谢婷 梁宁生(通讯作者)
（广西医科大学附属肿瘤医院药学部 广西 南宁 530021）
【摘要】 目的：研究胸腺五肽及其衍生肽在体外对不同细菌的杀菌活性。方法：根据胸腺五肽结构分别设计合成4种衍生肽如下：①胸腺五肽P5；②直肽链P10；③直肽链P12；④环肽P环。采用琼脂铺板计数法，测定衍生肽的杀菌活性。结果：P5、P10、P12对G+菌和G-菌有一定杀菌活性，其杀菌活性由强到弱依次为P12>P10=P5，P环没有杀菌活性。结论：胸腺五肽及其衍生肽P5、P10、P12对G+菌和G-菌有较弱的杀菌活性，P12环经过修饰成环状后，无杀菌活性，这可能与其疏水性和分子结构有关系。
【关键词】胸腺五肽；衍生肽；杀菌活性
【中图分类号】R687 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）10-0086-03
Study on The Relationship Between Structure and Bactericidal Activity of Thymopentin peptide and its derivatives
Xie Ting, Liang Ningsheng
Dept of Pharmacy, Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021
【Abstract】Objective To study the bactericidal activity of Thymopentin peptide and its derived peptides in vitro.Methods According to the amino acid sequence of Thymopentin,four peptides were synthesized respectively as fellow：①Thymopentin P5;②Straight peptide P10;③Straight peptideP12;④Ring peptide Pring,.The bactericidal activity was determined by agar plating-method.Results P5、P10、P12 possessed bactericidal activity against G+and G-bacteria,its bactericidal activity from strong to weak was P12>P10=P5. Pringhave no bactericidal activity.Conclusion Thymopentin peptide and its derived peptides P5、P10、P12 possess weak bactericidal activity against G+ and G- bacteria .Pringhave no bactericidal activity.It’s bactericidal activity is related to hydrophobicity in the peptide molecule.
【Key words】Thymopentin;derivedpeptides;bactericidal activity、
具有杀菌活性的抗菌肽大多数是阳离子抗菌肽，带正电荷，肽分子中含有较多碱性氨基酸[1-2]，我们在研究磷脂酶A2衍生肽时也发现，含较多碱性氨基酸，带正电荷的衍生肽杀菌活性较强[3-4]。胸腺五肽（Thymopentin）是由精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、缬氨酸和酪氨酸组成的肽段片链[5]，也属于碱性肽，带1个净正电荷，跟我们之前研究的抗菌蛋白有相似的结构特点，很有可能有杀菌活性。因此，笔者尝试对胸腺五肽进行杀菌试验，发现胸腺五肽对临床常见的细菌具有一定的杀菌活性。我们在研究磷脂酶A2分子时还发现环肽对G-菌的杀菌活性比直链肽要强4倍左右[6]。因此，我们对胸腺五肽的分子结构进行延长和修饰，设计和合成了直链肽P10、P12和环肽P环，并检测其杀菌活性, 研究杀菌活性与结构间的关系，报道如下：
1.材料
1.1 细菌3种革兰氏阳性菌（G+菌）
粪肠球菌（Enterococcus faecium,ATCC32088）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,ATCC26003）和枯草杆菌（Bacillus subtilis,ATCC63501）；3种革兰氏阴性菌（G-菌）：变形杆菌（Proteusbacillus vulgaris,ATCC49027）、大肠杆菌（Escherichia coli,ATCC44113）和绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa,ATCC10104）。以上标准株均由广西医科大学微生物学教研室提供（购自中国食品药品检定研究院）。
1.2 药品与试剂
P5,（批号：130408916）；P10，（批号：130408913）；P12，（批号：130408911）；P环，（批号:130408912），由上海波泰生物有限公司合成和纯化，纯度＞95%；1%小牛血清白蛋白（批号：A8010）和Hepes（批号：710B043）：北京索莱宝科技有限公司；LB营养琼脂（批号：120919）：北京路桥技术责任有限公司；LB培养基粉（批号：13052119G）：生物工程（上海）有限公司；无水CaCl2（批号：20081106）：成都科隆化工试剂厂；RPMI-1640（批号：NZD1128）：Thermo公司。
