韩露1 张雪2 张辉2 张永宏（通讯作者）1
（1贵州医科大学附属医院消化内科 贵州 贵阳 550004）
（2中山大学人类病毒学研究所 广东 广州 510080）
【摘要】 目的：研究HCV重组体J6/JFH1在Huh7细胞中复制并产生感染性病毒颗粒。方法：将HCV RNA转染至Huh7细胞中，待转染效率达80%左右，收集上清液，感染新的Huh7细胞，得到的病毒命名为一代病毒，取一代病毒感染效率达80%左右的上清液，感染新的Huh7细胞，得到的病毒命名为二代病毒，测定转染与2次感染收集病毒的滴度。结果：在将HCV病毒转染和感染Huh7细胞后，HCV阳性细胞达80%的时间分别是第13天、第5天及第5天，三次最高滴度分别是3.9FFU/ml,4.5FFU/ml及4.6FFU/ml。结论：成功在Huh7细胞内培育出带有适应性突变的J6/JFH1病毒，为HCV体外培育提供了新思路，为耐IFN的丙肝治疗奠定了基础。
【关键词】HCV；Huh7细胞；IFN
【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）30-0025-04
New recombinant hepatitis c virus replication study in Huh7 cell line
Han Lou, Zhang Yonghong (corresponding author). Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guizhou Province, Guiyang 550004, China; Zhang Xue, zhang Hui. Sun Yat-sen University Institute of Human Virology, Guangdong Province, Guangzhou 510080, China
【Abstract】 Objective Study of HCV recombinant J6 / JFH1 in Huh7 cells copy and produce the infectious virus particles. Methods HCV RNA transfection to Huh7 cells, after waiting for transfection efficiency up to 80% or so, clear fluid collection, new Huh7 cells of infection, the virus named generation, from a generation of virus infection efficiency about 80% supernatant, new Huh7 cells of infection, the virus named the second generation, determination of transfection with two collected virus drops. Results The HCV virus transfection and Huh7 cells after infection, HCV positive cells reached 80% of the time is 13 days, 5 days and 5 days, three times the highest drop degrees are respectively 3.9 head/ml, 4.5 head/head/ml and 4.6 ml. Conclusions Success in Huh7 cells produced with adaptive mutations J6 / JFH1 virus, for HCV in vitro cultivation provides a new train of thought, which laid a foundation for hepatitis c treatment of IFN resistance.
【Key words】 HCV. Huh7 cells; IFN
丙型肝炎病毒（HCV）是一个全长9.6kb的单链正义RNA病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae），丙型肝炎病毒属(Hepacivirus)。肝细胞是HCV最主要的靶细胞，约80%的丙型肝炎感染者会转为慢性感染，部分感染可发展为慢性活动性肝炎，肝硬化和肝癌。全世界约有大于1.7亿人慢性感染HCV[1]。丙肝已经成为公众健康的一大主要问题。
Huh7细胞是来源于肝癌细胞，能稳定产生IFN，不适合用作为HCV体外培养细胞。Blight等人用IFN-β预处理了含有Con1复制子的Huh7的细胞，得到的存活的细胞，命名为Huh7.5细胞。由于Huh 7.5细胞产生IFN-β量较Huh7细胞少，可更高效的支持HCV复制[2, 3]。
