胡慧[1]2004年在《猪瘟病毒E2基因的表达及其间接ELISA诊断方法的研究》文中研究表明本研究试图从分子生物学角度来揭示目前猪瘟仍频繁发生的原因，为广泛开展CSFV分子流行病学的研究提供基础资料，为CSF的防制提供科学依据和理论支持，为猪瘟诊断提供稳定的标准诊断抗原及诊断方法。本论文由4部分构成：1.应用RT-PCR和nPCR扩增了7株国内近期流行的CSF野毒E2基因，分别克隆于pGEM-T Easy载体，对其进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列推导，同时将其与C株，Alfort株，Brescia株进行了同源性比较及遗传进化分析，并构建了CSFV的遗传发生树。结果表明，7株流行野毒与C株，Alfort株，Brescia株核苷酸序列同源性分别为91.6%～94.5%，89.2%～92.7%和85.9%～89.3%，氨基酸同源性分别为91.2%～95.8%，88.9%～92.0%和84.0%～90.1%；而7株野毒之间的差异很小，其核苷酸序列同源性为95.8%～99.7%，氨基酸同源性为96.3%～99.1%。所绘制的遗传发生树分为2个组群，所测得7株流行野毒均属于第1群，而且可分为两亚群，与C株和HCLV株都在同一亚群。表明现行猪瘟病毒流行株的变异呈现一定的多样性，并不尽向远离疫苗株的方向变异，现行的猪瘟疫苗在一定程度上仍然可以起到保护作用。2.应用RT-PCR技术对中国猪瘟兔化弱毒株，经典强毒株石门毒株(Shimen)，近期地方流行的属于第一群毒株的新疆毒株(XJ)和第二群代表毒株甘肃临洮(LT)株E2基因的主要抗原区(包括A，B，C，D在内)进行扩增，均得到约561bp的基因片段。将这4个基因分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中，且阅读框正确，从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，用SDS-PAGE电泳，Western-blotting和薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明，E2基因的主要抗原区可以在大肠杆菌中表达，表达的蛋白多以包涵体形式存在，表达产物的分子量约为50kDa(目的基因的蛋白分子质量为21.7kDa，载体GST分子质量为29kDa)，与理论推测的蛋白分子量一致；薄层凝胶扫描分析表明，表达蛋白约占菌体蛋白总量的20%～30%；经Western-blotting证明，表达的E2蛋白可被猪瘟阳性血清所识别，表达蛋白可用于基因工程诊断抗原。3.C株和LT株E2基因主要抗原区在pGEX-4T-1表达载体中表达产量较高，但是都以包涵体形式存在，必须经过复性才具有生物学活性。收集诱导表达的菌液，超声波破碎分离包涵体，尿素和Triton X-100分别洗涤包涵体，用尿素溶解包涵体，复性液稀释变性蛋白，缓冲液透析获取纯化蛋白。SDS-PAGE分析电泳结果表明，尿素和Triton X-100可洗去部分杂蛋白，8mol/L尿素能很好的溶解包涵体，回收率较低约10%，其纯度可达70%。ELISA试验测定的结果显示，与复性前变性蛋白相比，纯化蛋白与CSFV阳性血
李鹏[2]2008年在《猪瘟病毒E0基因原核表达及间接ELISA检测方法的建立》文中研究说明猪瘟(Classical swine fever,CSF)被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的疫病之一,在我国时有发生。猪瘟的发生对我国造成巨大的经济损失和深远的社会影响,对其预防和控制显得尤为重要。通过注射弱毒疫苗来预防猪瘟的发生,仍是一些国家猪瘟防治的主要手段。本试验对猪瘟病毒流行毒株FJ237 E0基因进行原核表达,初步建立了间接ELISA检测猪瘟血清E0抗体的方法,为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定基础。根据流行毒株FJ237基因序列设计一对扩增猪瘟病毒E0基因的特异性引物,在引物的上下游分别加入XhoⅠ、EcoRⅠ酶切位点。通过RT-PCR获得长约687bp的目的片段。用相同的限制性内切酶直接酶切PCR产物和表达载体pET32a后构建重组质粒,转化宿主菌BL21(DE3),经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆,测序证明目的基因以正确的阅读框插入了表达载体,用不同浓度的IPTG诱导表达E0蛋白,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,原核表达产物大小约为50 ku。