秦卓明[1]2006年在《新城疫病毒流行株致病性和抗原性及其与F和HN基因变异的相关性》文中提出鸡新城疫(Newcastle disease,ND)是由一种Ⅰ型副黏病毒-鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引发的一种急性传染病。未经免疫的鸡群,传播性极强,发病和死亡率都非常高。即使一些已经多次免疫的鸡群,由NDV引发的急性和亚急性死亡仍不断零星发生,而由新城疫引起的呼吸道感染、亚临床感染及产蛋下降则更为普遍。六十年来,NDV一直是对鸡群危害最大的疫病。近十年中,国内禽病界一直试图在分子遗传水平阐明NDV毒株的变异趋势,在分子流行病学上已积累了大量毒株的资料和信息。但是,这些研究对信息的比较分析的深度不够,缺乏系统的对病毒的生物学性状与基因变异相关性的研究,特别是还没有在疫病控制方面最为关心的对不同基因变异的相关性及其与抗原性变异的相关性方面开展深入的研究。本研究测定和比较了叁十株NDV野毒株的融合蛋白(F)基因和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的全基因序列,首次对大量NDV毒株的F基因、HN基因,从致病性和抗原性变异两个方面及其与基因变异的相互关系进行系统的比较研究,获得了以下进展:一、NDV的分离鉴定和蚀斑纯化所用30个毒株均是1996～2005年期间从山东、江苏等不同地区的鸡、鸭、鹅、鸽等不同家禽分离,经用已知对NDV、禽流感(H5和H9型)等单因子阳性血清作血凝抑制试验(HI)证明均为NDV。同时对其中20株在细胞培养上完成了蚀斑纯化。二、NDV的致病性比较研究经MDT(鸡胚平均死亡时间)、ICPI(1日龄鸡脑内接种致病指数)及IVPI(6周龄雏鸡静脉致病指数)测定试验,30株NDV野毒有28株为强毒,1株为中等毒力,另一株尚未确定。对20个已蚀斑克隆纯化的病毒株的致病性作了重复实验,各毒株克隆纯化前后的毒力水平基本一致,表明分离物中的病毒组成是同源的。但有2个未能适应细胞的毒株例外,在经鸡胚连续传代后,与原代毒相比,一株的致病指数显着降低(SBZ02),而另一株(SY03)从第5代则显着升高。这表明,有一部分原始毒可能存在着致病性不同的病毒混合物。叁、NDV流行毒株的抗原性变异选择了17个克隆化毒株和3个参考株(La Sota、Clone30和F48E9),利用SPF鸡分别制备了单因子阳性血清,分别用HI和病毒中和反应比较了它们与我国最广泛应用的Ⅱ型疫苗毒La Sota株和中国经典强毒F48E9间的抗原性交叉反应。结果表明:在我国鸡群中已
曲鲁江[2]2001年在《新城疫病毒单克隆抗体的建立及其遗传变异分析研究》文中指出本文分为两部分，前一部分试验是制备用于新城疫病毒（NDV）遗传变异分析的NDV单克隆抗体（McAb）及其生物学特性的鉴定，后一部分试验是通过对两株NDV F基因的克隆及序列测定，对其进行遗传变异分析，从而确定二者在NDV遗传进化过程中所处的位置。 用蔗糖密度梯度离心纯化的标准强毒F_(48)E_9作为抗原，免疫BALB/C小鼠，按常规的方法进行细胞融合、克隆，经反复验证，得到能稳定分泌抗体并产生腹水的杂交瘤细胞六株。经鉴定，其中有五株McAb是血凝素-神经氨酸酶（HN）的McAb，只有一株是融合蛋白（F蛋白）的McAb，各株McAb腹水的ELISA效价均在1/10~3以上，HN蛋白的McAb具有较高水平的血凝抑制（HI）价，F蛋白的McAb具有较高水平的病毒中和作用及蚀斑形成抑制作用。 经实验验证，应用单克隆抗体检测不同来源的NDV时，细胞ELISA方法具有经济、有效的特点。因此，确定该方法是可行的。 从江西、云南两地区爆发新城疫鸡病料中经分离到两株新城疫病毒，并将其命名为：FJ1、FY1。两个毒株经血凝和血凝抑制试验初步鉴定后，采用蚀斑纯化方法，选择出引起新城疫发生的主导毒株，尤其排除疫苗毒株。对分离后的毒株进行生物学特性鉴定，如最小致死量致死鸡胚平均死亡时间（MDT）、1日龄鸡脑内接种致病指数（ICPI）和血凝谱测定，并进一步对F基因部分片段克隆测序，分析各毒株遗传变异情况。 蚀斑纯化表明，在无胰酶和镁离子存在的情况下，低毒力的新城疫病毒在细胞培养物上不能形成蚀斑，强毒和中等毒力的毒株均可形成蚀斑。MDT和ICPI测定结果表明，所分离的两个毒株MDT、ICPI均达强毒标准，说明都是强毒。 根据NDV F基因起始密码子前的非编码区和上游区段的序列设计一对引物，这对引物可扩增出F基因上游区段的908bp片段。采用此引物对这两个 毒株进行 RTFCR扩增后，将 PCR产物重组到 pUC载体上。核昔酸序列 测定结果表明，两个毒株 F蛋白的裂解位点氨基酸组成为：‘’‘gQR（K）RF‘”， 具有强毒株裂解位点氨基酸组成，说明都是强毒株，这与 MDT和 ICPI测定 结果相吻合。选择l刁 核苦酸序列，对本试验两个和国内现已克隆测序 的H十多个NDV毒株（郭慈，1999；梁荣，1999）以及国外部分毒株共86 株绘制基因系统发育进化树。结果表明刊 归属于基因型 Vll，FY归属于基 因型h。从我国己分离毒株基因分型来看，分别归属于基因型爪VI、Vll、 i、IX，其中IX和皿基因型是我国新近发现的，说明我国新城疫病毒既有国 外流行基因型，还具有自身特有基因型，同时可以看出各基因型具有一定的 时间和地域特点。
