陶慧林[1]2002年在《几种药物对肺主动脉平滑肌细胞增殖作用影响的比较研究》文中进行了进一步梳理前言 肺动脉高压(PAH)是临床常见疾病，发病率及病死率均较高，且发病机理尚不十分清楚，目前亦无比较满意的疗法。肺动脉高压的两大基本病理改变是肺血管收缩和肺血管平滑肌构型重建，因此抑制肺血管收缩，改善肺循环血流动力学以及阻止肺血管平滑肌细胞增殖增强是治疗肺动脉高压的关键。许多相关研究发现，无论在体内、体外，刺激VSMC的增殖，均能被一些药物所抑制。 硝苯地平(Nifedipine)、卡托普利(Captopril)、依那普利(Enalapril)能逆转肺动脉高压时血管重构的作用已为许多研究所证实。地尔硫(艹卓)(Diltiazem)是临床近年来常用的抗肺动脉高压的治疗药物，但对其在逆转肺动脉高压时血管构型重建方面的研究尚未见报道。不同的钙拮抗剂与血管紧张素转换酶抑制剂进行比较研究的也较少。因此，在研究地尔硫(艹卓)对肺主动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖影响的同时，比较硝苯地平、地尔硫(艹卓)、卡托普利、依那普利在抑制PASMC增殖作用方面的异同，为改善肺动脉高压的治疗提供临床前实验依据。 实验材料 1．药品与试剂 硝苯地平：上海第十七制药厂； 地尔硫(艹卓)：天津田边制药有限公司； 卡托普利、依那普利：常州制药厂； 胎牛血清7BS人天津TBD生物技术发展中心； DMEM qqs｝培养基、胰酶（Tyrsin入美国 Gibco公司产品； M’IT：上海化学试剂站分装厂； VldR：中国原子能科学研究院同位素研究所； POPOP、PPO：闪烁纯； 其它试剂均为分析纯； 2．仪器： 细胞培养瓶p5 cm勺96孔细胞培养板上4孔细胞培养板：丹麦 Nunclon公司产品； 二氧化碳培养箱：美国 FOrma Scientific产品； Model 550型酶标仪：日本 BIO－RAD产品； h 3801型液闪烁计数仪：英国 BECKMAM公司产品； 3．实验动物： 雄性 Wistar大鼠，8周龄，体重在 274。16 g，中国医科大学实验动物部提供。实验动物合格证号，NO：辽实动字034号。 实验方法 互．大鼠肺主动脉血管平滑肌细胞原代及传代培养 参照文献所述方法进行，8周龄的雄性Wistar大鼠，在无菌条件下取肺主动脉，以贴块法进行原代 PASMC培养。10天左右可见PASMC生长，细胞呈梭形，典型的峰、谷状。进行换液，长满培养皿后，进行传代。直至细胞数量增殖到一定数量后，接种于96孔或24孔培养板用于实验研究。实验所用的PASMC为第五代细胞。 2．药物对PASMC生长曲线的影响 实验组的 96 IL培养板分别再加浓度相同一 五 mol·L－‘）的Nifedipine、Diltiazem、CaPtoPril、EnalaPril，继续培养20 ／J’时后，以M’IT法测定570 urn吸光度值；连续测定七天并绘制生长曲线图。 ·2· 3．药物对PASMC增殖的作用 实验组的96孔培养板药物不同分成Nifedipine、Diltiazem。CaPtoPril、EnalaPril系歹浓度4L（10－‘、10－’、10“‘10－’10－‘10－’mol·L－‘＊继续培养 20小时后，以 Mrl’f法测定 570 urn吸光度值；比较不同的浓度条件下药物对PASMC增殖的影响。 4．药物合用对PASMC增殖的作用 实验组的 96孔培养板按药物不同分成 Nifedipine门一” mol·L－‘）十Captopril（10－” mol·L－’）组、Dilhazem（10－” mol·L－’）＋Ellalapril门0叫’mol·L叫）组继续培养 20小时后，以 MTh法测定570 urn吸光度值汁b较低浓度条件下的联合用药对 PASMC增殖的影响。 5．药物对勺一TdR掺人的影响 实验组的24孔培养板按药物不同分成硝苯地平、卡托普利。依务普利、地尔硫革系歹浓度组（10－‘、10－’、10－‘、10－’、10－‘、10－’mol·L”）进行’H－TdR掺人实验。使用液闪烁计数仪测定 cPm。比较不同的浓度条件下药物对PASMC增殖的影响。 6．统计学处理： 数据以均值。标准差表示，利用SPSS软件进行统计学分析，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用 Student Newman－Keuls t检验。当P＜0．05时，为有显着意义。 实验结果 ＊连续测定七天后，与对照组相比，各实验组对FBS刺激的PASMC增殖的作用均有不同程度的抑制。MrIT法测定的结果显示，与对照组的（0．579。0．042－1．382。0．138）相比较，NifediP－me组降至（0．575。0．029－1．366。0．095）（P＜0．05）；Dilti－azem组降至（0．535 t 0．030－0．833。0．103八 P＜0．01）、CaPto－pm组降至（0．567。0．030－1．313。0．106）（P＜0．05）及 Enda－ ·3·pril组降至（0．555。0．027－1．338。0．167）（P＜0．05）。 2．与对照组相比，Nifedwine、Diltiazem、CaPtoPd及EnalaPd系列浓度实验组对 15％FBS刺激 PASMC增殖的作用均有不同程度的抑制作用。M’IT法实验的测定结果显示，与对照组的问．266。0．026）相比较，Nifedopne系列浓度实验
陶慧林, 王怀良, 郭伟, 高山红[2]2005年在《几种药物对肺主动脉平滑肌细胞增殖作用影响的比较研究》文中提出目的研究钙拮抗剂硝苯地平(Nif)、地尔硫(Dil)、ACEI类卡托普利(Cap)、依那普利(Ena)抑制肺主动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖的作用,比较两类药物对抑制肺主动脉平滑肌细胞增殖作用的影响。方法培养大鼠肺主动脉血管平滑肌细胞并观察钙拮抗剂、ACEI类及药物合用对细胞增殖作用的影响。结果Nif,Dil,Cap,Ena在10-4,10-5,10-6,10-7mol/L浓度下,对15%胎牛血清(FBS)所致的PASMC增殖均有明显抑制,且呈剂量依赖性的关系(P<0.05,与对照组相比);Nif+Cap及Dil+Ena合用,在10-10mol/L药物浓度下,能明显抑制15%FBS所致的PASMC增殖(P<0.05,与对照组相比);Dil与Nif,Cap,Ena相比较,对15%FBS所致的PASMC增殖作用的影响更明显(P<0.01,与对照组相比);结论钙拮抗剂Nif,Dil,ACEI类Cap,Ena能够浓度依赖性地抑制PASMC的增殖且作用显着。与其他药物相比,Dil抑制PASMC增殖的作用非常显着。Nif+Cap,Dil+Ena合用,在较低药物浓度下具有抑制PASMC增殖的协同作用。
