叶婷, 岳艳, 熊思东[1]2012年在《新型靶向粘膜疫苗诱生CVB3特异粘膜免疫及其预防病毒性心肌炎的研究》文中认为研究背景:病毒性心肌炎是一类临床常见心血管疾病,主要由肠道病毒,特别是柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3,CVB3)经粘膜感染机体导致,目前尚无有效治疗措施,因此其预防性疫苗的研制极为迫切。我们前期利用粘膜递送系统chitosan制备了新型CVB3粘膜疫苗chitosan-p VP1,经滴鼻免疫可诱导一定水平的免疫保护,但其效果尚需加强。M细胞是粘膜抗原摄取的主要入口,而通过靶向M细胞,通过提高疫苗粘膜吸收和转运进而提高疫苗效果的策略也越来越受到人们的关注。目的:以往研究报道,产气荚膜杆菌外毒素(clostridium perfringens enterotoxin CPE)可通过结合M细胞表面高水平表达的Claudin-4受体。本研究欲在原有chitosan-p VP1疫苗系统中引入CPE进而实现疫苗的M细胞靶向递送,以其诱导更强的粘膜免疫应答,提高疫苗免疫保护效果。方法:通过化学偶联法将原核表达的CPE蛋白偶联至chitosan上后,经共凝聚法与p VP1质粒形成复合物,滴鼻免疫小鼠,50μg质粒每次,末次免疫2周检测CVB3特异性血清Ig G、粪便IgA以及脾脏和肠系膜淋巴结T细胞免疫应答。结果:与chitosan-p VP1相比,CPE-chitosan-p VP1可显着增加血清Ig G和粪便IgA的水平,同时脾脏及肠系膜淋巴结T细胞CVB3特异性增殖能力也显着上调,提示其不仅可显着促进全身及粘膜部位的抗体免疫应答,还可有效诱导病毒特异性T细胞的产生。结论:新型靶向粘膜疫苗CPE-chitosan-p VP1可诱导高水平的CVB3特异性粘膜和全身免疫应答,有望成为新型病毒性心肌炎预防疫苗。
徐薇[2]2003年在《新型chitosan-DNA疫苗诱生CVB3特异粘膜免疫及其预防病毒性心肌炎的研究》文中提出柯萨奇病毒属细小RNA病毒科肠道病毒属，柯萨奇B3病毒（CVB3）作为代表性的柯萨奇病毒，是CVB的6个血清型中致病性最强的一型，其感染与急、慢性心肌炎和扩张性心脏病高度相关，已成为较严重的社会健康问题，对其致病机制的研究以及相关的防治研究日益受到人们的重视。CVB3为球型二十面体对称无包膜病毒，其核衣壳由四种共60个结构蛋白质VP1、VP2、VP3和VP4组成。作为肠道感染病毒，CVB3在pH 3~10范围内稳定，并通过与细胞膜上的CAR/CD55/DAF结合宿主细胞，导致隐藏于核衣壳内部的VP4和VP1蛋白暴露于病毒表面，促进细胞膜对CVB3的包裹和摄入。由于CVB3系粘膜感染病毒，其致病机制与CVB3对心肌细胞直接和间接的病理损伤有关，因此诱生粘膜免疫和特异性细胞免疫应答是预防及治疗CVB3病毒性心脏病的重要措施。DNA疫苗自90年代发展以来，具有诱生全面有效的免疫应答并且易于诱生特异性CTL的特性，在抗感染和抗病毒免疫中具有独特的优势。为诱生CVB3特异性体液及细胞免疫应答，本课题前期研究发现以50?g编码CVB3 结构蛋白VP1的质粒DNA经肌肉免疫BALB/c小鼠叁次，可诱生CVB3特异性免疫应答，并具有一定的免疫保护作用。然而该DNA疫苗仅诱生了较高水平的IgM和IgG，不能诱生粘膜IgA，而良好的粘膜免疫应答在抗CVB3早期感染中扮演着重要的角色。如何更好地诱生CVB3特异性粘膜免疫应答成为本研究的主要设计思路。甲壳类动物来源的天然生物多糖chitosan证实具有增强粘膜吸收、促进胞间运输、缓释和生物可降解等多种良好特性，已被用于药物赋形剂与缓释剂。为此，本研究综合DNA疫苗诱生体液及细胞免疫的优势、chitosan增强粘膜吸收和缓释的特性，设计了旨在增强粘膜免疫应答的chitosan-DNA疫苗。在此基础上通过引入双功能“载体多肽”HA-pLys16，进一步构建了chitosan-DNA-HApLys16新型疫苗。