刘丹 栗程
西安市第五医院 西安 710082
目的 本研究拟在 C3aR敲除及CR3敲除小鼠（C3aR-/-或CD11b-/-）上建立CIA模型，分别探讨补体C3a-C3aR信号和iC3b-CR3信号对类风湿关节炎疾病的影响作用。方法 使用C57/B6背景转基因小鼠，根据实验小鼠品系不同分为3组：C3aR-/-组5只、CD11b-/-组5只及WT对照组5只，通过胶原诱导建立CIA模型后，对各组进行关节的临床评分；收集关节标本进行病理评分；通过流式细胞仪检测小鼠脾脏CD4+/CD8+/Th17/Treg亚群比例、NK细胞分泌IFN-r水平。结果 关节炎临床评分：与WT比较，C3aR-/-组CIA临床评分略减低，而CD11b-/-组临床评分明显高于WT及C3aR-/-组。2）病理评分（满分12分）：CD11b-/-组、C3aR-/-组及WT组CIA评分分别为9.35±0.75、4.81±0.63和5.85±0.55，CD11b-/-组明显高于WT及C3aR-/-组，与临床评分一致。3）通过流式细胞仪染色检测发现，与WT组比较，CD11b-/-组脾脏CD4+、CD8+T细胞百分比明显上调，而Treg细胞亚群降低，此外，脾脏NK细胞分泌IFN-r明显减少。结论 补体C3裂解产物C3a和iC3b，与其补体受体结合在RA的免疫机制中表现的炎症反应和预后结果不同，iC3b-CR3信号在RA中具有保护作用，而C3a-C3aR信号具有炎症加重作用，其机制尚有待于进一步认识。
类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，主要表现为小关节为主的滑膜炎，疾病不断进展出现关节肿胀，骨和软骨破坏，畸形和活动受限。此前研究发现在C3-/-小鼠应用II型胶原诱导的类风湿关节炎模型（CIA模型），其血清抗胶原蛋白抗体水平减低，关节炎症反应较轻，但其分子机制不清。补体C3活化产生的小片段C3a以及大片段iC3b是其主要效应产物，分别与其特异性受体C3aR和CD11b结合而发挥生物学效应。本文探讨类风湿关节炎中补体C3的裂解产物C3a和C3b，与其相应的受体结合，其补体活化信号途径与对关节炎病情影响的机制研究。
补体具有机体免疫防御消除外来抗原和维护机体内环境的平衡的重要作用。补体系统活化受到精细的调控，其活化产物过敏毒素等，可诱导炎症反应，造成组织细胞的损伤，参与自身免疫疾病发生，以及影响凝血及纤溶系统，如RA中，补体激活参与了疾病发展的过程，下文将详细描述。现报道如下：
实验和方法
1. 应用C3aR-/-及CD11b-/-小鼠，建立CIA模型，根据实验小鼠品系不同分为3组：C3aR-/-组6只、CD11b-/-组12只及WT对照17只，通过II型鸡胶原诱导建立CIA模型，初次免疫应用II型胶原+弗氏完全佐剂1：1配比，制成乳剂，每只小鼠注射100ul，由尾部进针，注入到臀部皮下，免疫第21天，再次进行相同免疫。对各组进行关节的临床评分；
2. 收集第44天，收集CIA模型关节标本进行病理评分；双盲法进行动物关节的病理评分。
3. 细胞检测方法：简而言之，小鼠心脏血离心去除血清，通过裂红细胞，洗涤，PMA刺激、离子霉素、高尔基阻断剂，各组分别收集细胞，每个管中收集100μL，分别加入相应单抗染色，通过流式细胞仪检测各组小鼠脾脏CD4+T、CD8+T、及Th17/Treg淋巴细胞亚群比例水平。
4. 统计学方法 采用SPSS17.0统计分析，所有比较资料均为计量资料，采用两组间t检验，显著性采用P＜0.05。
结 果
1.关节炎临床评分：与WT对照组比较，C3aR-/-组CIA临床评分略减低，而CD11b-/-组临床评分明显高于WT及C3aR-/-组。
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2.病理评分（满分12分）：CD11b-/-组、C3aR-/-组及WT组CIA评分分别为9.35±0.75、4.81±0.63和5.85±0.55，CD11b-/-组明显高于WT及C3aR-/-组，与临床评分一致。
3.通过流式细胞仪染色检测发现，与WT组比较，CD11b-/-组脾脏CD4+T细胞、CD8+T、Th17细胞百分比明显上调，而Treg细胞亚群降低，此外，脾脏NK细胞分泌IFN-r明显减少。