HCV于1989年被发现，但直到1999年，才建立了第一个HCV细胞内复制系统，简称复制子（replicon）。2011年，Li等人建立了J6/JFH1重组体，该重组体在Huh7.5细胞中产生的病毒适用于HCV的疫苗等研究[4]，该研究是HCV体外细胞培养的重大突破。
基于以上研究，本实验旨在研究HCV重组体J6/JFH1在Huh7细胞中复制并产生感染性病毒颗粒。
1.材料与方法
1.1 材料
Huh7细胞，（由中山大学人类病毒研究所提供），HCV重组体J6/JFH1质粒，（由李义平教授惠赠），DH5α感受态细胞；细胞培养及DMEM（Invitrogen公司）；XbaI限制性内切酶（NEB公司），Mung bean酶（NEB公司），PCR纯化试剂盒（OMEGA公司），Lipofectamine??2000（invitrogen），抗HCV 1b核心抗体（Santa cruze公司），羊抗鼠IgG抗体（Biotium公司）其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 HCV嵌合体质粒的线性化及其纯化：用Xba I酶把含有HCV重组体的质粒线性化，37℃水浴过夜。酶切产物用Mung Bean酶切除黏性末端，30°水浴30分钟，切除产物用PCR纯化试剂盒纯化，测浓度，取2.5ul反应产物跑电泳。
1.2.2 HCV重组体RNA的体外转录及其纯化：按照promega公司T7转录酶的实验说明，以线性化的含有HCV重组体的质粒为模板进行体外转录RNA。体外转录体系：转录Buffer（5x）20ul，DTT（100mM）10ul，rNTP混合物（2.5mM）20ul，RNA酶抑制剂（40U/ul）2.5ul，T7聚合酶（20U/ul）2ul。在37℃孵育2小时，待孵育结束后取2ul反应产物跑电泳。
1.2.3将HCV重组体RNA转染至Huh7细胞中：用胰酶将Huh7细胞消化后，以3.5×105个细胞/孔将细胞接种至六孔板中，将细胞放至含有5%的孵育箱中37℃培养24小时。将Opti-MEM培养基放至37℃水浴箱中预热10分钟，轻柔混合LipofectamineTM2000（invitrogen）。取5ul Lipofectami- neTM2000与250ul的Opti-MEM培养基混合，在室温放置5～10min。将150ul预热的Opti-MEM培养基与HCV RNA转录产物轻柔混匀，在室温下孵育5-10min。更换Huh7细胞培养基（DEME）为Opti-MEM培养基，并放在培养箱中孵育20min。将稀释的RNA和稀释的LipofectamineTM2000混合在一起，室温放置20min，形成转染复合物。将RNA/LipofectamineTM 2000转染复合物均匀放入Huh7细胞中，放入5%培养箱中，37℃培养16小时。16小时后用胰酶将细胞消化后滴两滴在八孔载玻片中，剩下的细胞接种至6cm平板中，加入4-6mlDMEM培养基。转染后的细胞每两天需要更换培养基。
1.2.4 Huh7细胞转染效率观察：去除含有转染病毒的Huh7细胞的八孔载玻片的培养基，滴加丙酮固定5min，去除丙酮，加入PBS清洗两次，加入含有吐温的PBS清洗一次，取5ul的抗HCV 1b核心抗体加入1000ul的PBS中，充分混匀后，均匀加入八孔载玻片的每个孔中。将八孔载玻片放入湿盒中，4℃过夜。去除八孔载玻片中的抗HCV 1b核心抗体，加入羊抗鼠IgG抗体，室温放置2小时后，即可在荧光显微镜下观察转染效率。观察到病毒转染效率达到80%左右，开始收集病毒上清液，连续收集三次，冻存在-80℃超低温冰箱内长期保存。
1.2.5 用HCV活病毒感染Huh7细胞种植3.5×105个细胞/孔在六孔板中，加入2ml的DMEM培养基，放入5% CO2培育箱中，37℃培养24小时。从-80℃冰箱中取出冻存的病毒，室温融化后，去除六孔板中的DMEM培养基，取HCV活病毒放入六孔板中，1ml/孔。放入5% CO2培育箱内，37℃培育16小时。16小时后传第一次细胞，此后每两天传代一次细胞。
1.2.6 病毒滴度测定
每个孔均匀种6×103个Huh7.5细胞。放入5% CO2培育箱，37℃放置24小时。24小时后，将病毒稀释成5X和50X两个浓度。将稀释后的病毒种在Huh7.5细胞的96孔板中，每孔加入100ul病毒。放入5% CO2培养箱中，37℃培育48小时。去除培养基，加入甲醛固定5min，PBS清洗一次，PBS-吐温清洗一次，每孔加入100ul的1%BSA，室温放置20分钟。每孔加入稀释后的3% H2O2，室温孵育5分钟。去除3% H2O2，用PBS清洗一次，PBS-吐温清洗一次，每孔加入抗HCV 1b核心抗体，放于湿盒中，4℃过夜。抗HCV1b核心抗体，加入PBS清洗一次，PBS-吐温清洗一次。加入辣根过氧化物酶，室温放置30分钟。用PBS清洗一次，PBS-吐温清洗一次，加入DAB稀释溶液，室温放置30分钟。再次用PBS清洗一次，PBS-吐温清洗一次。放入生物安全柜内吹干，即可在显微镜下进行细胞计数。得到的数据使用专门算法，得到病毒滴度，每个病毒计数三个孔，取平均数。