薛松果[3]2004年在《单抗夹心ELISA检测鸡新城疫病毒抗原的研究》文中研究指明鸡新城疫（Newcastle Disease ND）俗称亚洲鸡瘟，是由禽副粘病毒1型（APMV-1）引起的鸡的一种高度接触性传染病。近年来，随着非典型ND传播与流行的日渐增多，传统的诊断方法已不能完全满足临床需要。本研究应用自制单抗建立的单抗夹心ELISA试验方法，可对该病作出快速、准确诊断。本文分为两部分。第一部分是鼠抗新城疫病毒（Newcastle Disease Virus NDV）单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定，第二部分是应用自制单抗建立夹心ELISA试验方法并对其反应条件进行优化。蔗糖密度梯度超速离心法纯化NDV效果良好。接种NDV F48E9株于10～11日龄鸡胚尿囊腔，平均每枚鸡胚收获尿囊液约8mL，血凝价（HA效价）在29～212之间。尿囊液粗提后再经20～60%、梯度为20%的蔗糖密度梯度超速离心法进一步纯化，在40～60%的蔗糖梯度层有一乳白色的病毒带。透析后，测其HA效价高达215，较纯化前有明显提高。用Folin酚法测得病毒的蛋白浓度约为1mg/mL。建立了筛选阳性杂交瘤细胞的间接ELISA试验方法并对其反应条件进行优化。当纯化的NDV抗原每孔包被47ng，酶标抗体羊抗鼠IgG-HRP的稀释度为1∶800时，阳性对照的OD492值大于1.0，而阴性对照的OD492值小于0.1。分别用鼠抗NDV抗血清和健康鼠血清作为阳性和阴性对照，对照血清的稀释度为1∶1600。用蔗糖密度梯度超速离心法纯化的NDV作为抗原，按常规方法免疫6～8周龄雌性Balb/C小鼠。小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按2∶1至5∶1的比例混合，经50%PEG 4 000融合后，HAT培养基选择培养10～12天进行阳性筛选。融合细胞分置6块96孔细胞培养板培养，共576孔，其中391孔有杂交瘤细胞生长，融合率为67.9%；经间接ELISA检测上清得阳性细胞孔数40，阳性率为6.9%。挑选出其中OD492值在1.0以上的孔共10孔进行有限稀释法克隆或亚克隆。最终得到3株能稳定分泌抗体并产生腹水的杂交瘤细胞3株，分别命名为1F9、1C6、4D5。按5×105细胞/0.2 mL/只的量将3株杂交瘤细胞分别注入小鼠腹腔，约15<WP=8>天后，小鼠腹部明显涨大，用注射器分次收集腹水，腹水呈黄色至淡血红色不等。平均每只小鼠可获4～5mL腹水。应用辛酸-硫酸铵法对腹水进行纯化，蛋白得率为28.2%～31.4%。对3株单抗的部分生物学特性进行鉴定，结果为：叁株单抗均具有较高的ELISA效价（1.5×104～1×105）；1F9、4D5两株单抗同时具有较高的HI效价（29，28），而中和效价（VN）偏低（二者都小于10）；单抗1C6株具有较高的VN效价(103)，却无血凝抑制能力（HI效价为0）。配对试验的结果显示：1C6、 4D5分别作为包被单抗和酶标记单抗时，ELISA反应有较高的OD492值，系统的敏感性较其它组合要高。在此基础上建立了单抗夹心ELISA试验方法，并对其反应条件进行优化。试验结果表明：酶标板经紫外线照射处理，包被单抗1C6、酶标单抗4D5-HRP分别作800倍、1600倍稀释，包被液、封闭液、酶标抗体稀释液分别选用0.05mol/L pH9.6 Na2CO3-NaHCO3、l%BSA和4%NCS-PBS，酶标抗体和底物分别作用30min和15min时所测得的阳性OD492值相对较高，阳性OD492值与阴性OD492值之比最大，试验效果最好。对单抗夹心ELISA反应系统的特异性、敏感性和重复性作了鉴定。结果表明：NDV阳性血清可特异性阻断酶标抗体与NDV之间的的反应；该系统最少可检出2.5ng/mL的NDV纯化蛋白；该系统检测阳性样品的变异系数（CV）小于5%。
程彦丽[4]2012年在《鸭新城疫病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及应用》文中研究说明鸭新城疫是由新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus,NDV)引起鸭的一种急性、高度接触性、败血性传染病，可造成鸭的大量死亡，使养鸭业损失严重。加强该病的诊断方法的研究对预防和控制鸭新城疫的发生，保护和促进养鸭业的健康发展具有重要意义。核衣壳蛋白（NP蛋白）是鸭新城疫病毒结构蛋白中含量最多、保守性高且具有免疫原性的一种蛋白。为此本研究构建了NP蛋白的原核表达载体并进行了诱导表达，对重组蛋白进行了免疫原性的鉴定，并以NP蛋白为免疫原，制备了NP蛋白的单克隆抗体，建立了以NP蛋白为包被抗原的间接ELISA方法，和检测抗鸭NDV的双抗体夹心ELISA方法。本研究根据GenBank发表的鸭NDVSDWF02株NP基因序列，设计并合成一对特异性引物，扩增出鸭新城疫病毒的NP基因，与原核表达载体pET-28a构建了重组质粒pET28a-NP。将测序正确的重组质粒转化至Rosetta感受态菌种，IPTG诱导后，SDS-PAGE分析表明，54KD的融合蛋白得以表达，主要以包含体形式存在。Westernblot显示，该蛋白能与鸭新城疫的阳性血清发生特异性的反应，表明具有良好的免疫原性。用纯化后的重组蛋白为包被抗原，建立检测鸭新城疫抗体的间接ELISA方法，方阵滴定试验确定最佳包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，最佳包被浓度为10ng/well，血清最佳稀释度为1:1000。