周建维, 程琪, 谢幸, 陈怀增, 叶大风[1]2004年在《上皮性卵巢癌患者腹水白介素-10水平与其腹腔免疫功能缺陷关系的探讨》文中指出背景与目的:白介素-10(Interleukin-10,IL-10)属于Th2型细胞因子,在免疫反应的多个环节起重要作用,作为一种免疫抑制性细胞因子,IL-10参与了多种肿瘤的发生和发展。本研究探讨上皮性卵巢癌患者腹水中细胞因子IL-10水平与其腹腔免疫功能缺陷的关系。方法:用ELISA法检测32例上皮性卵巢癌患者术前血清及腹水、4个卵巢癌细胞株培养上清液及10个上皮性卵巢良性肿瘤患者血清与10个正常女性(对照组)血清中IL-10的含量。结果:(1)卵巢癌患者腹水中IL-10的水平显着高于其血清IL-10的水平犤(159.78±51.20)ng/Lvs(12.01±4.38)ng/L,P=0.000犦;卵巢癌组血清IL-10水平犤(12.01±4.38)ng/L犦也显着高于良性肿瘤组犤(3.79±2.40)ng/L,P=0.000犦及正常对照组血清IL-10的水平犤(4.45±2.69)ng/L,P=0.003犦;而良性肿瘤组与正常对照组血清IL-10水平无显着性差异(P=0.529)。(2)卵巢癌患者腹水中IL-10的水平与临床分期有关,但与细胞学分级无关。(3)卵巢癌细胞株3ao、SKOV3、CAOV3及OVCAR细胞培养上清液中均检测到IL-10的存在。结论:卵巢癌患者腹水中高水平的IL-10可能与其腹腔免疫功能缺陷有关,卵巢癌细胞可能通过其自身IL-10的分泌以利于其腹腔内的扩散转移。
周建维[2]2004年在《上皮性卵巢癌IL-10表达与其腹腔免疫功能缺陷的研究》文中研究指明背景 卵巢癌是迄今预后最差的妇科恶性肿瘤，上皮性卵巢癌即使是晚期患者也常常局限于腹膜腔，较少发生远处转移，这表明上皮性卵巢癌患者存在腹腔局部抗肿瘤免疫机制的缺陷，从而有助于肿瘤在腹腔内生长播散。但目前对于上皮性卵巢癌腹腔免疫机制缺陷的原因尚不清楚，一个可能的机制是肿瘤局部细胞因子的异常表达。近年研究发现，包括卵巢癌在内，细胞因子可能在肿瘤的发生、发展过程中起着重要的作用。 IL-10是一个强有力抗炎性细胞因子，属于TH2型细胞因子，主要参与细胞介导的免疫反应(TH-1型)。IL-10能干扰杀肿瘤机制，它能抑制巨噬细胞分泌TNF-α和活性氧的中间物，降调肿瘤细胞表面MCH-1的表达，干扰抗原递呈细胞的辅助功能。另一方面，IL-10抑制TH1型细胞IL-2和INF-γ的产生。它也能抑制人类外周血T细胞的增殖及人外周单个核细胞INF-γ和其它一些细胞因子的合成。另外还能阻断巨噬细胞及郎罕氏细胞的抗原提呈及肿瘤细胞的肿瘤相关抗原的提呈，有助于肿瘤细胞免疫逃避。在恶性肿瘤的患者腹水、血清及组织中已检测到大量IL-10特异的mRNA和IL-10蛋白，但迄今为止，对于卵巢癌患者中主要由哪群细浙江大学2004届硕士学位论文胞负责产生IL一10的研究仍限于体外卵巢癌细胞系。而且到目前为止，对于卵巢癌细胞能否产生IL一10以及IL一10与上皮性卵巢癌腹腔免疫缺陷的关系尚不清楚，有对于进一步深入研究。 本研究采用ELLSA法检测了上皮性卵巢癌患者术前血清及腹水、4个卵巢癌细胞株培养上清液中IL一10的含量，并以10例上皮性卵巢良性肿瘤患者血清与10位健康血清女性为对照组。