高山红[3]2003年在《大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和有丝分裂的5-HT_（1B/1D）受体机制》文中研究指明目的 肺血管构型重建是肺动脉高压的基本病理改变。肺血管平滑肌细胞增殖和肥大是肺血管构型重建主要特征。5-HT在肺动脉高压的发病过程中有非常重要的作用。研究发现野百合碱所致肺动脉高压大鼠的肺血流中有5-HT水平升高并且肺血管平滑肌有5-HT_(1B)受体mRNA的表达增加。5-HT_(1B)受体基因敲除小鼠能抵抗缺氧诱导的肺动脉高压和肺血管构型重建。5-HT是一种重要的血管活性物质，5-HT不仅刺激肺动脉平滑肌细胞收缩还可造成其增生和肥大，并且能与多种细胞生长因子发生协同作用。很多研究表明5-HT的促有丝分裂作用是通过细胞表面的受体，但是5-HT对肺动脉平滑肌细胞的促有丝分裂作用机制涉及的受体亚型至今未能够完全阐明。为此我们假设5-HT_(1B)受体在肺动脉平滑肌细胞增殖和肺血管构型重建中有重要作用，并做以下研究： 1．建立大鼠血管平滑肌细胞体外培养方法，分析流式细胞术与~3HTdR掺入法在观察细胞增殖指标上的相关性，为研究药物对细胞增殖和有丝分裂的影响和作用机制建立可靠的实验方法。 2．观察5-HT和5-HT_(1B／1D)受体激动剂舒马曲坦对肺动脉平滑肌细胞的促有丝分裂作用，研究选择性5-HT_(1B)受体拮抗剂SB_(224289)和选择性5-HT_(1D)受体拮抗剂BRL_(15572)对5-HT诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖的影响，探讨5-HT对肺动脉平滑肌细胞促有丝分裂作用的5-HT_(1B)受体机制。探讨5-HT_(1B)受体和5-HT_(1D)受体在肺血管构型重建中的作用机制。 3．观察5-HT和5-HT_(1B／1D)受体激动剂舒马曲坦对肺动脉平滑肌细胞和主动脉平滑肌细胞的促有丝分裂作用的差异。比较选择性5-HT_(1B)受体拮抗剂和选择性5-HT_(1D)受体拮抗剂对5-HT诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖和主动脉平滑肌细胞增殖的影响的差异，探讨5-HT对主动脉平滑肌细胞的促有丝分裂作用机制。根据主动脉和肺动脉平滑肌细胞对5-HT的促有丝分裂反应的差异性和5-HT_(1B)受体拮抗剂对主动脉和肺动脉平滑肌细胞增殖的影响的差异，探讨5-HT_(1B)受体拮抗剂成为高选择性的抗肺动脉高压新药先导物的可能性。方法 1.采用贴块法分离培养大鼠肺动脉平滑肌细胞和主动脉平滑肌细胞。用含20%FBS的DMEM培养液原代培养平滑肌细胞，用含5%FBS的DMEM培养液作Vehicle传代培养平滑肌细胞。用不同浓度的FBS刺激细胞生长，分析流式细胞术与’H一TdR掺人法在细胞增殖指标上的相关性。 2.施加5一HT、舒马曲坦和选择性5一HTIB受体拮抗剂SB224289、选择性5一HTID受体拮抗剂BRL15572等处理因素。用四哇盐(M，I’r)比色法计数平滑肌细胞增殖，观察5一HT、舒马曲坦、SB224289和BRL15572对平滑肌细胞增殖的影响。 3.用，H一胸腺嗜咙掺人法观察细胞DNA合成情况，比较实验组与对照组的cPm值，分析特异性的5一HT受体激动剂和5一HT受体拮抗剂对肺动脉和主动脉平滑肌细胞的DNA合成的促进和抑制作用，证明5一HTI。受体是5一HT诱导肺动脉平滑肌细胞有丝分裂的作用点之一。探讨5一HT对主动脉平滑肌细胞的促有丝分裂作用机制。研究选择性5一HT;B受体拮抗剂SB2242s9、选择性5一HT，。受体拮抗剂BRL15572对5一HT诱导的平滑肌细胞有丝分裂的影响。 4.用流式细胞术法分析细胞周期，配合M，rr检测观察细胞增殖，并探讨5一HT对细胞分裂周期的影响以及选择性5一HT受体拮抗剂影响平滑肌细胞有丝分裂所作用的细胞周期。结果 1.大鼠血管平滑肌细胞培养及细胞增殖的考察方法 流式细胞仪指标(PI和SPF)与，H一TdR掺人实验指标(cPm)有极为显着的相关关系。流式细胞仪技术与MTr活细胞染色技术联合应用考察细胞增殖和有丝分裂比单独应用一种指标更能准确反映细胞增殖和有丝分裂情况。 2.5一HT对肺动脉平滑肌细胞的促有丝分裂作用机制 (1)5一HT和舒马曲坦对PASMC的促有丝分裂作用 M竹法检测5一HT10一6 moFL一10一‘moFL可促进肺动脉平滑肌细胞的增殖，增殖率分别为256%士18%;228%土29%;201%土17%。舒马曲坦10一6 moFL一10一8 moFL也可促进肺动脉平滑肌细胞增殖，增殖率分别为从5%士2一%;220%士25%和199%士25%。5一HT从20一6一10一‘moFL和舒马曲坦从10一6一10一”moFL均可以使肺动脉平滑肌细胞的增殖率增加，并呈剂量依赖关系。 流式细胞仪分析5一HT10一5 moFL一10一7 moFL的细胞增殖指数(Pro-liferation Index)为23 .7%土1 .1%，22.6%土0.7%，20.5%土0.8%;S期细胞分数(S一Phase Cell Fraetion)为8 .5%土1 .3%，6.9%土0.4%，5.9%土0.5%。舒马曲坦10一，，10一6 moUL的增殖指数为23.9%土0.8%和21.2%士0.8%;S期细胞分数为8.8%土0.3%和6.6%士0.5%。空白对照组的增殖指数和S期细胞分数分别为17.59%士0.5%和4.68%土0.7%。5一HT和舒马曲坦能够促进肺动脉平滑肌细胞从Go/G，期进入S期，然后进人GZ/M期。5一HT对肺动脉平滑肌细胞的促有丝分裂作用可能有5-HT:二1。受体的参与。 (2)SB2242s9和BRL15572对5一HT诱导的PASMC增殖的影响 MTr法检测SB22428，从10一’moFL到10一‘“moFL的浓度能剂量依赖地抑制5一?