1.3 仪器与设备
Anke TGL-16C台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；TU-1810S紫光分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Thermo420型恒温气浴摇床（Thermo公司）；HWS-20恒温水浴箱（江苏太仓市实验设备厂）；DRP-9272型电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）。
2.方法
2.1衍生肽的制备
将衍生肽干粉离心后，溶于400ul灭菌蒸馏水，配成浓度为10g/L的溶液，分装到多个Ependorf管中，以-20℃冷冻保存。每次根据试验需要取出使用，避免反复冻溶。
2.2 杀菌活性的测定
采用琼脂铺板计数法，参照文献[7]。①取过夜培养的细菌，按1﹕50比例加入3ml新鲜LB培养液，置于恒温气浴摇床中孵育2.5h（对数生长期）；②离心收集、洗涤细菌，将其沉淀物溶解于0.5ml灭菌生理盐水，以分光光度计测出吸光度（λ=660nm）达到0.1时所需细菌浓度，计算细菌稀释倍数；③制备RPMI-1640反应体系（含10mmol/LHepes、1mmol/L CaCl2和 1%BSA ，PH≈7.40），依次将10ul细菌（终浓度为1×109CFU/L）和10ul衍生肽（实验组）或生理盐水（对照组）加入到80ul的该反应体系中，混匀后恒温水浴；④水浴2h后，从该体系中取反应液40ul，加入360ul灭菌生理盐水，连续10倍稀释，共3次，从每一稀释倍数的稀释液中取出100ul置于无菌培养皿（直径为55mm）中，再加入6ml约55℃保温的灭菌LB营养琼脂，混匀，凝固后，电热恒温培养箱过夜培养；⑤18～24h后，取出计算细菌菌落形成单位（colony-forming units，CFU），对照组CFU在30～300之间为可用数据。计算不同浓度衍生肽作用后的杀菌率，制作杀菌曲线，与对照组比较，重复5次，计算平均值。
杀菌率=（对照组CFU－实验组CFU）/对照组CFU×100%。
2.3 统计学分析
用SPSS16.0统计软件进行分析，采用方差分析的方法。计量资料采用x-±s表示,按α=0.05水准，P<0.05，差异有统计学意义。
3.结果
3.1 胸腺五肽及其衍生肽的结构和特点根据胸腺五肽的结构和特点，设计合成的4种衍生肽，分子结构资料如表1。4种肽分子都是阳离子肽，P5带有1个正电荷，P10、P12、P环延长了肽分子的长度，都带2个正电荷，其中P12、P环加入了2个疏水性氨基酸，P环是将P12修饰成环状。
4 讨论
4.1胸腺五肽及其衍生肽的设计胸腺五肽属于碱性肽，携带1个净正电荷。与我们之前研究的磷脂酶A2衍生肽具有相似的结构特点。因此，笔者尝试对胸腺五肽进行杀菌实验，发现胸腺五肽对临床常见的细菌具有一定的杀菌活性，我们根据胸腺五肽结构，对胸腺五肽分子进行延长和修饰，分别设计合成了4种衍生肽如下：①胸腺五肽P5；②直肽链P10，是在胸腺五肽的氨基酸序列后加入一组胸腺五肽的氨基酸序列；③直肽链P12，是在P10的分子中加入2个脯氨酸；④环肽P环，是将P12修饰成环状。
4.2 胸腺五肽及其衍生肽的杀菌活性由图1-图6可知，P5对几种临床常见的G+和G-菌具有一定的杀菌作用，但比我们之前研究的抗菌肽要弱[3,4]。在结构上，①P10在P5的基础上延长了1倍，二者所含疏水性氨基酸比例相同，肽分子带的净正电荷由+1变为+2，但杀菌活性并没有相应的提高，两者的杀菌活性没有明显差别，因此，单纯增加肽分子的碱性，并不能相应提高它的杀菌活性。②P12在P10的分子中加入2个疏水性氨基酸，二者所带的净正电荷量均为+2，疏水性氨基酸比例由20%变为33%，其杀菌活性比P5和P10都要强，因此适当增加疏水性氨基酸的含量，可以提高抗菌肽的活性；③P环将P12修饰成环状，二者所带的净正电荷量和疏水性氨基酸比例均相同，但其反而没有杀菌活性，因此当肽分子修饰成环状后，其所带正电荷和疏水性比较集中，抗菌肽会因为凝聚力太高，反而失去了抗菌活性。因此，抗菌肽杀菌活性不仅与肽分子带有的正电荷量相关，还与所含疏水性氨基酸比例和肽分子的空间结构相关。
5.结束语
胸腺五肽在临床上应用广泛，在治疗严重感染时，是通过提高机体免疫功能而发挥协同抗感染作用[8]。我们研究发现，它还可以直接杀菌，具有免疫调节和杀菌双重功效。本实验以天然胸腺五肽为模板，设计合成了4种肽分子，对其结构和杀菌活性进行了研究，虽然杀菌活性不高，但为以后开发出既具有免疫调节活性，又具有杀菌活性双重功能的药物提供了一定依据。
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基金项目：广西自然科学基金资助项目（NO.2013GXNSFAA019250）；广西医药卫生重点科研课题（NO.重2011075）
论文作者:谢婷,梁宁生(通讯作者)
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第10期供稿
论文发表时间:2015/7/20
标签：胸腺论文; 活性论文; 疏水论文; 正电荷论文; 批号论文; 氨基酸论文; 细菌论文; 《医药前沿》2015年第10期供稿论文;