同时对64例上皮性卵巢癌、35例卵巢上皮性交界瘤、32例卵巢上皮性良性肿瘤患者的组织及26例正常卵巢组织进行了IL一10的免疫组化;对3个上皮性卵巢癌细胞株 (SKOV3、Caov3、3ao)进行了IL一10的免疫细胞化学染色;并对上述其中58例卵巢癌、16例良性肿瘤、13例正常卵巢的组织及3个上皮性卵巢癌细胞株蛋白裂解液进行了IL一10western一blot分析，以了解上皮性卵巢癌IL一10的表达，并阐明其与卵巢癌腹腔免疫缺陷的关系。材料和方法 选取64例上皮性卵巢癌、35例卵巢上皮性交界瘤、32例卵巢上皮性良性肿瘤患者的组织、26例正常卵巢组织及4个上皮性卵巢癌细胞株 (SKOV3、Caov3、3ao、OVCAR)为研究对象，使用ELLSA法检测32例上皮性卵巢癌患者术前血清及腹水、4个卵巢癌细胞株培养上清液及10例上皮性卵巢良性肿瘤患者血清与10位健康女性血中IL一10的含量。采用免疫组化方法对64例上皮性卵巢癌、35例卵巢上皮性交界瘤、32例卵巢上皮性良性肿瘤患者及26例正常卵巢组织进行了IL一10的分析:3个上皮性卵巢癌细胞株(SKOV二、Caov3、3ao)进行IL一10的细胞化学染色:并对上述其中58例卵巢癌、16例良性肿瘤、13例正常卵巢的组织及卵巢癌细胞株的蛋白裂解液进行western一bfot分析。用染色强度计算法对免疫组织化学结果进行评分和半定量分析，以及采用Quantity One软件对We stern Blot的结果进行半定量分析。 采用单因素方差(One一Way ANoVA)、Man一Whitney秩和检验、符号浙江大学20()4届硕l学位论文秩和检验(、，ilcoxon法和Kruskal一WalliS法)及成组样本的t检验方法进行统计学分析，显着性水准a二0.05，所有的数据用SPSS Io.ofo:windows软件包进行处理。结果1.卵巢癌患者血清、腹水、卵巢良性肿瘤及正常对照血清11厂10水平 上皮性卵巢癌患者自身腹水中I!二一10的水平(中位数M=140.43 pg/m}，四分位数Q，协分别为l曰.72pg/ml，209.09pg/ml)远远高于其血浆Il.一l()的水平(中位数1= 9.75 pg/ml，四分位数Q.，嘶分别为7.91 pg/ml，!6.72pg/ml)两者有显着性差异(尸=0.000)。卵巢癌组血清I卜10的水平(中位数M书.75 pg/m}，四分位数Q.，称分别为7.91 pg/ml，16.72 pg/m1)明显高于良性肿瘤组(中位数M=3.40，四分位数Q，Q，分别为1.魂9。g/ml，5.92p;/ml)及正常对照组(中位数M叫.24，四分位数Q.，q分别为2.1()p只/ml，6.3409/ml)，有显着差异(户0.()00和产0.00:3)。而良性肿瘤组与正常对照组血清比一10水平无显着差异(户0.529)。2.卵巢癌患者腹水比一10水平与其临床分期及组织学分级关系 卵巢癌I:I(i()l!期与川一IV期患者腹水I卜10水平有显着差异(/左0.()()2)，川~I/期患者腹水II.一10水平(中位数M=193.05pg/ml，四分位数Q一，认分别为129.;犯pg八n!，216.06 pg/ml)高于H期患者(中位数M=llo.14p从/ml，四分位数Q.，Q:分别为IOZ.16pg/ml，119.7()pg/ml)。而卵巢癌腹水日厂10水平与组织学分级无关(户0.992)，叁组之间无显着差异。3.卵巢癌患者血清日J一10水平与其临床分期及组织学分级关系 卵巢癌I:I〔;OH期与川一IV期患者血清IL一10水平无显着差异(烤0.48);卵巢癌血清IL一10水平与组织学分级也无显着差异(乃0.965)。结果表明上皮性卵巢癌患者血清IL一10水平与其肿瘤的分期及分级无关浙江大学2004届硕士学位论文4.卵巢癌细胞株 卵巢癌细?