2.结果
2.1 J6/JFH1质粒线性化结果
用Xba I酶将含有HCV J6/JFH1基因组的质粒在HCV 3’UTR酶切位点进行酶切，理论上得到9-10kb之间的条带。（图1）
转染与感染结果。（图3）
图3 HCV重组体J6/JFH1转染Huh7细胞结果。转染第11天（图A）、13天（图B）、15天（图C）及17天（图D）
2.4 Huh7细胞与Huh7.5细胞转染效率（图4）
图5 Huh7细胞转染与感染变化
3.讨论
丙型肝炎病毒（HCV）是一个全长9.6kb的单链正义RNA病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae），丙型肝炎病毒属(Hepacivirus)。HCV基因组包含了一个单一的开放阅读框架（ORF）和两端的5’和3’非翻译区域（UTR）。ORF编码病毒的结构蛋白（Core，E1和E2,），p7和六个非结构蛋白（NS2，NS3，NS4A,NS4B，NS5A和NS5。
肝细胞是HCV最主要的靶细胞，HCV感染能导致急性和慢性肝炎和肝癌。约80%的丙型肝炎感染者会转为慢性感染，部分感染可发展为慢性活动性肝炎，肝硬化和肝癌。全世界约有大于1.7亿人慢性感染HCV[5]。丙肝目前最主要的治疗还是干扰素联合利巴韦林（IFN/RBV），总体来说有效率只有50%[6]。因此，丙肝已经成为公众健康的一大主要问题。
Huh7细胞是来源于肝癌细胞，Huh7细胞能稳定产生IFN-β，并不适合作为HCV体外培养细胞，所以Blight等人在2003年用IFN-β预处理了含有Con1复制子的Huh7的细胞，得到的存活的细胞，命名为Huh7.5细胞[3]。由于Huh 7.5 RIG-I通道失活，不能产生大量的IFN-β，这些细胞可更高效的支持HCV复制[2, 3]。
2011年，Li等人建立了J6/JFH1重组体，该重组体是用HCV基因型2a型的J6的5’UTR-NS2替换了HCV基因型2a型的JFH1的5’UTR-NS2。该重组体能在Huh7.5细胞中产生的病毒适用于HCV的疫苗等研究[4]，该研究是HCV体外细胞培养的重大突破。
自1989年Choo等分离得到第一个HCV cDNA克隆以后，关于HCV的研究一直发展缓慢，直到1999年Lohmann等人第一次提出了复制子系统，HCV才有了第一个体外复制系统，该系统能高效的产生大量HCV蛋白，对于HCV体外培育提供了巨大的贡献及研究工具.对于HCV的疫苗和药物的研究仍有限制性。自Li等人于2010年用HCV基因型2a型的J6的5’UTR-NS2替换了HCV基因2a型的JFH1的5’UTR-NS2后，得到了能在Huh7.5细胞中稳定产生高滴度的重组HCV病毒[4]，该病毒能产生大量的具备HCV特征的蛋白及活病毒颗粒，得到的活病毒可以用于感染新的健康的Huh7.5细胞。这使得HCV的研究进入了新的研究领域。实现了体外培育HCV，并产生高滴度的HCV病毒，得到的病毒可以用于进行药物及疫苗的研究。
Huh7.5细胞来源于Huh7细胞，是Blight等人在2003年用IFN-β预处理了含有Con1复制子的Huh7的细胞，得到的存活的细胞，命名为Huh7.5细胞。研究发现Huh7.5细胞RIG-I通道失活，导致Huh7.5细胞IFN产生较Huh7细胞明显减少，适合作为HCV病毒体外培育的细胞[3]。因Huh7细胞因能产生较多IFN，不是最合适体外培育HCV病毒，因此Li的关于HCV的研究一直基于Huh7.5细胞基础上进行，在Huh7细胞基础上进行的研究较少。
本实验通过在Huh7细胞中培育新型HCV感染克隆，得到了带有新的突变的HCV病毒。并通过感染新的健康的Huh7细胞证明该病毒能产生感染性颗粒。
J6/JFH1重组病毒在转染至Huh7细胞时期，通过荧光显微镜观察到HCV阳性细胞量一直较低，直到第9天HCV阳性细胞才达到10%左右，此后HCV阳性细胞率逐渐上升，在第13天达到了80%左右，可能由于突变的病毒率较低，HCV阳性细胞在第15天迅速降至60%左右。
我们选取了转染时期第13天的病毒上清液感染新的Huh7细胞，得到的病毒称为第一代病毒。第一代病毒在感染Huh7细胞后的阳性率则能在第5日达到40%，这可能是由于第一代感染产生的HCV病毒在短时期内能在Huh7细胞内能达到稳定状态，并能迅速的感染及复制，该现象可能是由于该HCV病毒的基因序列发生了突变造成，该突变可能使该HCV病毒具有一定程度的抗IFN作用。
然后我们又用收集的一代病毒感染新的Huh7细胞，收集的病毒命名为二代病毒。在第三天观察感染效率，HCV阳性细胞达到了60%，第五天达到了80%，该时间小于第一次感染和转染时的时间，可能由于该HCV病毒在Huh7细胞中达到比一代病毒和二代病毒更为稳定的状态，所以在短时期内能迅速感染大量的Huh7细胞。通过病毒达到高峰的时间可以得出该病毒并不同于J6/JFH1。