经应用试验表明该方法具有良好的特异性、可重复性和敏感性，为临床检测鸭新城疫抗体水平提供了一种简单、准确、快速的诊断方法。用纯化的鸭NDVNP蛋白作为免疫原，免疫6-8周龄的BALB/c小鼠，通过淋巴细胞杂交瘤技术，经以重组NP蛋白为包被抗原的间接ELISA方法筛选，获得了2株能稳定分泌抗鸭NDVNP蛋白单抗的杂交瘤细胞株A1、B2。经ELISA检测A1、B2细胞上清效价均为为212，诱生的腹水的效价分别为107,106。Westernblot和IFA显示，只有A1株能与病毒发生特异性反应。抗鸭NDVNP蛋白单克隆抗体的成功研制，为鸭NDV的免疫学诊断及致病机理的研究奠定基础。用纯化后的腹水A1为捕获抗体，抗鸭NDV多克隆抗体为第二抗体，建立了检测鸭NDV抗原的双抗体夹心ELISA方法。方阵滴定试验确定，单抗和多抗的最佳工作浓度分别为1：1600、1:1600，最佳包被液为CB。应用试验表明该方法具有良好的特异性和重复性，为建立准确、灵敏、易于普及的鸭NDV诊断试剂盒提供了理论基础。
梁俊文[5]2010年在《新城疫分离株P和HN基因分子进化与致病性的相关研究》文中研究表明新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种烈性传染病,发病急,感染率和死亡率高,有时高达100%,它主要危害禽类,特别是鸡。该病在全世界广泛分布,对养殖业造成重创。世界动物卫生组织将该病列为必上报疾病,我国将该病列为一类动物疾病。目前,ND流行又呈现新的特点,为ND防治提出了新的挑战,全面了解ND的发病机制是当前急待解决问题。NDV是副粘病毒科(Paramyxoviridae)禽副粘病毒属(Avulavirus)中禽副粘病毒血清Ⅰ型(Avian paramyxoviruses serotype 1,APMV-1)唯一成员。它为单股、不分节的负链RNA病毒,基因组由15.2kb左右,以3’-NP-P-M-F-HN-L-5’顺序排列,至少编码七种蛋白。其中P基因是唯一能够编码多蛋白的基因,其独特的基因结构和编码方式是NDV重新分属的依据之一。以往NDV致病性蛋白研究主要集中病毒囊膜表面的糖蛋白,特别是F蛋白,但是最近科学家们陆续发现NDV的多个基因产物也参与其中,其中包括源于P基因“RNA编辑”的产物——V蛋白。这些为日益复杂的新城疫防治提供了新的思路。本研究从1997～2007年感染ND病料中分离,纯化得到14株NDV野毒株。同时在近几十年来大量NDV毒株分子流行病学和生物学资料基础上,借助生物信息学等方法对所选毒株的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因和/或磷蛋白(P)基因进行研究。首次探讨了P和HN基因分子进化及其相互关系以及它们与致病性关系,获得了如下进展:一、ND毒株的分离、鉴定和纯化与生物学特性从我国不同地区的鸡和鸭等家禽分离14个毒株,用已知对NDV、禽流感(H5和H9型)等单因子阳性血清作血凝抑制试验(HI)证明均为NDV。同时在细胞培养上完成了蚀斑纯化。经MDT(鸡胚平均死亡时间)、ICPI(1日龄鸡脑内接种致病指数)及IVPI(6周龄鸡静脉致病指数)测定试验,所有NDV野毒株均为强毒。二、NDV分离株P基因的分子进化与致病性关系为研究NDV P基因及其编码蛋白的遗传特性和NDV流行特点以及致病的作用,将分离到毒株的P基因进行克隆、测序,并从GenBank中选取41个国内外不同时期和区域的NDV毒株P基因序列,首次进行P蛋白和V蛋白系统发育与致病性关系研究。氨基酸同源性比较显示:我国NDV毒株与疫苗株及国外毒株比较,P蛋白和V蛋白的同源性低。氨基酸序列分析表明:不同地域分离株P蛋白序列含有独特的氨基酸位点;V蛋白羧基端结构域与NDV侵蚀宿主种属范围和毒力强弱有关。依据P基因系统发育树将历史上NDV分离株分成两个分支,一支以20世纪70年代前北美分离株以及澳大利亚分离株为主,包括Ⅰ～Ⅳ基因型,多以中毒力毒株和弱毒株;另一支由目前世界范围内流行的强毒株构成,包括Ⅴ～Ⅶ基因型。叁、NDV分离株HN基因的分子进化与致病性关系将得到的14株NDV毒株的HN基因进行克隆、测序,与GenBank中筛选的29个国内外不同时期和区域NDV毒株的HN基因序列进行HN蛋白系统发育与致病性关系研究。糖基化位点和抗原指数分析表明,与国内传统强毒株相比,国内流行株有一个潜在糖基化位点缺失和两处抗原表位发生变化。氨基酸序列分析表明:NDV不同基因型毒株的HN蛋白序列含有独特的氨基酸位点。HN基因系统发育和氨基酸同源比较表明:NDV分离株可分成两大类,第一大类为最近分离的水禽弱毒株;第二大类又可细分成两大分支,一支以20世纪70年代前北美分离株以及澳大利亚分离株为主,包括Ⅰ～Ⅳ基因型;另一支由目前世界范围内流行的强毒株构成,包括Ⅴ～Ⅶ基因型。四、NDV分离株HN和P基因分子进化及其相关比较将分离到的NDV毒株,分别进行HN和P基因克隆测序,结合15个已发表的国内外不同时期和地域的NDV分离株的HN和P基因,计算毒株间HN和P基因的不同核苷酸和氨基酸片段进化距离,利用统计软件进行了片段间进化距离的方差分析,HN或P基因核苷酸进化距离与毒株分离时间、HN或P基因片段与其全长间以及HN和P基因全长间的相关分析。统计分析显示:NDV HN基因不同核苷酸或氨基酸序列片段变异程度不一样,P基因同样如此;不同毒株间的HN基因片段与其全长间无论是核苷酸还是氨基酸遗传变异高度相关,P基因片段以及HN和P基因全长间同样如此。以上说明,NDV HN和P基因虽以不同的方式进化,但是HN和P基因遗传变异的趋势是相同的。另外,不同毒株与Hert33在分离年代和核苷酸进化距离相关性比较说明,HN和P基因的变异与分离时间有一定的联系。五、NDV P蛋白和V蛋白基因分子进化分析选取55株NDV毒株代表不同地区和时间P基因序列,计算了不同P蛋白和V蛋白氨基酸片段同源性以及核苷酸同义替代率和非同义替代率,以评价不同选择压力对NDV P蛋白和V蛋白基因的影响。结果显示:相同核苷酸经不同重迭阅读框编码得到的氨基酸差异显着,它们的核苷酸替代方式不同。这说明,P基因的重迭阅读框进化是NDV适应不同选择压力的结果,也是存在于NDV准种中的P基因独特空间分布。由相同核苷酸通过不同阅读框编码得到的蛋白质之间关联性分析可知:P基因相同变异较快部分编码得到的P蛋白片段不含有功能性结构域,V蛋白可能含有宿主免疫系统识别的抗原位点。