经过对表达条件的优化,最后确定以37℃培养至OD600达0.6左右,加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L,再以30℃继续培养3h,这样的培养条件下表达量最大,经分析表达蛋白量约占菌体蛋白的25%。表达产物经Western blot分析,能被猪瘟阳性血清所识别。试验结果表明猪瘟E0基因在大肠杆菌中高效表达,且表达产物具有抗原性。目的蛋白经大量诱导表达,可溶性试验证明重组蛋白以可溶性形式存在于诱导菌液上清中,本实验用镍柱亲和层析法从上清中纯化了目的蛋白。纯化后的目的蛋白作为抗原包被聚乙烯微量反应板,初步建立检测CSFV抗体的间接ELISA诊断方法。结果表明,抗原的最适包被浓度为58μg /mL,血清最适稀释度为1:60;最适封闭液为10g/L BSA,封闭时间为37℃2h,最佳血清及二抗反应时间确定为37℃1h;底物显色液的最佳反应时间为15min。该方法的建立为猪瘟抗体监测提供了一种比较实用的血清学检测方法,同时也为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定基础。
李素[3]2007年在《猪瘟病毒E2蛋白及其重复抗原表位的原核表达和特异抗血清制备》文中认为CSFV是黄病毒科瘟病毒属成员,基因组编码4个结构蛋白(C、E0、E1、E2)以及至少7个非结构蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。其中E2蛋白为重要的免疫保护性蛋白,能刺激机体产生中和抗体。许多诊断方法以及标记疫苗的研究大都是围绕E2开展的。E2蛋白的828-842抗原表位(氨基酸序列为QTAVSPTTLRTEVVK)是中和抗原表位,该表位在CSFV高度保守,而同属的BVDV和BDV却不存在这一表位。本实验克隆了CSFV石门株E2基因和E2的抗原表位的4个重复(4P),分别插入pGEX-6P-1、pMAL-P2X表达载体中,构建了4个原核重组表达质粒,诱导后4个重组表达质粒均得到表达。将表达蛋白的上清MBP-4P、GST-4P、MBP-E2,以及复性和变性后的包涵体GST-E2应用亲和层析的方法进行了纯化,纯化后的蛋白经ELISA和Western-blotting检测具有反应性,能与猪瘟病毒阳性血清发生反应。MBP-4P、GST-4P不与兔抗BVDV E2血清发生反应,因此,可以作为一个潜在的鉴别CSFV的抗原。应用表达的融合蛋白MBP-E2、MBP-4P以及实验室制备的昆虫细胞sf9杆状病毒表达系统表达的真核E2蛋白联合免疫家兔,制备了较高滴度的多克隆血清。ELISA、Western-blotting,IFA试验证明所制备的多克隆血清具有良好的反应性和特异性。本研究为建立猪瘟病毒组合抗原的抗体检测方法和猪瘟鉴别诊断以及大量表达CSFV E2蛋白研究其结构和功能打下基础。
袁莉[4]2018年在《猪瘟病毒疫苗株结构蛋白抗体消长规律研究》文中认为猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病。猪瘟分布广泛,死亡率高,是一种严重危害养猪业发展的重要传染性疫病。目前,我国猪瘟防控工作主要还是采取猪瘟兔化弱毒疫苗预防接种的方式进行,定期对免疫后畜群进行血清抗体检测可以评估疫苗免疫效果,改进和优化疫苗免疫程序,有效地预防和控制猪瘟。本研究在E.coli中表达了CSFV的结构蛋白E0和C,以纯化和鉴定后具有免疫反应性的蛋白作为包被用抗原,分别建立了CSFV血清抗体间接ELISA检测方法,为CSFV抗体监测提供了新的选择。研发的CSFV阻断ELISA抗体检测试剂盒经试验证明,其敏感性、特异性和稳定性良好,可以应用于临床疫苗免疫后抗体水平监测和流行病学调查的工作中。用猪瘟疫苗免疫猪,在免疫后0,7,14,21,28,35,50天收集血清样品,应用重组E2蛋白作为抗原建立的阻断ELISA方法检测E2蛋白抗体消长;分别使用重组E0和C蛋白作为抗原建立的间接ELISA方法,检测免疫过程中抗两种抗原的血清抗体变化特征。抗体检测结果显示:疫苗免疫后第7天即可在血清中检测到抗结构蛋白E2、E0和C的相应抗体,其中针对E2和E0抗原的抗体在免疫后第21天时达到最高水平,E2抗体水平总体呈现先上升后下降的变化趋势;抗E0抗原的抗体在免疫后21天之后有所下降并最终趋于稳定状态;C蛋白抗体在第7天时出现,随后开始下降,在第28天转为阴性。应用建立的ELISA血清抗体检测方法分析疫苗免疫后针对3种结构蛋白的抗体变化特点,可为兽医临床CSF疫苗免疫程序的制定提供有意义的数据参考。