劳金泉[4]2016年在《Survivin对高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡调控及其机制研究》文中研究说明第一部分Survivin在高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞表达及意义背景：先天性左向右分流性心脏病致高肺血流性肺动脉高压最重要的病理变化是肺动脉平滑肌细胞增殖,肺血管重构,确切的细胞及分子机制尚不明确。Survivin是重要的凋亡蛋白抑制剂,抑制细胞凋亡,延长细胞存活。Survivin是否在高肺血流肺动脉高压肺动脉平滑肌细胞表达以及对肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的调控有待进一步研究。目的：证实survivin在高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞上表达,探讨survivin对肺动脉平滑肌细胞可能的调控作用。方法：将成年SD大鼠,雌雄各半,按随机数字方法分为对照组、假手术组和分流组。对照组大鼠未作任何处理。假手术组夹闭腹主动脉十分钟。分流组通过手术方法建立腹主动脉到下腔静脉的分流瘘道,以建立高肺血流性肺动脉高压大鼠模型。11周后,通过对分流瘘道B超检查、右心室肥厚指数测定、肺动脉压力测定、肺组织切片HE染色等确认建模是否成功。免疫组织化学法检测survivin在肺组织的表达及分布。取各组肺动脉平滑肌组织进行原代肺动脉平滑肌细胞培养；用qRT-PCR法检测肺动脉平滑肌细胞survivin mRNA表达水平；western blot检测suvivin蛋白的表达水平；细胞增殖实验(CCK8试剂盒法)检测肺动脉平滑肌细胞增殖；细胞凋亡实验(流式细胞学)检测肺动脉平滑肌细胞凋亡。结果：通过分流组大鼠腹主动脉-下腔静脉分流瘘道B超检查、右心室肥厚指数、肺动脉压力测定、肺组织进行病理切片HE染色,证实已成功建立高肺血流性肺动脉高压大鼠模型。免疫组化显示survivin在高肺血流性肺动脉高压的肺动脉平滑肌上表达。通过qRT-PCR及western blot分析,survivin mRNA及蛋白在分流组肺动脉平滑肌细胞呈现阳性表达,未发现对照组与假手术组有survivin mRNA及蛋白表达。通过细胞增殖实验(CCK8试剂盒法)检测各组肺动脉平滑肌细胞增殖,分流组肺动脉平滑肌细胞增殖显着增加,较假手术组有显着差异(P<0.05),而对照组与假手术组比较无显着差异(P>0.05)。通过细胞凋亡实验(流式细胞学)检测分析,分流组肺动脉平滑肌细胞凋亡较假手术组显着下降(P<0.05),而对照组与假手术组比较无显着差异(P>0.05)。结论：(1)Survivin在高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞表达,正常大鼠肺动脉平滑肌细胞未发现survivin表达。 (2)survivin可能通过调控肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡参与高肺血流性肺动脉高压的发病机制。第二部分Survivin调控高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡及可能的调控通路背景：根据第一部分结论,证实高肺血流性肺动脉高压大鼠的肺动脉平滑肌细胞增殖增加,凋亡受抑；并证实survivin在高肺血流性肺动脉高压大鼠的肺动脉平滑肌细胞表达,而对照组或假手术组大鼠的肺动脉平滑肌细胞无survivin的表达。由此推测survivin可能参与高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的调控。目的：通过构建siRNA-survivin慢病毒载体,对分流组肺动脉平滑肌细胞进行感染,干扰survivin表达,探索survivin是否调控高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡,以及可能的调控通路。方法：利用第一部分已证实为高肺血流性肺动脉高压的分流组大鼠原代培养的肺动脉平滑肌细胞为研究对象,将其分为空白对照组(不作处理),空载病毒组(用阴性对照慢病毒感染)、慢病毒干扰组(siRNA-survivin慢病毒载体感染)。感染成功后,通过qRT-PCR法检测各组肺动脉平滑肌细胞survivinN电压门控钾通道Kvl.5以及Kv2.1 mRNA的表达水平；Western blot法检测suvivin、Kv1.5以及Kv2.1蛋白的表达水平；细胞增殖实验(CCK8试剂盒法)检测肺动脉平滑肌细胞增殖情况；细胞凋亡实验(流式细胞学)检测肺动脉平滑肌细胞凋亡情况。ELISA法检测所培养的肺动脉平滑肌细胞上清液caspase-3以及caspase-9浓度。结果：成功培养了研究所需的高肺血流性肺动脉高压大鼠的肺动脉平滑肌细胞,成功构建并筛选出感染效率高的siRNA-survivin慢病毒载体,成功感染原代培养的肺动脉平滑肌细胞。比较mRNA表达,慢病毒干扰组survivin mRNA表达水平较空载病毒组显着下降(P<0.05)。空载病毒组与空白对照组比较无显着性差异(P>0.05)。慢病毒干扰组Kv1.5以及Kv2.1mRNA表达水平较空载病毒组明显增加(P<0.05)；空载病毒组Kv1.5以及Kv2.1 mRNA表达水平与空白对照组无显着差异(P>0.05)。