王学艳[6]2008年在《NDV分离株F及HN基因的遗传变异分析与核酸疫苗质粒的构建》文中提出新城疫病毒(NDV)是副黏病毒科副黏病毒亚科禽病毒属的成员,是有囊膜的负链RNA病毒,可引起禽类的新城疫。我国经过多年的综合防制,现已基本控制了该病的流行。近年来,我国新城疫的发生出现新的特点,即非典型新城疫病例日益增多,高抗体鸡群出现发病等。许多学者认为这可能与NDV毒株变异有关。开展NDV的病原研究和新型疫苗的开发显的尤为重要。本研究对6株NDV分离株的F、HN基因的遗传变异进行研究,目的是从分子水平上了解我国NDV流行毒株与疫苗毒株的分子差异,探索新城疫疫苗免疫失败的原因;采用生物信息学工具对NDV分离株的F蛋白的结构与参考毒株进行了比较分析,目的为在核苷酸和氨基酸水平解释NDV分离株生物学特性的变异提供依据;克隆了NDV-F基因和鸡的IL-2基因,构建了鸡新城疫核酸疫苗质粒,旨在为预防NDV感染的辅助免疫提供理论基础和技术支持。研究内容如下:1.应用RT-PCR方法对6个NDV分离株(ZD、JZ、XB、CA、ZZ、CC)的F基因主要功能区片段进行了扩增,各扩增产物经克隆、测序后与GenBank登录的NDV参考毒株的F基因进行核苷酸及推导氨基酸序列分析。结果表明,6个NDV分离毒株间的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸同源性分别在99.6%~99.9%和99.1%~99.8%之间;分离毒株与参考毒株F基因核苷酸和F蛋白氨基酸序列同源性分别在83.2%~87.3%和90.2%~93.8%之间;F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的分子特征;其F基因的分子特性显示6个分离株均属基因Ⅶ型。研究结果提示,6个NDV分离株可能是同一毒株在传播过程中发生的不同变异株。NDV分离株与临床常用疫苗株的F基因同源性较低,在遗传进化上亲缘关系较远,这可能是疫苗免疫鸡群发病的重要原因之一。2.应用RT-PCR方法对6个NDV分离株的HN基因进行了扩增,各扩增产物经克隆、测序后与GenBank登录的NDV参考毒株的HN基因进行了核苷酸及推导氨基酸序列分析。结果表明,6个NDV分离毒株间的HN基因核苷酸和HN蛋白氨基酸同源性分别在98.7%~99.8%和98.1%~99.7%之间;分离毒株与参考毒株HN基因核苷酸HN蛋白氨基酸序列同源性分别在78.22%~85.3%和82.6%~90.0%之间;6个NDV分离株的HN蛋白均属于HN571亚型,分离株与常用疫苗株的HN基因同源性较低。5个NDV分离株中的HN蛋白在538~540aa缺失潜在糖基化位点。3.对NDV分离株ZD的F基因进行了序列测定,对其推导氨基酸序列与GenBank登录的NDV参考毒株的F蛋白序列进行了结构分析。ZD株的F基因的开放阅读框架编码553个氨基酸的F蛋白。二级结构分析后发现,ZD株的F蛋白的α螺旋中心、β-折叠、转角和无规则卷曲的分布与JS-2-06株最为接近,与常规疫苗株La Sota、Clone-30、B1和V4等毒株相比,在124-167aa的α螺旋中心分为两段,在377-386aa少一个β-折迭区域。对蛋白B细胞抗原表位、跨膜结构分析后发现,ZD株B细胞抗原表位4个参数共同区的分布与F48E9、Mukteswar和JS-2-06相似。而比La Sota、Clone-30、B1和V4株在110-117aa区段多一个共同区域。利用生物学软件对ZD株F0蛋白的叁维空间结构进行了预测。这为在核苷酸和氨基酸水平解释NDV分离株生物学特性的变异提供了研究线索。4.将NDV分离株的F基因成功地插入到pcDNA4/HisMax,构建了新城疫核酸疫苗质粒pcDNA4-F;将NDV的F基因和鸡IL-2基因串联插入pcDNA4/HisMax,构建了新城疫核酸疫苗质粒pcDNA4-F+IL-2,并进行了鸡的免疫试验。试验显示,构建的新城疫核酸疫苗质粒对NDV感染有一定的保护作用。这为新城疫的核酸疫苗研究提供了有用的资料。