李坤[5]2009年在《猪圆环病毒Ⅱ型和猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用》文中指出猪圆环病毒(Porcine Circovius,PCV)为圆环病毒科圆环病毒属成员,基因分型表明PCV分为两个基因型,PK15细胞源性无致病性的PCV规定为PCV1,感染断奶仔猪多系统消耗综合症(Postweaning Multisystemic WastingSyndrome,PMWS)的猪中分离的具有致病性的规定为PCV2,PCV2被认为是导致PMWS的病原,感染PMWS的猪会出现生长障碍、呼吸困难、皮肤苍白或黄疸、泻痢等症状。该病1991年在加拿大首次被报道,现在已经遍布世界各地的产猪地区。猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)引起的猪的高度接触性传染病,以出血和发热为主要特征,呈急性、亚急性或慢性经过。猪瘟病毒为黄病毒科(Flaviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员。临床表现的多变和强毒株的出现均会导致高发病率和死亡率。亚急性和慢性猪瘟由于症状不明显不能被迅速检测而造成病毒的散播。猪瘟间歇性的暴发给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2的核衣壳蛋白(Capsid,Cap)和CSFV的囊膜蛋白E2在感染动物体内可以诱导产生保护性免疫,同时病毒感染机体后主要产生针对这两种结构蛋白的抗体。因此,这两种蛋白被认为是间接ELISA包被抗原的首选。本论文的试验由两个部分组成:一、Cap蛋白和E2蛋白分别利用pET表达系统在大肠杆菌中的表达。二、用这两种蛋白为抗原分别建立检测PCV2-Cap抗体和CSFV-E2抗体的间接ELISA方法,并对临床血清样品进行检测。主要结果如下:1.用PCR方法从PCV2 HBZX株中获得截短的Cap基因,将该基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,将鉴定正确的重组质粒命名为pET-Cap,然后转化宿主菌E.coli BL21-codonplus(DE3),SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达,表达蛋白Cap分子量为42kDa。用RT-PCR方法从CSFV Shimen株中获得E2囊膜糖蛋白A-D抗原区基因,将该基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-E2,将鉴定正确的阳性重组质粒转化宿主菌E.coli BL21-codonplus(DE3),SDS-PAGE和Western-blot鉴定表达蛋白E2分子量约为38.6kDa。2.用表达的Cap蛋白作为包被抗原建立PCV2抗体间接ELISA方法。通过反应条件的优化得出抗原包被浓度为3μg/mL;一抗稀释度为1:400,作用时间为45min;二抗作用时间为60min;阴阳性血清的临界值分别为0.158和0.188。用该方法分别检测湖北、河南等地的91份临床血清样品,阳性率为25%～100%。说明两地已有PCV2感染。用表达的E2蛋白作为包被抗原建立CSFV抗体间接ELISA方法。通过反应条件的优化得出抗原包被浓度为3μg/mL;一抗稀释度为1:100,作用时间为45min;二抗作用时间为60min;阴阳性血清的临界值分别为0.839和1.004。用该方法检测湖北武汉331份猪血清,检测结果与进口试剂盒比较,阳性率分别为41.1%和67.1%。共阳性为111份,共阴性为41份。符合率为45.9%。符合率较低的原因可能与两种方法包被抗原的不同有关。结果表明,所建立的间接ELISA方法能够分别检测出猪血清中的Cap抗体和E2抗体,可以成为有效的血清诊断工具。