傅士龙[3]2014年在《人上皮性卵巢癌相关成纤维细胞促癌作用的研究》文中进行了进一步梳理上皮性卵巢癌是女性生殖系统叁大恶性肿瘤之一,发病率仅次于子宫内膜癌,居第二位,而病死率一直高居各类妇科恶性肿瘤的首位。大约75%的卵巢癌患者在诊断时已是手术无法救治的晚期;因此,探索上皮性卵巢癌发生、发展的细胞外机制,以期达到预防和治疗卵巢癌的目的,成为迫切需要解决的重要课题。卵巢癌相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs),作为卵巢癌间质微环境中最主要的细胞成份之一,对肿瘤的生长、浸润、转移发挥重要的调节作用,对肿瘤微环境内的其他非肿瘤细胞,如细胞外基质、其他间质细胞也产生重要影响,在维持肿瘤微环境的动态平衡中发挥着重要作用。CAFs是一种有着多种来源的细胞群体,具有广泛的异质性,是各肿瘤研究的热点,人上皮性卵巢癌相关CAFs也需进行深入的研究。第一部分上皮性卵巢癌相关成纤维细胞与卵巢癌临床病理特征的相关性研究[目的]探讨上皮性卵巢癌中癌相关成纤维细胞与临床病理特征间的相关性。[方法]平滑肌肌动蛋白(α-SMA)为CAFs特异性标志物,α-SMA表达的数量与强度可代表CAFs的存在数量,因此采用免疫组化通用型二步法检测45例非癌卵巢组织中α-SMA表达和145例上皮性卵巢癌组织中α-SMA和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达,并分析两者的相关性及其临床意义。[结果]①正常卵巢组织除卵巢间质血管外,α-SMA不表达;在良性肿瘤间质中少部分阳性表达,且表达较弱;而在交界性肿瘤中,α-SMA表达强度介于良性肿瘤和恶性肿瘤之间。而在145例上皮性卵巢癌中,α-SMA均阳性表达,代表阳性的CAFs细胞在癌组织中的分布有3种方式;且Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌间质α-SMA阳性表达强度明显高于Ⅰ～Ⅱ期(P = 0.016);有淋巴结转移的卵巢癌明显高于无淋巴结转移卵巢癌(P=0.049)。②正常卵巢组织中MMP-9不表达;而上皮性癌中癌细胞MMP-9阳性率为95.2%(138/145)。MMP-9在Ⅲ～Ⅳ期组明显高于Ⅰ～Ⅱ期组(P=0.028),有淋巴结转移组强阳性率高于无转移组(P=0.033)。③α-SMA在上皮性卵巢癌间质强阳性表达与癌细胞MMP-9的表达呈正相关(p = 027)。[结论]α-SMA和MMP-9两者的共同强阳性表达主要集中于Ⅲ～Ⅳ期癌患者和有淋巴结转移的患者中,CAFs的存在与数量增多提示疾病预后不良。第二部分癌相关成纤维细胞与正常卵巢成纤维细胞分离、培养及鉴定一、癌相关成纤维细胞的分离、培养及鉴定[目的]通过分离、纯化、培养及鉴定,获得人上皮性卵巢癌组织中肿瘤相关成纤维细胞。[方法]采用酶消化法获得原代细胞,再通过酶消化+反复贴壁法,传代获得第4代纯化细胞,并绘制细胞生长曲线,通过形态学观察和细胞免疫化学染色,对所得细胞进行鉴定。[结果]获得典型卵巢癌相关成纤维细胞。形态学上,细胞呈长梭形,胞核不明显,细胞大小不一致。其生长潜伏期较肿瘤细胞长,生长相对缓慢。免疫细胞化学上,肿瘤相关成纤维细胞中,成纤维细胞特性蛋白-1、波形蛋白、结蛋白及α-平滑肌动蛋白均表达阳性,而血管内皮细胞、间充质细胞标志均表达阴性。细胞角蛋白在较早传代的细胞中少量表达,通过纯化后基本消失。[结论]本方法可获得典型上皮性卵巢癌相关成纤维细胞,为进一步研究该细胞自身生物学特性及其与卵巢癌间的相互作用提供了必要的细胞学基础。二、正常卵巢成纤维细胞的分离、培养及鉴定[目的]通过分离、纯化、培养及鉴定,获得典型人卵巢成纤维细胞。[方法]采用酶消化+反复贴壁法,获得纯化成纤维细胞,通过形态学观察和免疫细胞化学染色,对所得细胞进行特征性标志及生物学特性的检测,进一步阐述细胞特征,并绘制细胞生长曲线。