李晓霞[7]2009年在《新城疫病毒气溶胶发生与传染机制及其在生产鸡舍环境中的监测》文中研究指明畜禽传染病如新城疫(Newcastle disease,ND)、禽流感(Avian Influenza,AI)、口蹄疫(Foot-and-Mouth disease,FMD)等疾病的病原都可以通过空气传播,造成传染病的流行。2002-2003年SARS和近几年来高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)的暴发流行,警示人们应重视病毒气溶胶及其气源性传染规律的研究。ND是危害最严重的家禽传染病之一,世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health, OIE)将其定为法定报告类疫病。然而,ND传播途径研究没能得到应有的重视。Gloster (1983)通过对两起ND爆发的分析,认为ND流行主要是由气载新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的;气源传播在新城疫流行中起着重要作用。这种传播方式在1970–1971年的英格兰ND爆发和1973年北爱尔兰ND流行中起了重要作用,并已经有证据证明NDV可发生远距离的传播。以上学者的观点尽管确认了ND的气源性传染途径,然而,NDV气溶胶的发生和传染机制不详,需要实验证明。因此,开展本研究。本课题建立了NDV气溶胶发生及传播感染的实验模型,动态检测了人工感染鸡NDV气溶胶排出的时间,浓度;验证NDV F48E9株可以通过气源传播感染健康鸡群。并进一步研究了感染NDV的鸡群排出的NDV气溶胶向周围环境扩散并感染10m、20m外的鸡群;对NDV气溶胶不同感染途径的感染剂量进行对比研究;在此基础上,收集生产鸡舍中的空气,对其中的NDV进行分子检测及分离鉴定,对气载NDV分离株的部分分子特性进行了研究;应用ERIC-PCR动态监测了感染NDV气溶胶SPF鸡肠道菌群的变化。本研究不仅对深入认识ND的传染机制非常必要,而且对揭示像SARs、禽流感等气源性传染病的传播机制带来有益的启示。1新城疫病毒气溶胶发生及其传染的实验研究本实验建立一个NDV气溶胶发生、传播及感染的实验模型,进行实验1(T1)和实验2(T2)。隔离器A中的SPF鸡(G1)点眼、滴鼻接种NDV后用AGI-30收集A中的气体,检测气体样品中的NDV,用蚀斑计数法测定NDV气溶胶浓度;隔离器B中的SPF鸡(G2)接受气源性被动感染。定期收集实验鸡的口咽和泄殖腔拭子,检测拭子中的NDV,确定排毒情况;每7天收集实验鸡血液样品,应用HI-T检测抗体。试验结果发现:T1和T2分别在攻毒后第二天和第叁天检测到NDV气溶胶,其浓度分别在第13天和第11天达到高峰,为1.69×104 PFU/m3空气和9.14×103 PFU/m3空气,到第40天NDV气溶胶浓度仍分别为6.98×103 PFU /m3空气和3.78×103 PFU/m3空气;T1G1和T2G1组鸡均在攻毒后第二天检测到排毒;T1G2组和T2G2组接受气源被动感染7天后检测分别有80%和60%的鸡排毒,抗体分别在感染后第7天和第14天呈阳性,为4.07和7.40,一直到第四十天均为阳性。结果表明SPF鸡在感染NDV后叁天内排出NDV,并能够很快形成气溶胶;NDV气溶胶能够感染健康鸡只。2新城疫病毒气溶胶向周围环境扩散感染的实验研究共进行两组实验,一组是新城疫病毒气溶胶向周围环境扩散的实验研究;一组是10m,20m气源传播感染实验。扩散试验时设一组SPF鸡经点眼、滴鼻接种NDV后用AGI - 30收集接种鸡处(S0)距离接种感染鸡10m (S10)、20m(S20)处中的气体,检测并定量气体样品中的NDV,揭示动物舍NDV气溶胶向周围环境的传播情形。结果表明,S0处气体样品中从接种后第3天开始检测到NDV,浓度在11天达到高峰,一直到第30天RT-PCR检测结果仍为阳性;S10处及S20处气体样品中均从接种后第5天开始检测到NDV,浓度在11-13天达到最大值,一直到第25天RT-PCR检测结果仍为阳性。感染试验时设叁组试验鸡,分别为人工接种鸡(G0),点眼、滴鼻接种NDV,在距离接种鸡10m (G10)、20m (G20)处SPF鸡接受气源感染的哨兵组鸡,通过检测哨兵组鸡的排毒及抗体来确定是否发生气源感染,具体检测方法同试验一。气源扩散感染试验结果表明G10及G20持续气源被动感染7后开始检测,均检测到排毒直到第28天仍然排毒。结果表明SPF鸡在感染NDV后叁天内排出NDV,并能够很快形成气溶胶,传播扩散到20m;NDV气溶胶能够感染10m、20m处健康鸡只。3 SPF鸡经不同途径的感染剂量及致死剂量实验研究本实验分别通过呼吸道(通过人工发生定量NDV气溶胶感染SPF鸡)、消化道(喂服)及肌肉注射途径定量感染NDV,通过检测鸡的特异性抗体判定鸡是否发生感染,ID50、LD50计算方法采用的加权直线回归法(Bliss法)。结果表明NDV气溶胶半数感染吸入剂量为30.53 PFU,95%置信区间为9.46 - 98.54 (PFU);半数致死剂量为117.05 PFU,95%置信区间为23.71 - 577.92 PFU。NDV通过消化道半数感染灌服剂量为4419.78 PFU,95%置信区间为1095.34 -17834.14 (PFU);半数致死剂量为44743.91PFU,95%置信区间为10161.62 - 197017.62 (PFU)。NDV经肌肉注射途径半数感染注射剂量为16.63 PFU,95%置信区间为4.85 - 57.00 (PFU);半数致死剂量为69.60 PFU,95%置信区间为14.24 - 340.27 (PFU)。结果表明不同感染途径的致病性有差异,肌肉注射致病性最强,气溶胶次之,消化道最弱。4鸡舍中气载鸡新城疫病毒的检测及分离鉴定本研究采用AGI-30气体收集器在五个大型鸡舍舍内收集气体(15份/舍),同时采集鸡的气管和泄殖腔拭子,采用兼并引物RT-PCR检测气体样品和拭子中的新城疫病毒(NDV),并鉴别NDV的毒力;同时分离、纯化气体样品中的NDV,用常规毒力学实验鉴别分离株的毒力。结果五个鸡舍中,在鸡舍A中,2份气体样品和4份口咽及泄殖腔拭子中检测到弱毒,均没检测到强毒。