郭鹤[6]2013年在《猪瘟病毒囊膜E2蛋白原核表达及初步应用研究》文中认为猪瘟（Classical swine fever，CSF）是一种由猪瘟病毒（Classical swine fevervirus，CSFV）引起的猪病毒性传染病，各年龄段的家猪和野猪均可感染发病。猪瘟病毒是黄病毒科瘟病毒属的重要成员之一，基因组为单股正链RNA，长约为12.3kb，编码一个多聚蛋白，经后期的剪切加工形成4个成熟的结构蛋白和8个成熟的非结构蛋白。猪瘟病毒囊膜E2蛋白是诱导机体产生特异性抗体的主要蛋白，也是研究猪瘟亚单位疫苗、标记疫苗和检测方法的主要的目标蛋白。E2蛋白一直是研究的热点。E2蛋白主要由N端的信号肽、C端的跨膜区以及中间的氨基酸区域组成，通过与E1蛋白形成异源二聚体或本身形成同源二聚体在病毒囊膜上发挥其生物学作用。E2蛋白上主要有4个抗原结构域A、B、C、D，研究也证明在蛋白C端接近跨膜区处也分布有抗原结构域，这些区域是E2蛋白诱导产生抗体的主要区域。本研究通过PCR扩增了猪瘟病毒石门株囊膜E2蛋白A、B、C、D四个主要抗原区534bp的基因序列，将其克隆入pGEX-4T-1载体中，构建了表达该区域的原核表达载体pGEX-4T-1-△E2，同时为了便于下游蛋白质纯化在蛋白质C端添加了组氨酸标签。将pGEX-4T-1-△E2载体转入大肠杆菌Transetta(DE3)中进行表达，经过SDS-PAGE电泳和Western-blot检测结果表明猪瘟病毒△E2蛋白以包涵体形式表达在大肠杆菌中，而且在30℃，诱导物IPTG浓度为0.1mM，诱导8h时，△E2蛋白表达效果最好。通过Ni-NTA His亲和层析柱纯化经变性处理的△E2蛋白，结果发现当咪唑浓度为250mM时蛋白纯化效果最好。利用分步透析的方法复性变性的△E2蛋白，BCA法测定蛋白浓度为0.3042mg/ml。以纯化后的△E2蛋白为包被抗原，通过条件优化，建立了猪瘟抗体间接ELISA检测方法。实验确定抗原包被量为每孔包被0.3125μg，4℃包被24h，1%BSA溶液37℃封闭2h，待检血清1:80倍稀释后37℃孵育30min，加入1:10000倍稀释的HRP标记的羊抗猪二抗37℃反应1h，TMB显色液室温避光显色10min，加入0.5mM硫酸溶液终止反应后测定450nm的OD值为猪瘟抗体间接ELISA检测方法的最佳反应条件。通过上述反应条件对29份猪瘟抗体阴性血清样品进行检测，确定当待检血清OD450值≥0.390时判断为阳性，待检血清OD450值≤0.350时判断为阴性，待检血清OD450值界于0.390~0.350之间则认为疑似，可以重新检测或重新取样再检。对建立起来的猪瘟抗体间接ELISA检测方法进行重复性实验，批内重复试验和批间重复试验的试验结果显示此方法具有很好的重复性。利用此方法对猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪乙型脑炎病毒(JEV)叁种猪常见疾病的抗体阳性血清进行检测，其OD450值均小于0.350为阴性，证明该方法应用于猪瘟抗体诊断时具有很好的特异性。利用此方法和IDEXX猪瘟抗体检测试剂盒分别对114份临床血清样本进行检测，符合率高于80%，证明此方法具有很好的临床应用前景，为猪瘟抗体的实时检测和猪瘟的防控奠定了基础。
张平[7]2010年在《猪瘟病毒（CSFV）E~（rns）基因在毕赤酵母中的高效表达及其间接ELISA的初步建立》文中进行了进一步梳理猪瘟(Swine Fever, SF)是猪瘟病毒(Classical Swime Fever Virus,CSFV)引起的一种猪的高度接触性烈性传染病,死亡率极高,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。大范围接种猪瘟弱毒疫苗能够控制猪瘟的大面积流行,但会加大区分野毒感染和接种疫苗猪的难度。表达猪瘟病毒保护性抗原E~(rns)蛋白用以建立猪瘟抗体诊断方法,在标记疫苗(Marker vaccine)的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能,对于检测猪瘟病毒的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用。E~(rns)蛋白能够区分标记疫苗和野毒感染产生的抗体,使用标记疫苗并提供配套的诊断方法即可更好地解决这一问题,本实验目的是采用巴斯德毕赤酵母表达系统表达具有生物学活性的E~(rns)蛋白,为建立大规模化筛查猪瘟特异性抗体的血清学ELISA诊断方法提供试验材料,也为E2蛋白标记疫苗的推广应用打下基础。