[结果]形态学上,正常卵巢成纤维细胞形态多样,大部分为梭状型、条索形,还有叁角型、多角型和不规则型等,并具有伪足样外形;其生长潜伏期较长,12-14天可传代;免疫细胞化学上,波形蛋白(Vimentin)表达强阳性,结蛋白(Desmin)、成纤维细胞特异性蛋白1(FSP-1)表达弱阳性;在较早期传代的细胞中,CK-7及CK-P呈少量阳性,随着细胞的纯化,其阳性表达渐行减少直至完全消失;肌动蛋白α(α-SMA)部分细胞表达阳性。而雌、孕激素受体ER、PR以及基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-3、MMP-9)、卵巢粘液性细胞标志CK-20、血管内皮细胞标志CD31、间充质细胞标志CD90、肿瘤标志物(CA125、CA199、CEA)、成纤维细胞激活蛋白α(FAP-α)、血小板衍生生长因子受体α(PDGFR-α)均阴性。[结论]成功获得人卵巢成纤维细胞,为研究卵巢癌及其相关成纤维细胞提供了必要的细胞学工具。第叁部分癌相关成纤维细胞对卵巢癌细胞生物学行为影响[目的]进一步验证CAFs对卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭特性的影响,为研究肿瘤-微环境的相互作用提供必要的细胞学基础。[方法](1)采用细胞共培养体系,通过MTT实验、细胞迁移实验、细胞浸润实验以及流式细胞仪方法检测CAFs对卵巢癌细胞SKOV3、OVCAR3的增殖、迁移、浸润和凋亡的影响。[结果](1)CAFs对卵巢癌细胞具有明显增殖作用;(2)CAFs影响卵巢癌细胞的凋亡;(3)CAFs共培养后促进卵巢癌细胞系的迁移;(4)CAFs共培养后增强卵巢癌细胞系的侵袭能力。[结论]CAFs可明显增强卵巢癌细胞的恶性生物学行为,为进一步研究肿瘤-微环境的相互作用提供了必要的理论基础。第四部分癌相关成纤维细胞与卵巢癌细胞共培养上清因子的检测[目的]为深入了解上皮性卵巢癌细胞与CAFs间发生相互作用后所产生的效应因子,进一步研究间质对肿瘤细胞生物学行为的影响提供必要的研究基础。[方法]采用蛋白芯片 RayBioTM Human Cytokine Antibody Array Ⅱ series Ⅰ(含有507个细胞因子)检测9份细胞培养上清中细胞因子的含量,其中CAFs培养上清3份,OVCAR-3培养上清3份,CAFs+OVCAR-3共培养上清3份;将所测定的因子含量与OVCAR-3所分泌的基础状态因子含量作比较,定义比率升高大于等于2.0或下降小于等于2.0(≥2.0或≤-2.0)者为差异有显着性。[结果]共获得差异表达因子57种,44种表达上调,13种表达下调。其中与细胞增殖相关因子17种,与肿瘤基质形成相关因子11种,与肿瘤趋化及前炎症因子相关因子19种,与肿瘤血管生成和抑制相关因子10种。[结论]肿瘤相关成纤维细胞通过与肿瘤细胞相互作用,可产生一系列细胞因子,或促进肿瘤的进展,或调节肿瘤-微环境的动态平衡,为进一步研究CAFs对卵巢癌的促进作用提供了研究资源。第五部分癌相关成纤维细胞对小鼠移植瘤促进作用的初步研究一、可视化小鼠移植瘤模型的建立[目的]建立可重复观察并且可客观定量的卵巢癌动物模型,为卵巢癌其他领域研究提供基础模型工具。[方法]采用含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体转染人卵巢癌细胞株,获得稳定表达GFP的卵巢癌细胞株GFP-Ovcar3接种裸鼠皮下或腹腔,利用小动物活体成像仪系统动态观察裸鼠移植瘤的生长情况,并对移植大小、轮廓进行定量测定。[结果](1)获得稳定表达绿色荧光蛋白的GFP-Ovcar3细胞;(2)通过接种裸鼠皮下或腹腔,成功获得带有绿色荧光蛋白的小鼠皮下和腹腔移植瘤模型。[结论]建立可视化小鼠模型,可更加直观、明确地获得肿瘤的大小和轮廓,为卵巢癌其他领域研究提供了基础模型工具。二、癌相关成纤维细胞对小鼠皮下移植瘤的促进作用[目的]通过体内实验,进一步证实CAFs在体外实验中所观察到的现象和结论。[方法]通过将前述获得的能稳定表达绿色荧光蛋白的不同浓度GFP-Ovcar3细胞,与CAFs细胞混合接种裸鼠皮下,建立可视化小鼠皮下移植瘤模型,观察成瘤率、测量肿瘤生长情况及远处转移情况。