比较蛋白表达,空载病毒组survivin蛋白表达水平与空白对照组比较无显着性差异(P>0.05),慢病毒干扰组survivin表达较空载病毒组显着下降(P<0.05)。慢病毒干扰组Kv1.5以及Kv2.1蛋白表达水平较空载病毒组明显增加(P<0.05)；空载病毒组的Kv1.5以及Kv2.1蛋白表达水平较空白对照组无显着差异(P>0.05)。通过CCK8检测肺动脉平滑肌细胞增殖活性,空载病毒组的肺动脉平滑肌细胞增殖活性与空白对照组比较无显着差异(P>0.05),慢病毒干扰组肺动脉平滑肌细胞增殖活性较空载病毒组显着下降(P<0.05)。通过流式细胞术检测肺动脉平滑肌细胞凋亡,空载病毒组肺动脉平滑肌细胞凋亡与空白对照组比较无显着差异(P<0.05)；而慢病毒干扰组较空载病毒组细胞凋亡显着上升,与空载病毒组比较有显着性差异(P<0.05)。所培养的肺动脉平滑肌细胞上清液的caspase-3以及caspase-9浓度,慢病毒干扰组caspase-3和caspase-9浓度较空载病毒组明显上升(P<0.05)；空载病毒组的caspase-3和caspase-9浓度与空白对照组比较,无显着差异(P>0.05)。结论： (1)成功将构建siRNA-survivin慢病毒载体并对高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞进行体外干扰,能下调survivin表达,起到抑制肺动脉平滑肌细胞增殖、诱导凋亡的作用。(2)Survivin通过抑制电压门控性钾通道Kv1.5和Kv2.1表达,激活凋亡蛋白家族caspase-3及caspase-9信号通路,促进高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖、抑制凋亡,参与高肺血流性肺动脉高压的发病机制。第叁部分Survivin抑制剂Y2M155体外对高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡调控作用背景：前两个部分已证实survivin调控高肺血流性肺动脉高压的肺动脉平滑肌细胞的增殖与凋亡。YM155是一个新型的小分子survivin抑制剂,抑制survivin启动子的活性。YM155对高肺血流性肺动脉高压的肺动脉平滑肌细胞抑制作用有待进一步研究。目的：研究YM155在体外对高肺血流性肺动脉高压肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的作用。方法：利用第一部分原代培养并经鉴定的高肺血流性肺动脉高压的肺动脉平滑肌细胞作为研究对象,将其分为对照组、药物组。药物组肺动脉平滑肌细胞给予不同浓度的YM155进行干预,用细胞增殖实验(CCK8试剂盒法)检测肺动脉平滑肌细胞增殖情况；细胞凋亡实验(流式细胞学)检测肺动脉平滑肌细胞凋亡情况。结果：药物组设计多个YM155浓度梯度对肺动脉平滑肌细胞进行干预,药物组较对照组细胞增殖活性显着下降,呈浓度依赖性关系。通过流式细胞术检测肺动脉平滑肌细胞凋亡,药物组细胞凋亡较对照组显着增加(P<0.05)有显着统计学意义(P<0.05)。结论：体外实验证实YM155能抑制高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖并促进其凋亡。
黄维佳[5]2011年在《5-HTT与肺动脉平滑肌细胞凋亡在左向右分流肺动脉高压大鼠中关系的研究》文中研究表明肺动脉高压(PAH)是指以肺动脉压、肺血管阻力进行性增高,终末期导致患者右心衰竭及死亡为特征的一种疾病。肺动脉高压通过复杂的病理机制,导致患者在肺组织结构、分子信号途径和基因表达等多个方面均发生了异常。目前研究发现,肺动脉高压是在炎症、异常血流剪切力、缺氧等因素的诱发下,细胞因子及血管活性物质异常产生,并作用于血管平滑肌细胞、血管内皮等靶细胞,导致肺血管异常收缩、生长和重构,细胞外基质堆积等一系列后果,最终形成肺动脉高压,其中肺血管重构是肺动脉高压主要的病理学特征。研究表明,细胞的异常增殖,凋亡减少是组织构型重建的重要原因之一。凋亡是有核细胞在某些生理或病理情况下,基因特定程序被启动,通过DNA内切酶发生有序的主动性非炎症性死亡,又称细胞程序性死亡。细胞凋亡和增殖是矛盾的两个对立面,它们之间的平衡维持着机体组织结构的正常状态和生理功能。越来越多的研究证明,肺动脉平滑肌细胞增殖增加和/或凋亡减少都可促进肺血管中膜肥厚和血管构型重建,是肺动脉高压发病的一个重要机制。正常情况下,血管壁结构是相对稳定的,由相应细胞的增殖和凋亡共同协调维持,当血管壁在受到各种内因和外因(如细胞因子、缺氧、血流剪切力等)的刺激作用下,肺动脉平滑肌细胞内部经过一系列信号转导过程,启动平滑肌细胞增殖基因和/或凋亡抑制基因的表达,导致肺动脉平滑肌细胞的增殖增多和/或凋亡减少,促使肺动脉平滑肌细胞增殖、肥大、迁移,最终引起肺血管壁增厚和肺血管重构。目前,很多学者把抗肺血管重构的目光转移到促进肺动脉平滑肌细胞凋亡这个靶点上,促进肺动脉平滑肌细胞凋亡可能成为未来治疗肺动脉高压的突破口。5-羟色胺转运体(5-HTT)是一种膜蛋白,表达于神经元、血小板、肺动脉平滑肌细胞等体细胞中,主要功能是将5-羟色胺(5-HT)转运至细胞内部发挥生物学效应。5-羟色胺可经细胞膜上的5-羟色胺转运体介导进入肺动脉平滑肌细胞,并通过多条促增殖信号转导途径引起肺动脉平滑肌细胞增殖肥大,导致肺血管构型重建。研究结果表明5-羟色胺转运体在许多类型肺动脉高压的发病机制中起重要作用,但在左向右分流型肺动脉高压中,是否也存在5-HTT的高表达,它与肺动脉平滑肌细胞凋亡状况有无关系,目前尚未见相关报导。