通过对这两种新型疫苗的体内外表达研究、免疫BALB/c小鼠后诱生的特异性免疫应答研究、抗病毒攻击试验以及对其预防病毒性心肌炎的研究，获得以下结果：一、新型chitosan-DNA疫苗的构建和生物学特性研究<WP=6>自Hela细胞培养上清中的CVB3（Nancy株）提取病毒总RNA，经逆转录得到CVB3的总cDNA，以cDNA为模板，根据文献设计的主要结构蛋白VP1的上下游引物，扩增得到VP1编码852bp基因片段，以Hind III和Bam HI双酶酶切，连接入同样以双酶酶切的pcDNA3质粒中，构建了pcDNA3-VP1质粒。经PCR鉴定、双酶切鉴定和DNA测序，证实该质粒构建的正确性。体外将该质粒转染Hela细胞，检测上清中VP1蛋白的表达情况，发现pcDNA3-VP1在Hela细胞中可有效表达，表达可持续至72小时。在此基础上，分别配制0.02%的chitosan溶液和pcDNA3-VP1溶液，在pH5.5和高速振荡下，形成chitosan-pcDNA3-VP1（以下简称chitosan-DNA）复合物颗粒。从颗粒形态、保护DNA能力和体外表达几方面研究了该复合物的特性：1）透射电镜证实chitosan-DNA复合物为均一的、直径约为80～100nm的球形颗粒。2）以DNase I处理chitosan-DNA复合物，而后再以chitosanase酶消化chitosan，发现包裹在chitosan中的质粒DNA可被完整地释放出来，不被DNase I降解，提示chitosan具有保护DNA免遭降解的功能。3）为检测chitosan-DNA复合物的转染效率和表达时相，以含1?g pEGFP的chitosan-DNA直接滴加于Hela细胞表面，以1?g pEGFP以及pEGFP－Lipofactamine为对照，观察荧光表达情况，发现chitosan-DNA的表达显着高于DNA的表达，在时相上，该复合物转染24小时仅有少量表达，48小时后，绿色荧光的发光面积和强度都有所增高，虽不及pEGFP-Lipofactamine表达，但显着高于单纯DNA对照，证实chitosan可增强质粒DNA在上皮细胞中的瞬时表达。4）以chitosan-pcDNA3-VP1转染Hela细胞，ELISA法检测上清中VP1蛋白的表达，发现chitosan-DNA复合物中VP1的表达低于pcDNA3-VP1质粒-Lipofactamine的表达水平，但显着高于pcDNA3-VP1质粒直接转染细胞后的表达，提示chitosan的加入可增强复合物中基因的表达。二、chitosan-DNA疫苗诱生的特异性免疫及免疫保护作用为探明chitosan-DNA疫苗是否可在动物体内诱生CVB3特异性免疫和保护性免疫应答，首先摸索了最佳的免疫方式，以含50?g pcDNA3-VP1剂量的chitosan-DNA于0天、10天、31天，以肌注、口服、滴鼻叁种途径免疫小鼠叁次，总剂量150?g，免疫3次后4周以5(LD50 的CVB3致死性攻击小鼠，观察各组小鼠的存活情况。结果发现：chitosan-DNA滴鼻组可保护33.3%小鼠长期存活；口服组仅达到16.7%的保护率；肌注组无保护作用。提示滴鼻免疫途径可能<WP=7>是chitosan-pcDNA3-VP1基因疫苗最适的免疫途径。而后研究了chitosan-DNA经滴鼻免疫后在鼻咽原位的表达情况。以pcDNA3.1-Hygro-LacZ质粒作为模式质粒，分别以50?g的 chitosan-DNA、DNA、pcDNA3经滴鼻免疫BALB/c小鼠，5天后取小鼠鼻咽部，以X-Gal底物显色，结果发现pcDNA3滴鼻小鼠鼻咽仅有微量染色；DNA滴鼻有少量着色，而chitosan-DNA组在鼻咽的咽周围组织均显示较深的蓝色着色，其反面（鼻咽之鼻部）亦有较深着色，提示chitosan-DNA可增强DNA在鼻咽的原位表达。随后
参考文献：
[1]. 新型靶向粘膜疫苗诱生CVB3特异粘膜免疫及其预防病毒性心肌炎的研究[C]. 叶婷, 岳艳, 熊思东. 第八届全国免疫学学术大会论文集. 2012
[2]. 新型chitosan-DNA疫苗诱生CVB3特异粘膜免疫及其预防病毒性心肌炎的研究[D]. 徐薇. 复旦大学. 2003
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