[结果](1)混合接种肿瘤细胞和CAFs细胞的裸鼠,成瘤率明显高于单纯接种肿瘤细胞的裸鼠,CAFs可促进卵巢移植瘤的发生,尤其当接种瘤细胞浓度较低时,促进作用显着;(2)混合接种肿瘤细胞和CAFs细胞的裸鼠,肿瘤生长明显快于单纯接种肿瘤细胞的裸鼠,CAFs可明显促进移植瘤的生长。[结论]通过体内、体外研究证实,CAFs对卵巢癌的发生和生长具有明显促进作用,为探索针对CAFs的卵巢癌新的治疗途径提供了理论依据。叁、人源性卵巢环境小鼠模型的建立[目的]将“人源性”因素加入小鼠模型,为精确模拟肿瘤发生、发展的临床病理过程提供临床前研究工具。[方法]尝试将正常人卵巢组织移植于SCID小鼠皮下,待明确移植物存活并伴有新生血管形成后,通过免疫组化分析卵巢移植物属性;将带有绿色荧光蛋白的肿瘤细胞,接种于卵巢移植物内,形成新的皮下移植瘤,观察新的移植瘤生长及转移情况。[结果](1)卵巢移植物在小鼠皮下生长良好,未见明显感染或组织排斥反应,移植物可见典型血管形成;(2)组织学检查表明:植入SCID小鼠后存活的人卵巢组织形态与植入前的原始人卵巢组织形态相似;(3)免疫组化分析表明:移植物标本为ER阳性和PR部分阳性,抗人CK-7阳性,抗人CD34阳性,表明移植物组织来源于人卵巢,有新生血管形成,仍为雌激素和孕激素依赖型;α-SMA的表达,类似于原始人卵巢组织;(4)接种于卵巢移植物的皮下肿瘤生长良好,并可见1只小鼠腹腔内转移瘤病灶。[结论]植入“人源性”卵巢组织形成新的皮下移植瘤,可模拟人卵巢癌细胞生长的人源性卵巢微环境,有利于肿瘤的生长和转移,较既往的小鼠模型更准确地模拟了卵巢癌发生、发展的临床病理过程。第六部分癌相关成纤维细胞通过PI3K/AKT/XIAP信号通路影响顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡[目的]本研究拟通过CAFs和卵巢癌细胞共培养的方法,阐明CAFs通过影响PI3K/AKT/XIAP信号通路,影响卵巢癌化疗效果。[方法]采用流式细胞术观察共培养组及非共培养组DDP诱导卵巢癌细胞的凋亡改变;应用RT-PCR、Western-blot观察共培养组及非共培养组DDP诱导卵巢癌细胞内PI3K、AKT、XIAP传导通路中mRNA水平及蛋白水平的变化,以及通路抑制剂LY294002对CAFs引起的化疗耐药的逆转作用。[结果](1)通过流式细胞仪检测,DDP对卵巢癌细胞作用的最佳时间和浓度分别为48h,5.0μ g/ml;(2)卵巢癌细胞与CAFs共培养后,DDP诱导的癌细胞凋亡显着减少(p<0.05);(3)Real-timePCR检测卵巢癌细胞内PI3K mRNA的表达共培养组明显高于未共培养组,XIAP mRNA的表达较未共培养组也显着升高(p<0.05),AKT mRNA表达有所升高,但无统计学意义;(4)PI3K/XIAP蛋白表达共培养组明显高于非共培养组,差异有统计学意义(p<0.05),总AKT蛋白共培养组和非共培养组无明显变化,但磷酸化AKT(P-AKT)蛋白表达有显着差异,差异有统计学意义(p<0.01)。加入通路抑制剂LY294002后,共培养组XIAP蛋白表达明显降低。[结论]CAFs与卵巢癌细胞共培养后,CAFs分泌的某种生长因子可使PI3K/AKT/XIAP信号转导通路上调,影响了 DDP诱导的卵巢癌细胞的凋亡。
周建维, 钱元淑, 谢幸, 吕卫国, 陈怀增[4]2004年在《上皮性卵巢肿瘤组织及细胞株IL-10的表达与临床意义》文中研究说明肿瘤的发生发展与宿主免疫功能低下有关 ,而机体正常的免疫反应则依赖于两类细胞因子即Th1与Th2型细胞因子之间的平衡。近年研究表明 ,细胞因子对肿瘤的发生、发展及预后有着密切关系。白细胞介素 10 (IL 10 )主要由Th2细胞分泌 ,被认为是一种潜在