通过测定转染、一代病毒和二代病毒的滴度，可以发现转染时期HCV阳性细胞转染效率达到80%时期的病毒滴度仍低于相同转染率在Huh7.5细胞内HCV阳性细胞转染率达到80%时期的病毒滴度，这可能是由于转染至Huh7细胞内的病毒仍不稳定，也可能是由于产生突变的病毒量较少所致。第二次感染收集的HCV病毒的滴度已经接近了相同转染率的Huh7.5细胞内产生HCV病毒的滴度。这可能是由于该HCV病毒已经在Huh7细胞内达到了相对稳定的状态并能产生大量感染性病毒颗粒所致。
本实验得到了不同于J6/JFH1病毒的新型丙肝感染性克隆，我们命名为J6/JFH1Huh7。可能是由于病毒带有了新型的适应性突变，该突变可能能使HCV病毒能在Huh7细胞内迅速达到稳定状态并能短期内产生大量的感染性病毒颗粒，由于后续的测序实验还在进行中，目前暂不清楚该适应性突变的位点及突变类型。
长期以来，丙肝病毒对于干扰素及利巴韦林的耐药率逐年增加，该实验成功建立了新型的感染细胞系，为耐IFN的丙肝治疗奠定了基础，为以后丙肝的治疗提供了新的方向。
【参考文献】
[1].Ramirez S, Li YP, Jensen SB, Pedersen J, Gottwein JM, Bukh J. Highly efficient infectious cell culture of three hepatitis C virus genotype 2b strains and sensitivity to lead protease, nonstructural protein 5A, and polymerase inhibitors[J]. Hepatology. 2014,59(2): 395-407.
[2].Sumpter R, Jr., Loo YM, Foy E, Li K, Yoneyama M, Fujita T, et al. Regulating intracellular antiviral defense and permissiveness to hepatitis C virus RNA replication through a cellular RNA helicase, RIG-I[J]. Journal of virology. 2005,79(5):2689-99.
[3].Blight KJ, McKeating JA, Marcotrigiano J, Rice CM. Efficient Replication of Hepatitis C Virus Genotype 1a RNAs in Cell Culture[J]. Journal of virology. 2003,77(5):3181-90.
[4].Li YP, Gottwein JM, Scheel TK, Jensen TB, Bukh J. MicroRNA-122 antagonism against hepatitis C virus genotypes 1-6 and reduced efficacy by host RNA insertion or mutations in the HCV 5' UTR[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011,108(12):4991-6.
[5].Li YP, Ramirez S, Gottwein JM, Scheel TK, Mikkelsen L, Purcell RH, et al. Robust full-length hepatitis C virus genotype 2a and 2b infectious cultures using mutations identified by a systematic approach applicable to patient strains[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2012,109(18):E1101-10.
[6].Frese M, Schwarzle V, Barth K, Krieger N, Lohmann V, Mihm S, et al. Interferon-gamma inhibits replication of subgenomic and genomic hepatitis C virus RNAs[J]. Hepatology. 2002,35(3):694-703.
论文作者:韩露1, 张雪2, 张辉2, 张永宏（通讯作者）1
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第30期供稿
论文发表时间:2016/1/21
标签：细胞论文; 病毒论文; 转染论文; 培养基论文; 体外论文; 丙肝论文; 室温论文; 《医药前沿》2015年第30期供稿论文;