结论
类风湿关节炎（RA）是一种慢性累及多关节肿痛、活动受限、畸形的自身免疫性疾病。RA至今病因不明，目前认为是免疫介导的炎性疾病。补体系统激活通路作为机体的天然免疫、其免疫信号调节作用对RA的发病机制、对疾病病情的影响等逐渐成为风湿免疫领域的研究热点。补体所发挥的免疫调节作用逐渐被重视，其靶向免疫调节作用在RA的疾病发病机制中起到了重要作用也逐步被揭示。随着对补体蛋白及补体激活通路作用机制的逐步认识，抑制补体活性的大分子的化合物作为药物已进入临床试验，观察和治疗多种急性和慢性的炎症性疾病。
补体途径中最重要的过敏毒素C3a和C5a，通过与相应受体结合而发挥其生物作用或参与病理损伤，加重关节炎症。研究表明，在C5aR-/-，C6-/-以及CR1-/-、CR2-/-、FB-/-的CIA模型中，均发现关节炎症减轻表现[1-2]。以上研究说明补体系统某个单一因素参与和调控了补体激活通路，进而改善关节炎症的反应，提示RA中补体激活对疾病起到重要作用，是发病机制之一。关节炎临床评分：与WT比较，C3aR-/-组CIA临床评分略减低，而CD11b-/-组临床评分明显高于WT及C3aR-/-组。病理评分比较，CD11b-/-组、C3aR-/-组及WT组CIA评分，CD11b-/-组明显高于WT及C3aR-/-组。以上结果说明，补体CD11b对于RA的具有保护性作用。
补体系统的免疫调控发挥机制可能作用于RA关节炎症的全过程，通过调控引起辅助性T细胞（Th）中Th1/Th2失衡，造成细胞因子产生和释放，关节炎症明显加重，同时发生细胞凋亡、软骨暴露和细胞损伤，激活的补体最终形成MAC加重细胞和关节组织损伤。动物模型对于补体系统调控作用的研究起到重要作用，在不同补体缺失品系的CIA模型以及调控补体活化进程干预因素等的逐步深入研究，为补体干预生物制剂治疗RA开辟了新的研究领域。通过流式细胞仪染色检测发现，与WT组比较，CD11b-/-组脾脏CD4+、CD8+T细胞百分比明显上调，而Treg细胞亚群降低，此外，脾脏NK细胞分泌IFN-r明显减少。故C3aR-/-的CIA关节炎表现与WT组变化不大，而CD11b-/-小鼠在CIA模型关节炎程度明显加重，故提示CD11b所介导的受体信号在RA中具有保护作用。因此，可以得出CD11b受体保护的作用机制，可能在于减少T淋巴细胞的增殖和分化，同时，减少炎性细胞因子分IFN-γ等的作用。当CD11b受体敲除，淋巴细胞亲润明显加重，其机制可能为造成T细胞亚群失衡相关。
小结：补体C3裂解产物C3a和iC3b，与其补体受体结合在RA的免疫机制中表现的炎症反应和预后结果不同，iC3b-CD11b信号在RA中具有保护作用，而C3a-C3aR信号具有炎症加重作用，通过此项研究，有助于开发补体调控剂，靶向调控RA疾病发病发生，利于临床治疗。
参考文献：
[1]Banda NK，Hyatt S，Antonioli AH，et al.Role of C3a Receptors，C5a Receptors，and Complement Protein C6 Deficiency in Collagen Antibody-Induced Arthritis in Mice. J Immunol 2012；188；1469-1478
[2]Banda NK，Mehta G，Ferreira VP.Essential role of surface-bound complement factor h in controlling immune complex-induced arthritis. J Immunol. 2013 Apr 1；190（7）：3560-9.
注：项目基金：陕西省自然科学基金（2015JM8384，2016JM8147），陕西省社会发展公关项目（2017SF-245）
论文作者:刘丹,栗程
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年第9期
论文发表时间:2018/6/12
标签：补体论文; 细胞论文; 评分论文; 小鼠论文; 关节论文; 关节炎论文; 炎症论文; 《中国误诊学杂志》2018年第9期论文;