向橦[5]2014年在《IL-17促进CD133~+卵巢癌干细胞样细胞自我更新的作用及机制研究》文中研究说明研究背景卵巢癌目前是死亡率最高的妇科肿瘤疾病,发病隐匿、高复发及易扩散转移是其重要的临床特征。越来越多的研究证明，恶性肿瘤组织中存在着一小部分拥有干细胞样细胞性质的群体，即肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）或称为肿瘤干细胞样细胞（cancerstem-like cells，CSLCs），其在肿瘤的发生、发展、复发及侵袭转移中起着十分重要的作用。在卵巢癌中也存在着肿瘤干细胞，即卵巢癌干细胞（ovarian cancer stem cells，OCSCs），其对卵巢癌的发生、发展、复发及转移同样具有重要作用。因此，从卵巢癌干细胞样细胞这一角度进行研究是治疗卵巢癌的新策略。肿瘤干细胞与普通肿瘤细胞相比，除了具有更强的侵袭、转移能力，更强的化疗抵抗能力以外，最本质的差别是其具有干细胞特性，即自我更新（self-renewal）。不管是肿瘤的发生还是复发和转移灶的形成，都有赖于肿瘤干细胞的自我更新能力。因此，阐明肿瘤干细胞的自我更新机制是研究肿瘤干细胞的关键。肿瘤干细胞的自我更新不仅依赖于其自身内在的信号调控，同时也受到肿瘤微环境的调控，其中，肿瘤相关性炎症最为关键。然而肿瘤相关性炎症对卵巢癌干细胞的自我更新调控作用及机制却缺乏系统深入的研究。我们前期从卵巢癌中成功分离出的CD133+卵巢癌干细胞样细胞（CD133+ovariancancer stem-like cells，CD133+OCSLCs）具有肿瘤干细胞的特性，其能够作为我们研究卵巢癌干细胞自我更新生物学特性的模型。为此，本课题探讨肿瘤相关性炎症对CD133+OCSLCs自我更新的调控作用及其机制。研究目的1．检测CD133+OCSLCs相关性炎症因子及其受体的表达。2．明确IL-17在CD133+OCSLCs自我更新中的作用。3．阐明IL-17调控CD133+OCSLCs自我更新的机制。研究方法围绕上述研究目的，我们采用以下研究方法：一、CD133+OCSLCs相关性炎症因子及其受体1．通过人炎症反应PCR芯片（Human Inflammatory Response PCR Array）技术，比较A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs和非OCSLCs(CD133-A2780卵巢癌细胞系细胞)中炎症因子和相关受体mRNA的表达。2．通过流式细胞、免疫荧光技术验证IL-17R在A2780卵巢癌细胞系，A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs和人卵巢癌组织中的表达情况。二、IL-17在CD133+OCSLCs自我更新中的作用1．通过免疫组化，免疫荧光技术检测IL-17的来源细胞。2．通过肿瘤干细胞成球实验及受体阻断实验研究IL-17体外对A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs和原代卵巢癌细胞来源的CD133+OCSLCs自我更新的作用。3．通过构建IL-17过表达慢病毒后裸鼠体内荷瘤实验研究IL-17对A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs体内成瘤能力的影响。叁、IL-17调控CD133+OCSLCs自我更新作用的机制1．通过全基因组表达谱芯片技术筛选IL-17调控A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs自我更新的相关基因并通过qPCR验证。2．结合自我更新相关基因和生物信息学方法筛选IL-17下游信号通路。3．通过western-blot，免疫荧光和抗体阻断等方法研究NF-κB及p38MAPK两条信号通路在IL-17调控CD133+OCSLCs自我更新中的作用。研究结果1．CD133+OCSLCs表面表达IL-17R我们通过PCR-array技术，比较了A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs和非OCSLCs之间的基因差异，结合这些差异基因的生物学作用，我们选择对IL-17参与CD133+OCSLCs自我更新进行深入研究。