在鸡舍B中,7份气体样品和5份口咽及泄殖腔拭子中检测到弱毒,而仅在5份气体样品中检测到强毒;在鸡舍C中,6份气体样品和5份口咽及泄殖腔拭子中检测到弱毒,而仅在2份气体样品中检测到强毒;在鸡舍E中,7份气体样品和1份口咽及泄殖腔拭子中检测到弱毒,而在所有样品中均未检测到强毒。分离纯化后总共得到7株NDV,其中3株为强毒,4株为弱毒。在鸡舍A中得到一株弱毒YTCX08,在鸡舍B中得到一株强毒DZ07和一株弱毒DZ0702,在鸡舍C中得到2株强毒MH07和MH0702和1株弱毒MH0703,在鸡舍E中得到一株弱毒NY06。结果表明兼并引物RT-PCR可快速、直接对气体样品进行检测及鉴别诊断,有助于ND的防治。5气载新城疫病毒野毒株F基因重要片段的克隆及遗传变异分析根据已发表文献针对新城疫病毒(NDV) F基因序列设计了1对引物,对从气体中分离的7株NDV毒株的F基因重要功能区片段扩增进行了扩增和序列测定,并与多株已报道的NDV参考株相应片段进行序列比较,经遗传基因进行化树分析。结果表明,七株气载新城疫病毒分离株之间的同源性为79.3% - 100%;氨基酸的同源性为77.4% - 100%,分离到的四株野毒NY06、MH0703、YTCX08与DZ0702均属于基因II型,在裂解位点的氨基酸序列(111GGRQGRL117)与NDV弱毒株特征相符合;MH07属于基因IX型;DZ07、MH0702均属于基因VII型,这叁株在裂解位点的氨基酸序列( 111GRRQK RF117 )与NDV强毒株特征相符合。6新城疫病毒气溶胶感染SPF鸡肠道菌群结构变化的研究SPF鸡定量感染NDV气溶胶后,定期采集试验鸡的粪便,检测其中大肠杆菌的浓度变化,同时应用ERIC-PCR对肠道菌群结构进行了动态检测;同时对健康鸡进行同样研究作对比。结果表明,通过与对照组肠道大肠杆菌的检测比较,结果大肠杆菌在感染初期高于对照组(P<0.01),而严重感染开始出现死亡时开始降低,明显低于对照组(P<0.01),恢复期大肠杆菌总数开始回升,与对照组差异不显着(P>0.05)。ERIC-PCR结果比较发现NDV气溶胶感染组鸡只与同日龄对照组鸡肠道菌群的图谱间有一定的差异。在大多数鸡群出现临床症状(2-10天)菌群结构也发生了改变,在恢复期(10-15天)菌群重新建立,并有一个重新选择的过程,到完全恢复后菌群结构基本稳定。结果表明感染NDV气溶胶后鸡群肠道菌群发生了改变,采用ERCI-PCR指纹图谱技术可以动态监测动物肠道菌群结构变化。
艾尼瓦尔.苏甫尔[8]2011年在《新城疫病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立》文中认为新城疫(Newcastle disease)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus)引起的鸡和多种禽类的急性,高度接触性传染病。世界卫生组织将其为A类动物疫病,该病危害世界养禽业最严重的传染病之一,由于其传播速度快,给养禽业带来了巨大的经济损失,尤其是养鸡业,因此,预防、控制该病是我国目前以及今后相当长的一段时间内面临的一项艰巨任务,因此对于新城疫病毒诊断试剂合的研究具有重要的意义。为了建立新城疫病毒检测方法,我们首先要制备抗新城疫病毒单克隆抗体。本研究首先把NDV超离纯化的全病毒抗原免疫6—8周龄BALB/c雌性小鼠,基础免疫和加强免疫之后,采血测定抗体滴度。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞在50%PEG作用下融合。分别用全病毒包被ELISA方法,血凝抑制试验(HI)和间接免疫荧光法(IFA)筛选阳性细胞,阳性细胞经有限稀释法反复克隆培养,最后获得5株NDV特异性单克隆抗体,分别为1F10、2H3、4E4、5B11、5E9。接着向BALB/c小鼠腹腔接种阳性杂交瘤细胞,1周后采腹水,离心取上清液,各株McAb腹水效价测定显示,NDV特异性McAb效价都符合双抗体夹心ELISA检测方法的建立,此5株单抗都没有血凝抑制效价。这五株杂交瘤细胞分泌的抗体均有良好的热稳定性。腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后,蛋白含量为2.65mg/mL—3.71mg/mL之间。特异性试验结果表明,5株McAb中,两株McAb与禽流感病毒(AIV),甲型流感病毒,鸡马立克氏病(MDV)、网状内皮组织增殖症病毒(REV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)以及鸡产蛋下降综合征(EDS—76)均无交叉反应,此结果表明所得的两株单抗是针对NDV特异性单抗。此2株单克隆抗体的获得为新城疫病毒快速检测奠定了基础。本研究在研制出新城疫病毒特异性单克隆抗体的基础上,以单抗2H3作为包被抗体,4E4-辣根过氧化物酶标记(4E4-HRP)作为检测抗体的配对,建立了检测特异性新城疫病毒的双抗体夹心ELISA方法。通过对各步反应条件进行优化,最终获得的最佳工作条件为：单克隆抗体为1：1600倍稀释,HRP酶标记抗体为1:320倍稀释,包被抗体最佳反应条件为4℃过夜,HRP酶标抗体的最佳工作条件为37℃,45min。用建立的双抗体夹心ELISA方法对以知的REV、IBDV、RBV、IBV、EDS—76及AIV等禽类病毒进行了交叉反应性试验,此试验结果表明无交叉反应性。本方法特异性强,灵敏度高,可以用于NDV的快速检测及鉴别诊断。