他汀类药物是一种3-羟基,3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,它所具有的降脂、稳定粥样斑块、改善内皮细胞功能、抑制血小板聚集、抗炎抗氧化、免疫调节等作用使其广泛应用于心脑血管疾病等领域。近来,越来越多的学者开始关注他汀类药物的“非调脂作用”,国内外有研究发现他汀类药物可通过与肺动脉高压发生的各个环节产生作用,降低肺动脉压力,缓解肺血管过度收缩,抑制肺血管重建,他汀类药物的这些作用可能是通过诱导肺动脉平滑肌细胞或血管内皮细胞凋亡来实现的,用于治疗和预防肺动脉高压有相当的前景。瑞舒伐他汀(rosuvastatin)是一种新型羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,是他汀类药物家族的新成员,其在肺动脉高压中的作用及机制报导甚少,更未见其对于高肺血流性肺动脉高压影响的研究。在本研究中,我们用腹腔分流法建立肺高血流大鼠肺动脉高压模型,通过观察模型大鼠肺动脉平滑肌细胞5-HTT的表达情况及肺动脉平滑肌细胞凋亡情况,了解大鼠肺高血流肺动脉高压的发生是否与这些因素有关,初步探讨肺高血流肺动脉高压可能的发病机制。同时,我们通过瑞舒伐他汀来干预肺高血流大鼠肺动脉高压模型,以观察瑞舒伐他汀是否对肺高血流大鼠肺组织中5-HTT的表达及肺动脉平滑肌细胞的凋亡产生影响,初步探讨瑞舒伐他汀在肺高血流模型大鼠肺血管重构中的作用机制。1.将40只SD大鼠随机分为4组:①分流11周组、②分流8周组、③分流4周组、④对照组,每组各10只。分流11周组、分流8周组和分流4周组采用腹主动脉-下腔静脉分流法建立左向右分流大鼠模型,而对照组开腹但不建立分流。2.在相应时间内处死大鼠,处死前测量大鼠肺动脉平均压(mPAP),处死后对大鼠右心室和左心室+室间隔进行称重,计算右心室肥厚指数(RVI)。3.常规石蜡包埋大鼠肺组织,切片并HE染色,观察各组大鼠肺组织小动脉的形态变化,计算管壁厚度占外径的百分比(WT%)及管壁面积占血管总面积的百分比(WA%)作为反映大鼠肺组织血管重构程度的指标。4.用免疫组化SP法(链霉卵白素-过氧化物酶法)检测大鼠肺组织中5-HTT的表达情况。5.用原位末端标记法(TUNEL法)检测大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡情况并计算TUNEL阳性细胞百分比(AI值)。6.用Western Blot法检测各组大鼠肺组织中5-HTT,bcl-2蛋白的水平。7.用RT-PCR检测各组大鼠肺组织中5-HTTmRNA的表达情况。8.在上述实验的基础上,另将30只SD大鼠随机分为3组(每组10只):①分流组;②分流给药组:分流手术后第二天开始给予瑞舒伐他汀(10 mg/kg)灌胃,每日1次,连续11周;③对照组。观察瑞舒伐他汀对高肺血流肺动脉高压模型大鼠肺组织中5-HTT、bcl-2蛋白表达(Western Blot法)及肺动脉平滑肌细胞凋亡(TUNEL法)的影响。9.所得数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析,所有数据以mean士SD表示,两组间比较采用成组t检验,多组间比较采用单因素方差分析,p<0.05时认为差异具有统计学意义。1.随着分流时间的延长,分流各组大鼠平均肺动脉压、右心室肥厚指数(RVI)逐步升高,第11周模型大鼠出现明显肺动脉压力升高和右心室肥厚的表现,与其他各组间上述指标的差异有统计学意义(P<0.05)。2.随着分流时间的延长,分流各组大鼠肺组织血管壁明显增厚,出现肺动脉平滑肌细胞肥大、增生,管腔狭窄,模型大鼠出现了明显的肺血管构型重建。同时,各分流组肺小动脉管壁厚度占血管外径百分比(WT%)、肺小动脉管壁面积占血管总面积百分比(WA%)也逐步升高,各组之间WT%、WA%值的差异有统计学意义(P<0.05)。3.免疫组化结果显示随着分流时间的延长,各组大鼠肺组织中5-HTT的表达呈逐步升高的趋势,各组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。4.原位末端标记法检测结果提示各组大鼠肺组织血管内均存在一定比例的凋亡细胞。随着分流时间的延长,大鼠肺动脉平滑肌凋亡细胞逐步减少,凋亡指数(AI)也逐步下降。统计学分析显示各组间均有显着性差异(P<0.05)。5. Western Blot法检测结果提示随着分流时间的延长,各组大鼠肺组织中5-HTT蛋白、bcl-2蛋白的水平呈逐步升高的趋势,分流11周组与其他各组间指标的差异有统计学意义(P<0.05)。6. RT-PCR检测结果提示随着分流时间的延长,各组大鼠肺组织中5-HTTmRNA表达水平呈逐步升高的趋势,其中分流11周组最为明显,与其他各组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。7.随着分流时间的延长,各组大鼠肺组织中5-HTT水平逐步升高,而凋亡指数(AI)逐步下降,相关性分析提示5-HTT水平与AI值之间呈明显负相关关系(P<0.05)。8.瑞舒伐他汀干预组大鼠肺组织中5-HTT、bcl-2蛋白水平较分流组明显降低,而干预组大鼠肺动脉平滑肌TUNEL阳性细胞百分比较分流组明显升高,统计分析显示两组间差异有统计学意义(P<0.05)。1.腹腔分流法能使模型大鼠出现肺动脉压明显升高、右心室肥厚、肺血管构型重建等肺动脉高压的病理改变。2.左向右分流大鼠肺高压模型中存在着分流时间依赖的5-HTT、bcl-2蛋白高表达,而肺动脉平滑肌凋亡细胞百分比却低于正常水平,5-HTT介导的5-HT信号通路可能通过上调bcl-2蛋白表达,抑制肺动脉平滑肌细胞凋亡参与肺血管重构。3.瑞舒伐他汀能明显缓解肺高血流大鼠肺动脉压力升高及肺血管重构,瑞舒伐他汀抑制模型大鼠肺血管构型重建可能与抑制肺组织中5-HTT、bcl-2蛋白的表达水平,提高肺动脉平滑肌细胞的凋亡数量有关。