免疫荧光和流式细胞技术结果显示A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs表面表达IL-17R并且其表达高于非OCSLC。在新鲜人卵巢癌组织中，通过免疫荧光发现IL-17R表达于原代卵巢癌来源的CD133+OCSCs表面。提示IL-17与CD133+OCSLCs具有相互作用的物质基础。2．IL-17促进CD133+OCSLCs自我更新因为IL-17R需要与其配体IL-17相结合才能发挥功能，因此我们首先通过免疫组化检测发现人新鲜卵巢癌组织中存在表达IL-17的细胞，其主要分布于卵巢癌间质内。免疫荧光进一步证实：表达IL-17的细胞主要为CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞，并且这类细胞与CD133+OCSLCs在人卵巢癌组织中处于同一niche之中。提示IL-17与CD133+OCSLCs具有空间上相互作用的可能性。通过衡量A2780卵巢癌细胞系和原代卵巢癌细胞来源的CD133+OCSLCs在IL-17刺激后的成球数量和成球大小，证明IL-17具有促进CD133+OCSLCs自我更新的作用，经过IL-17R抗体阻断实验进一步证明IL-17促进CD133+OCSLCs自我更新的作用依赖于IL-17R。通过慢病毒介导的基因转染方法建立稳定表达人IL-17的CD133+OCSLCs，结合免疫荧光和ELISA验证IL-17转染效率，成球和受体阻断功能实验验证IL-17转染后促进CD133+OCSLCs自我更新。通过裸鼠体内荷瘤实验证明IL-17具有促进CD133+OCSLCs体内成瘤的能力。3．IL-17通过NF-κB和p38MAPK两条信号通路调控CD133+OCSLCs自我更新通过基因表达谱芯片比较IL-17刺激和未刺激的卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs差异基因，在此基础上分别通过:1.筛选出8个自我更新相关基因，qPCR验证后，通过在线转录因子查找的方法，证实p65和/或AP1为8个自我更新相关基因的转录因子（除TCL1A）；2.生物信息学信号通路预测筛选出NF-κB和MAPK两条信号通路。因为p65和AP1分别是NF-κB和p38MAPK两条信号通路的终末转录单位，提示NF-κB和p38MAPK两条信号通路可能是IL-17促进CD133+OCSLCs自我更新的调控机制,其与生物信息学信号通路预测筛选出来的NF-κB和MAPK两条信号通路相一致。为了明确NF-κB和p38MAPK两条信号通路介导IL-17促进CD133+OCSLCs自我更新，我们通过western-blot、ELISA和免疫荧光技术检测p65和p38,发现CD133+OCSLCs在IL-17刺激5min后，p65和p38开始入核增加并伴随着胞浆蛋白的相应减少。为了进一步确定NF-κB和MAPK两条信号通路介导IL-17促进CD133+OCSLCs自我更新，在IL-17刺激CD133+OCSLCs的情况下，分别加入p65阻断剂PDTC和/或p38阻断剂SB203580，观察成球数量，发现两者阻断剂能够分别或协同抵制IL-17促进CD133+OCSLCs的自我更新现象。由此在IL-17促进CD133+OCSLCs自我更新的过程中形成了一个由NF-κB和p38MAPK两条信号通路介导的调控新机制。研究结论在卵巢癌中，分泌IL-17炎症细胞因子的CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞与CD133+OCSLCs共同处于同一niche中，IL-17炎症因子能够与表达于CD133+OCSLCs上的IL-17R相结合，通过激活NF-κB和p38MAPK两条信号通路，促进CD133+OCSLCs体外自我更新和小鼠体内成瘤。
参考文献：
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