王建忠[9]2015年在《基于CMV启动子NDV基因Ⅶ型NA-1株活载体构建及免疫特性评价》文中进行了进一步梳理新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）也被称为禽副黏病毒1型（avianparamyxovirus serotype-1，APMV-1)，广泛分布于世界各地，严重危害全球家禽养殖业健康发展。NDV只有单一血清型，但存在多种基因型，当前NDV在世界范围内呈现以class II中基因VII型为主，其他基因型散发的流行态势。然而在NDV的免疫预防上，半个多世纪以来国内外一直沿用经典基因II型弱毒疫苗株，由于基因型与抗原性的不匹配，当前广泛应用的弱毒疫苗株不能完全阻止病毒感染，并且受到强毒攻击后排毒现象严重，即使在免疫家禽群体中依然有强毒株不断被分离的报道。反向遗传操作技术的发展，尤其是理想的病毒拯救系统，为深入研究NDV结构与功能关系、致病机制提供了有力工具，为研发与流行毒株相一致的基因VII型NDV弱毒疫苗候选株及候选疫苗载体提供了新的思路。本研究以鹅源基因VII型NDV NA-1株为研究对象，建立以CMV为启动子利用真核细胞广泛存在的RNA聚合酶Ⅱ的反向遗传操作系统，该系统不依赖传统T7RNA聚合酶，操作简便高效。在此基础上，将NDV NA-1株F蛋白裂解序列从强毒株特征基序突变为弱毒特征基序，从而获得基因VII型NDV致弱疫苗候选株及候选载体rmNA-1。为探索重组NDV表达两个甚至多个外源蛋白的可能性，本研究以红色荧光蛋白基因和绿色荧光蛋白基因为报告基因，构建同时表达双外源基因重组新城疫病毒rmNA-mCh-GFP，结果表明以NDV为载体具有构建重组多联、多价疫苗或开发可携带多种免疫分子的肿瘤治疗载体的潜力；以此鹅源NDV致弱株为活病毒载体，构建表达鹅细小病毒VP3保护性抗原蛋白重组新城疫病毒rmNA-VP3，并对其生物学特性及雏鹅免疫特性进行了评价，主要内容如下：I．基于CMV启动子NDV NA-1株反向遗传操作系统的建立根据本实验室分离并保存的鹅源基因VII型NDV NA-1株基因组序列，将全基因组分为7个末端部分重迭的基因片段进行分段克隆，利用邻近片段重迭部分的限制性酶切位点通过体外拼接组装成完整基因组cDNA，并分别在5’端和3’端引入锤头状核酶（HamRz）序列和丁型肝炎病毒核酶（HdvRz）序列，以产生精确的病毒基因3’末端和5’末端，克隆于真核表达质粒pCI-neo中CMV启动子的下游，构成NDV NA-1全基因组cDNA克隆pCI-NA-1。同时分别将NP、P和L基因ORF，克隆至真核表达载体pcDNA3.1中CMV启动子的下游，构成叁个辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L。共转染全长质粒pCI-NA-1与叁个辅助质粒于BHK-21细胞拯救获得具有感染性的子代病毒。同时以eGFP为报告基因，构建了表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒，为今后制备新型基因VII型新城疫病毒活载体研发双价或多价疫苗奠定了基础。II．鹅源基因VII型新城疫病毒NA-1致弱株的构建为构建与当前流行毒株基因型抗原性相匹配的基因VII型新城疫病毒弱毒疫苗候选株及疫苗载体，在已建立的NDV NA-1株简便高效的反向遗传操作系统基础上，将NDV NA-1株天然典型强毒株特征的F蛋白裂解位点112RRQKR↓F117替换为弱毒疫苗株LaSota F裂解位点相应基序112GRQGR↓L117，拯救获得突变修饰株rmNA-1，致病性分析结果显示突变株rmNA-1致病力显着降低，致病类型从强毒株变为弱毒株，成功实现对病毒的致弱，而且突变致弱株rmNA-1具有和亲本株rNA-1相似的生长动力学曲线，并且连续传代10次，突变碱基仍然具有稳定性，不发生回复突变或其他突变，为制备新型基因VII型新城疫病毒弱毒疫苗候选株及候选载体奠定了基础。III.表达双荧光蛋白重组新城疫病毒的构建及其生物学特性评价为探索重组NDV表达两个外源保护性抗原蛋白构建重组多联或多价疫苗或研制可携带多种免疫分子的肿瘤靶向性治疗制剂的可能性，本研究以绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白mCherry为外源蛋白，将两者编码序列以内部核糖体进入位点（IRES）相连构成单独转录单位，插入到新城疫病毒基因组中，构建同时表达双荧光蛋白重组新城疫病毒rmNA-mCh-GFP，红色荧光蛋白mCherry和绿色荧光蛋白GFP在重组病毒感染细胞同时获得了正确表达，且不影响病毒其他蛋白的表达。表达双荧光蛋白重组病毒rmNA-mCh-GFP具有与母本株rmNA-1相似的体外生长曲线，尽管在最高生长滴度上与母本株相差约25倍，但rmNA-mCh-GFP仍具有较高的生长滴度。表明重组NDV具有同时表达两个甚至多个外源蛋白的潜力。VI.表达GPV VP3蛋白重组新城疫病毒的构建及其免疫原性分析克隆鹅细小病毒VP3基因ORF构成完整NDV基因表达盒，插入上述NDV突变致弱株rmNA-1基因组P和M之间，构成表达鹅细小病毒VP3蛋白重组新城疫病毒rmNA-VP3。通过免疫荧光染色、Western blot检测证实外源蛋白VP3可获得正确有效的表达，与母本株rmNA-1相比，rmNA-VP3拥有更低的致病力，并保持母本株良好的遗传稳定性，将rmNA-VP3分别在鸡胚中连续传代10次，外源基因VP3稳定遗传且F裂解位点修饰碱基仍然具有稳定性，不发生回复突变或其他突变。在鸡胚生长特性上，重组病毒rmNA-VP3具有与rmNA-1及野生型rNA-1相似的生长趋势，但由于外源基因的插入病毒滴度达到高峰的时间略晚，滴度峰值低于母本毒约20倍左右，以此表达鹅细小病毒VP3蛋白重组新城疫病毒免疫雏鹅显示出良好的免疫原性，整个免疫观察期无疫苗相关临床症状出现，且可同时诱导产生坚实的鹅细小病毒和新城疫病毒中和抗体，表明重组病毒rmNA-VP3具有免疫预防鹅细小病毒和新城疫病毒感染的潜力，同时，rmNA-1可作为病毒活载体表达外源蛋白而不影响其本身免疫原性。
