DNA多态性的研究[D]. 董世娟. 广西大学. 2004
[5]. 广西片形吸虫流行情况，在中间宿主体内的发育与分类学的初步研究[D]. 王冬英. 广西大学. 2006
[6]. 片形吸虫DNA随机扩增多态性分析[J]. 胥全彬, 沈永林, A, Daugschies. 中国兽医学报. 2001
[7]. 片形吸虫分类鉴定的研究进展[J]. 唐梦婷, 周岩, 程娜, 许学年. 中国病原生物学杂志. 2019
[8]. 片形吸虫种类鉴定的分子生物学研究进展[J]. 沈永林, 胥全彬, 张洪英. 动物医学进展. 2002
[9]. 四种后睾科吸虫的遗传多态性研究[D]. 郭莉. 四川农业大学. 2003
[10]. 青海藏羊片形吸虫生物学特性研究[D]. 郭明佳. 青海大学. 2016