本研究提取猪瘟弱毒疫苗总RNA,根据Genbank报道的编号为Z46258的序列设计引物,应用RT-PCR技术扩增得到猪瘟病毒囊膜蛋白基因E~(rns),与pGM-T载体连接后测序,pGM-T-E~(rns)序列测定结果在生物分析软件DNAstar上用MegAlign分析比较,结果表明,E~(rns)基因编码序列与文献报道的序列同源性为99.0%,该基因全长768bp,编码227个氨基酸,其中有8个核苷酸与报道序列存在差异,2个氨基酸序列有差异,将E~(rns)基因与真核表达载体pPIC9K连接,构建了pPIC9K-E~(rns)分泌型酵母表达质粒,电转化毕赤酵母菌GS115,利用G418抗性筛选多拷贝重组菌株,并利用菌落PCR和MM板确定酵母甲醇利用型。水平摇瓶进行诱导表达,利用SDS-PAGE进行检测,在48kDa左右处有免疫印迹条带,再进行Western-Blotting,在48kDa左右处有特异性条带。结果证明E~(rns)蛋白得到表达,而且能被特异性抗体所识别,具有生物学活性。使用阴离子交换层析柱对重组酵母分泌上清进行纯化,以纯化的E~(rns)蛋白为诊断抗原,通过摸索抗原包被浓度,抗体血清稀释倍数初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清E~(rns)抗体的方法,为进一步开发猪瘟抗体诊断试剂盒奠定了新的基础。
何艳[8]2008年在《猪瘟病毒E2蛋白在昆虫细胞中的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立》文中研究表明猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性热性传染病,猪是其唯一的自然宿主。病毒可通过胎盘传染,造成胎儿死亡和先天性感染猪迟发病和死亡。发病率、致死率高,在猪业造成严重损失。因此,猪瘟病毒的检测技术历来为国际畜牧兽医界所重视。CSFV的诊断方法很多,其中,血清学抗体检测应用较多。ELISA方法特异性好,灵敏度高,使用广泛。在CSFV的结构蛋白中,E2囊膜糖蛋白是CSFV主要保护性抗原蛋白,能诱导机体产生中和抗体。所以,它既是人们研究CSFV新型疫苗的主要对象,也是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原。本研究目的是将E2蛋白N端包含主要抗原区的一段序列(E2-1)(含N端高保守序列)克隆入杆状病毒表达载体系统中,转染昆虫细胞,获得体外表达的E2-1蛋白,并将该蛋白作为包被抗原建立间接ELISA抗体检测方法。主要内容包括:1.杆状病毒表达CSFV E2-1:用RT-PCR技术从国内分离的CSFV疫苗株中获得大小为537bp的PCR产物,将其克隆至pFastBac~(TM)HT A转移载体,转化DH5α,然后在LB平板上挑取阳性菌落,得到的重组转移质粒pFastBac~(TM)HT A-E2-1,再提取阳性克隆质粒转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的受体菌E.coliDH10Bac中,发生转座作用,在舍庆大霉素,卡那霉素,四环素3种抗生素和X-gal/IPTG的LB培养板上,筛选出白色菌落得到重组穿梭载体Bacmid-E2经PCR鉴定为阳性后,采用阳离子脂质体法转染到Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒,经IFA、SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,结果表明,E2-1蛋白在Sf9昆虫细胞中成功表达。2.间接ELISA抗体检测方法的建立:在上述工作的基础上,以重组杆状病毒E2-1蛋白为包被抗原,经条件优化,建立了监测CSFV血清抗体水平的间接ELISA方法,并用以重组杆状病毒E2-1蛋白建立的ELISA法和猪瘟IDEXX抗体检测ELISA试剂盒同时检测92份猪血清,检测结果显示符合率达到83.7%,并用该方法检测了135份临床血清样品。本试验成功表达了重组杆状病毒E2-1蛋白(约22kDa);建立的间接ELISA诊断方法具有良好的特异性和敏感性,为免疫猪群抗体监测和CSF流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学检测方法。