蔡丽娅[10]2009年在《临床新城疫病毒分离鉴定及F蛋白单克隆抗体的研制与应用》文中研究指明新城疫(Newcastle disease, ND)是威胁养禽业发展的一种重要传染病,给养禽业造成巨大经济损失,OIE将其与高致病性禽流感一起列为危害养禽业必须报告的疫病,该病在我国时有发生。自1997年以来,新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)不仅感染鸡,而且还感染鹅。虽然各地采取了积极的防治措施,但该病仍然蔓延、流行。有不少学者对此进行了研究,但有关病原的生物学特性及流行病学等方面仍存在很多疑问。本研究从临床采集30例疑似新城疫病死鸡脑、肝等组织和从自然保护区采集3例野鸭棉拭子,通过SPF鸡胚接种分离病毒,并对分离获得的病毒进行了鉴定。结果表明,分离获得的19株病毒有血凝性,经HA、HI以及IFA试验验证,其中18株为NDV。应用RT-PCR方法对分离株NDV的融合蛋白F基因和血凝素神经氨酸酶HN基因进行扩增,序列分析结果表明,分离株DTC-050508和叁株野鸭源NDV在第112、115位是碱性氨基酸,第117位是F(Phe)具有NDV强毒的特征,DTC-050408在第112、115位是中性氨基酸,第117位是L (Leu)具有NDV弱毒的特征。进一步分析表明,野鸭源NDV与鹅源NDV在基因序列有很高的同源性。对野鸭源NDV分离株JS0601／wd的全基因组进行了序列分析,结果表明,该病毒全基因组长15192bp,与GenBank上已发表的ZJ1、NA-1、SF02、IT-227、ITdove等毒株基因组全长相同,各编码蛋白基因位置基本一致,说明NDV病毒基因组结构在不同宿主遗传进化上具有保守性。JS0601／wd基因组编码的NP、P、M、F、HN和L蛋白的长度与分离株ZJ1、NA-1、SF02等完全一致,与我国近年来流行于鹅的NDV同源性高达97%以上,说明他们可能有相同的来源和遗传进化关系,为我国NDV流行病学研究和控制提供了重要资料。在用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统成功表达了NDV标准强毒株F48E8株F基因的基础上,利用表达的重组蛋白免疫小鼠,通过间接免疫荧光筛选杂交瘤细胞,结果获得了12株抗NDV F蛋白单克隆抗体,分别命名为1B4、4B11、5F3、4C1、2H10、6F8、4H10、1D10、2F12、4D9、5C6、6C4。血凝和血凝抑制试验表明,所有单抗均无血凝抑制特性；中和试验结果证明,单抗4D9具有很好的中和能力,6C4、2F12有一定程度的中和效价,其他单抗没有明显的中和作用；尽管在IFA试验中,不同单抗与不同动物来源的NDV表现出不同的免疫反应性和反应谱,但在Western blot试验中,所有单抗均能识别不同来源NDV的F蛋白,这些单抗为NDV的深入研究提供了高质量试剂材料。为了解决临床上ND的快速诊断问题,本研究以研制的单抗为核心试剂,建立了间接免疫荧光技术快速检测NDV的方法。研究结果表明,该方法特异性强,与试验的其他病毒如传染性法氏囊病毒、马立克氏病毒及小鹅瘟病毒等均不出现交叉反应,仅与NDV感染的CEF反应,该方法可以在18h检测出NDV,显示出很好的应用前景,为ND防控创造了新方法。
参考文献：
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[2]. 新城疫病毒单克隆抗体的建立及其遗传变异分析研究[D]. 曲鲁江. 新疆农业大学. 2001
[3]. 单抗夹心ELISA检测鸡新城疫病毒抗原的研究[D]. 薛松果. 安徽农业大学. 2004
[4]. 鸭新城疫病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及应用[D]. 程彦丽. 山东农业大学. 2012
[5]. 新城疫分离株P和HN基因分子进化与致病性的相关研究[D]. 梁俊文. 山东师范大学. 2010
[6]. NDV分离株F及HN基因的遗传变异分析与核酸疫苗质粒的构建[D]. 王学艳. 西北农林科技大学. 2008
[7]. 新城疫病毒气溶胶发生与传染机制及其在生产鸡舍环境中的监测[D]. 李晓霞. 山东农业大学. 2009
[8]. 新城疫病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立[D]. 艾尼瓦尔.苏甫尔. 华中农业大学. 2011
[9]. 基于CMV启动子NDV基因Ⅶ型NA-1株活载体构建及免疫特性评价[D]. 王建忠. 吉林大学. 2015
[10]. 临床新城疫病毒分离鉴定及F蛋白单克隆抗体的研制与应用[D]. 蔡丽娅. 扬州大学. 2009
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