王洋[6]2012年在《益气活血中药通过外膜干预血管衰老及血管衰老的中医证型特点研究》文中研究说明随着经济社会的发展,医疗水平的提高,我国人口平均寿命不断提高,老龄人口的比例逐年增加,针对这一庞大的特殊人群,研究血管衰老,即随增龄心血管系统发生的结构和功能的特征性改变,已成为刻不容缓的问题。研究发现,血管衰老与各种心血管疾病相互作用,影响了疾病的发生的阈值、严重程度和预后,有望成为临床防治心血管病的新靶点。血管衰老的重要特点之一为血管壁弹性的下降和僵硬度的增加,而血管外膜及外膜成纤维细胞(adventitial fibroblasts, AF)具有重要的免疫及内分泌功能,在分泌胶原等细胞外基质,维持血管弹性等方面发挥着关键的作用,可能成为血管衰老研究的新的突破口。课题组前期已经对血管内皮细胞、平滑肌细胞的衰老规律及益气活血中药的作用机制进行了探讨。本研究在此基础上,以血管外膜为切入点,以血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶p47phox、活性氧(reactive oxygen species,ROS)通路为主线,从动物、细胞、分子水平探讨血管衰老的机制,观察益气活血中药(人参叁七川芎提取物)延缓血管衰老的作用,进一步探讨其作用机制。同时,通过临床调查,初步探讨血管衰老的中医证型特点。以期通过本研究,为血管衰老的中医药研究奠定基础,为临床运用中医药延缓血管衰老提供科学依据。本研究分为叁个部分：文献综述、基础研究和临床研究。1.文献综述通过对血管外膜及AF相关文献的归纳,综述了血管外膜和AF在血管疾病发生发展过程中的作用。2.基础研究由以下叁个基础实验构成：实验一：益气活血中药延缓自然衰老大鼠血管外膜重构的实验研究目的：观察自然衰老大鼠血管外膜的病理改变并探讨其机制；观察益气活血中药(人参叁七川芎提取物)对衰老血管外膜病变的干预作用,并探讨其作用机制。方法：建立自然衰老大鼠模型,分为衰老模型组(蒸馏水)、中药高剂量组(人参、叁七、川芎醇提物1493.4mg/kg/d)、中药中剂量组(人参、叁七、川芎醇提物746.7mg/kg/d),中药低剂量组(人参、叁七、川芎醇提物373.4mg/kg/d)、氯沙坦对照组(10mg/kg/d),另设一青年对照组(蒸馏水)。给予相应干预15周后,采用Morris水迷宫自主活动法观察动物的学习能力、记忆获取能力和记忆保存能力,HE染色法观察胸主动脉壁形态,苦味酸天狼猩红染色法观测血管壁胶原种类、分布和含量,扫描电子显微镜观察外膜超微结构,放射免疫分析法检测血浆肾素活性(plasma renin activity, PRA)、血浆Ang Ⅱ浓度及外膜组织Ang Ⅱ含量,生物化学分析法检测外膜组织羟脯氨酸、抗超氧阴离子自由基(superoxide anion, O2)活力单位含量,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测外膜组织1型基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases type1, MMP-1)及其抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase type1, TIMP-1)含量,RT-PCR法检测外膜组织血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin Ⅱ receptor1, AT1R)、血管紧张素Ⅱ2型受体(angiotensin Ⅱ receptor2, AT2R)和NADPH氧化酶p47phox的mRNA含量,western bloting法检测外膜组织AT1R、AT2R和NADPH氧化酶p47phox蛋白表达。结果：与青年组比较,衰老模型组血管外膜外膜增厚,AF增生,外膜厚度/管径增高,胶原分布致密,胶原纤维堆积,粗大,排列紊乱,外膜组织Ⅰ型胶原增加,Ⅲ型胶原减少,Ⅲ型胶原/Ⅰ型胶原降低,羟脯氨酸含量增高,MMP-1含量降低,TIMP-1含量增高,MMP-1/TIMP-1降低,02-合成增加,Ang Ⅱ含量增高,AT1R的mRNA及蛋白表达下调,AT2R及NADPH氧化酶p47phox的mRNA及蛋白表达上调,动物的学习能力、记忆获取能力和记忆保存能力下降。人参叁七川芎提取物能够改善衰老血管形态学改变,抑制AF过度增殖,改善胶原比例紊乱,降低外膜组织中Ang Ⅱ的水平,抑制02合成,调节MMP-1/TIMP-1平衡,从mRNA及蛋白水平上调AT1R及AT2R的表达,下调NADPH氧化酶p47phox的表达,改善动物学习能力、记忆获取能力和记忆保存能力。结论：衰老血管出现外膜重构,表现为外膜增厚,AF过度增殖,MMP-1/TIMP-1平衡失调,胶原堆积,Ⅰ型、Ⅲ型胶原比例紊乱等,其机制可能与AngⅡ、NADPH氧化酶p47phox、活性氧(ROS)通路有关；人参叁七川芎提取物可能通过对外膜局部Ang Ⅱ、AT1R等多靶位的干预,改善外膜重塑,增加血管弹性,进而延缓血管衰老,提高整个机体的状态。