王钰璇[9]2007年在《猪瘟病毒E0结构蛋白核心抗原位点的表达及抗原性研究》文中进行了进一步梳理猪瘟病毒是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)中的一个重要成员,这个属的成员还有在抗原性和结构上与CSFV密切相关的牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhed virus,BVDV)和羊边界病病毒(Border disease virus,BDV),并且以牛病毒性腹泻病毒为原型病毒。CSFV基因组编码4个结构蛋白(C、E0、E1、E2)以及至少7个非结构蛋白( Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。E0蛋白是CSFV的重要结构蛋白,具有RNase活性,可引起动物的淋巴和上皮细胞凋亡,导致免疫抑制。E0蛋白含有227个氨基酸,其中191~227氨基酸具有猪瘟病毒特异性,能将CSFV与BVDV和BDV区分,是诊断猪瘟抗体的理想抗原。建立用E0蛋白191~227氨基酸为抗原的猪瘟抗体检测技术,将更有利于猪瘟的检测。本研究采用PCR技术,扩增CSFV E0蛋白191~227氨基酸残基的基因片段,将其克隆到表达载体pET-30C质粒中,获得重组质粒30C-E0-1725。将含有目的基因的重组质粒转化表达菌BL21,挑选阳性菌,扩大培养,用IPTG诱导使之进行表达,对诱导表达条件进行优化,确立最佳诱导表达条件。将收获的表达菌进行SDS-PAGE电泳分析,证明表达出的目的蛋白分子质量为12KD,与预期的大小一致。经western-blot鉴定和镍柱亲合层析纯化后的活性验证,表明表达的蛋白具有良好的抗原特异性。同时应用重组蛋白作为抗原,用方阵实验确定了纯化蛋白抗原的包被量和血清的最佳稀释倍数,并对ELSIA方法中的各项条件进行了优化,初步建立检测CSFV血清抗体的间接ELISA方法,为进一步开发重组E0蛋白的ELISA诊断试剂盒奠定了基础。
谢晓方[10]2016年在《CSFV抗体间接ELISA方法的建立及初步应用》文中研究指明本研究通过将E2蛋白作为抗原进行包被,摸索ELISA方法建立所需的各项条件。结果表明：最佳包被浓度为40ng/孔;以1/100稀释被检血清孵育30mmin;选择1/600稀释的酶标二抗作用30min；底物作用15min后OD450读数。以此条件建立的CSFV抗体间接ELISA检测方法的敏感性为80.5%,特异性为82.5%,与IDEXX试剂盒符合率为80.6%。8头试验猪的猪瘟免疫跟踪血清中的猪瘟病毒抗体的检测结果表明：仔猪在按照1头份/头进行疫苗免疫后,整体的猪瘟病毒抗体水平在疫苗免疫后60天达到峰值,且抗体水平可以维持在较高水平105天或以上。Ⅰ和Ⅱ猪场猪瘟免疫跟踪血清中猪瘟抗体的检测结果表明,建立的CSFV抗体间接ELISA检测方法与IDEXX公司猪瘟病毒抗体检测试剂盒的一致性较好。Ⅱ猪场80头母猪整体的抗体水平高且整齐度好,至免疫后第50天,猪群整体的抗体水平仍有所提升。且在高抗体水平血清样本的区分上,建立的CSFV抗体间接ELISA检测方法较IDEXX公司猪瘟试剂盒明显。Ⅱ猪场猪群免疫当天,有14头猪的抗体是水平呈阴性,说明疫苗免疫第一次免疫的时间不合理,且在一免后33天仍未全部转阳,这将导致猪群整体的空窗期要长。建立的CSFV抗体间接ELISA方法和IDEXX公司猪瘟病毒抗体检测试剂盒相比,能够更早的检测到抗体,有利于猪群免疫猪瘟疫苗后的抗体水平检测。
参考文献：
[1]. 猪瘟病毒E2基因的表达及其间接ELISA诊断方法的研究[D]. 胡慧. 西北农林科技大学. 2004
[2]. 猪瘟病毒E0基因原核表达及间接ELISA检测方法的建立[D]. 李鹏. 西北农林科技大学. 2008
[3]. 猪瘟病毒E2蛋白及其重复抗原表位的原核表达和特异抗血清制备[D]. 李素. 吉林大学. 2007
[4]. 猪瘟病毒疫苗株结构蛋白抗体消长规律研究[D]. 袁莉. 中国农业科学院. 2018
[5]. 猪圆环病毒Ⅱ型和猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用[D]. 李坤. 华中农业大学. 2009
[6]. 猪瘟病毒囊膜E2蛋白原核表达及初步应用研究[D]. 郭鹤. 吉林大学. 2013
[7]. 猪瘟病毒（CSFV）E~（rns）基因在毕赤酵母中的高效表达及其间接ELISA的初步建立[D]. 张平. 河北农业大学. 2010
[8]. 猪瘟病毒E2蛋白在昆虫细胞中的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立[D]. 何艳. 南京农业大学. 2008
[9]. 猪瘟病毒E0结构蛋白核心抗原位点的表达及抗原性研究[D]. 王钰璇. 甘肃农业大学. 2007
[10]. CSFV抗体间接ELISA方法的建立及初步应用[D]. 谢晓方. 湖南农业大学. 2016
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