实验二：益气活血中药延缓AF复制性衰老的实验研究目的：观察AF复制性衰老的病理变化,观察益气活备中药(人参叁七川芎提取物)延缓AF复制性衰老的作用,并探讨其机制。方法：采用原代培养的方法,通过传代建立复制性衰老AF模型,分为衰老模型组(DMEM完全培养液),中药高剂量组(100m/L人参叁七川芎提取液+DMEM完全培养液),中药低剂量组(50mg/L人参叁七川芎提取液+DMEM完全培养液),VitE组(100mg/LVitE+DMEM完全培养液),另设一5代空白组(DMEM完全培养液)。采用细胞衰老特异性β半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase, SA-β-gal)染色法观察细胞衰老改变,噻唑兰(MTT)比色法分析细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期,免疫细胞化学染色法检测细胞内MMP-1及TIMP-1含量,荧光探针法检测细胞内活性氧(ROS)含量,生物化学法检测培养液内抗O2-活力单位含量,ELISA法检测培养液内Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原含量,RT-PCR法检测细胞AT1R、AT2R和NADPH氧化酶p47phox的mRNA含量,western bloting法检测细胞AT1R、AT2R和NADPH氧化酶p47phox蛋白表达。结果：衰老AF SA-β-gal染色阳性率增加,G1期细胞减少,MMP-1表达降低,TIMP-1表达增加,细胞内ROS荧光强度增加,O2-合成增加,Ⅰ胶原浓度升高,Ⅲ型胶原浓度降低,AT1R mRNA及蛋白表达下调,AT2R、NADPH氧化酶P47phox的mRNA及蛋白表达上调。人参叁七川芎提取物干预后,AF的SA-p-gal染色阳性率降低,G1期细胞增加,MMP-1表达增加,TIMP-1表达降低,细胞内ROS荧光强度减弱,O2-合成减少,Ⅰ胶原浓度降低,Ⅲ型胶原浓度升高,AT1R和AT2R的mRNA及蛋白表达上调,NADPH氧化酶P47phoxmRNA及蛋白表达下调。结论：衰老AF SA-β-gal染色阳性表达增加,MMP-1/TIMP-1合成失衡,胶原分泌紊乱,病变特点与衰老动物一致,可能是衰老血管外膜重构病理过程的参与者；人参叁七川芎提取物可能从mRNA及蛋白水平下调NADPH氧化酶p47phox的表达,减少ROS合成,从而降低SA-β-gal染色阳性表达,调节MMP-1/TIMP-1平衡,调节胶原代谢,进而改善血管重构,延缓血管衰老。实验叁：益气活血中药对Ang Ⅱ诱导的AF增殖及胶原生成等相关因素的影响目的：观察Ang Ⅱ对AF的作用,并探讨其机制；观察益气活血中药(人参叁七川芎提取物)对Ang Ⅱ诱导的AF病理变化的影响,并探讨其作用机制。方法：采用原代培养的方法,建立Ang Ⅱ诱导的AF模型,分为空白对照组(DMEM完全培养液)、Ang Ⅱ诱导模型组(10-6mol/L Ang Ⅱ+DMEM完全培养液)、中药高剂量组(10-6mol/L Ang Ⅱ+100mg/L人参叁七川芎提取液+DMEM完全培养液)、中药低剂量组(10-6mol/L Ang Ⅱ+50mg/L人参叁七川芎提取液+DMEM完全培养液)、Valsartan组(10-6mol/L Ang Ⅱ+10-6mol/LValsartan+DMEM完全培养液)。采用SA-β-gal染色法观察细胞衰老改变,噻唑兰(MTT)比色法分析增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期,免疫细胞化学染色法检测细胞内MMP-1及TIMP-1含量,荧光探针法检测细胞内ROS含量,生物化学法检测培养液内抗O2-活力单位含量,ELISA法检测培养液内Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原含量,RT-PCR法检测细胞AT1R、AT2R和NADPH氧化酶p47phox的mRNA含量,western bloting法检测细胞AT1R、AT2R和NADPH氧化酶p47phox蛋白表达。结果：经Ang Ⅱ诱导后,AF的SA-β-gal阳性染色率增加,S期细胞增多,MMP-1表达降低,TIMP-1表达增加,ROS荧光强度增强,02-合成增加,Ⅰ胶原浓度升高,Ⅲ型胶原浓度降低,AT1R mRNA及蛋白表达下调,AT2R和NADPH氧化酶p47phox mRNA及蛋白表达上调。人参叁七川芎提取物干预后,AF的SA-β-gal阳性染色率降低,G1期细胞增多,MMP-1表达增加,TIMP-1表达降低,ROS荧光强度减弱,02-合成下降,Ⅰ胶原浓度降低,Ⅲ型胶原浓度升高,AT1R和AT2RmRNA及蛋白表达上调,NADPH氧化酶p47phox mRNA及蛋白表达下调。结论：Ang Ⅱ对AF具有促进增殖和SA-β-gal染色阳性表达,诱导胶原分泌紊乱,破坏MMP-1/TIMP-1合成平衡等作用,人参叁七川芎提取物可能经由AT1R从mRNA及蛋白水平下调NADPH氧化酶p47phox的表达,减少ROS合成,从而拮抗Ang Ⅱ对AF的不良刺激,抑制细胞增殖,调节MMP-1/TIMP-1平衡,调节胶原代谢,进而改善血管重构,延缓血管衰老。3.临床研究：血管衰老的中医证型特征研究目的：观察血管衰老的中医证型特点。方法：选择231例原发性高血压患者作为研究对象,利用聚类分析和主成分分析的统计学方法,分析其血管衰老相关指标及中医四诊信息。结果：高血庄合并血管衰老的主要证型为血.瘀证、气虚证、阴虚证,可兼见痰浊及肝阳上亢证候；高血压血管衰老病变发展至动脉粥样硬化时,其主要证型为痰浊证、血瘀证、气虚证,可兼见阴虚及阴阳两虚证候。结论：血瘀证和气虚证贯穿高血压血管衰老发生发展始终,益气活血延缓血管衰老有据可循。本研究创新点(1)本研究从血管研究的新热点——血管外膜入手,以AngⅡ、NADPH氧化酶p47phox、ROS通路为主线,研究益气活血中药延缓衰老作用及机制,是该领域的独创性研究。(2)本研究建立相关的AF模型,首次从成纤维细胞角度进行血管衰老研究。(3)本研究采用聚类分析、主成分分析的统计学方法分析血管衰老相关指标和中医四诊信息,从而阐明血管衰老的中医证型特点,经文献检索未见相关报道。
佚名[7]2003年在《作者索引》文中研究指明第四军医大学学报(J Fourth Milit Med Unsv)2003年24卷索引AAdrian T.TINGB细胞成熟抗原BCMA在细胞内诱导NF-KB的活化(19):1729一1732CClaus H.Schroder慢性乙肝病毒感染的诊断和治疗
佚名[8]2002年在《作者索引》文中研究说明(按汉语拼音字母顺序排列,索引论文前3位作者)AAdrian W Gelb Development 0f anaesthesiology (15):1 345一1346艾玉峰应用带蒂皮瓣、肌皮瓣修复小腿骨外露、骨髓炎创面 (2):183 组织工程骨复合骨
仲琳[9]2005年在《应用基因和药物治疗稳定易损斑块的实验研究》文中研究说明背景 晚近研究表明,动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是由多种病理过程包括炎细胞的浸润、平滑肌细胞的增殖、细胞外基质的增加及血栓形成等参与的慢性炎症性疾病。AS易损斑块具有明显的形态学特点:薄的纤维帽,大量炎性细胞浸润以及脂质聚集。斑块是否容易破裂主要取决于斑块的类型,而不单纯是斑块的大小。因此决定斑块易损性的主要因素是聚集的脂质的增多(斑块的核心)以及炎症造成的纤维帽变薄,后者与降解胶原的巨噬细胞增多和VSMC修复愈合功能的减弱有关。早期AS病灶内可见到单核细胞/巨噬细胞的聚集,此类炎细胞在斑块中的聚集是导致斑块破裂的原因之一,通过产生各种细胞因子、化学因子及生长因子促进AS的进展。在众多炎性因子中单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)是重要的调节单核细胞/巨噬细胞聚集与活化的化学因子。MCP-1作用于血液单核细胞,吸引其至内皮下,构成了AS发生发展的重要机制。 MCP-1是第一个被克隆鉴定的CC家族趋化因子。1989年,Yoshimura等从人神经胶质瘤系U-105MG克隆的cDNA,其核苷酸和氨基酸序列与鼠JE同源,命名为MCP-1。分析MCP-1的核苷酸序列并与其氨基酸序列相比较,显示其cDNA克隆含有一个由53个核苷酸组成的5’端非密码区,一个由389个核苷酸组成的3’端非翻译区。其cDNA的开放阅读框架编码一个含99个氨基酸残基的蛋白质,其中最后的76个氨基酸即是MCP-1,最前面的23个氨基酸残基具有疏水性,是一种信号肽,这与MCP-1是一种分泌蛋白质相符合。 Jarnagin等发现去除MCP-1 N端第2～8位氨基酸得到(1+9-76)huMCP-1突
宁田海, 佟金[10]2015年在《《中国循环杂志》2015年第30卷关键词索引》文中认为说明:1本索引按关键词汉语拼音字母顺序排序。2在第1个汉字相同的情况下,按第2个汉字拼音字母顺序排序,以后依次类推。在第1个汉字音同字不同的情况下,按笔划多少排列。3在关键词相同的情况下按发表先后顺序排列。4以英文为首的词,按第1个英文字母顺序先后排列居文中关键词之前。5在第1个英文字母相同的情况下,按第2个英文字母顺序先后排列,依次类推。6文题、作者后括号内数字为期号,最后为起页。
参考文献：
[1]. 几种药物对肺主动脉平滑肌细胞增殖作用影响的比较研究[D]. 陶慧林. 中国医科大学. 2002
[2]. 几种药物对肺主动脉平滑肌细胞增殖作用影响的比较研究[J]. 陶慧林, 王怀良, 郭伟, 高山红. 中国现代应用药学. 2005
[3]. 大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和有丝分裂的5-HT_（1B/1D）受体机制[D]. 高山红. 中国医科大学. 2003
[4]. Survivin对高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡调控及其机制研究[D]. 劳金泉. 广西医科大学. 2016
[5]. 5-HTT与肺动脉平滑肌细胞凋亡在左向右分流肺动脉高压大鼠中关系的研究[D]. 黄维佳. 广西医科大学. 2011
[6]. 益气活血中药通过外膜干预血管衰老及血管衰老的中医证型特点研究[D]. 王洋. 中国中医科学院. 2012
[7]. 作者索引[J]. 佚名. 第四军医大学学报. 2003
[8]. 作者索引[J]. 佚名. 第四军医大学学报. 2002
[9]. 应用基因和药物治疗稳定易损斑块的实验研究[D]. 仲琳. 山东大学. 2005
[10]. 《中国循环杂志》2015年第30卷关键词索引[J]. 宁田海, 佟金. 中国循环杂志. 2015
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