奚茜[1]2012年在《食品中链霉素残留快速检测技术研究》文中研究说明链霉素（Streptomycin，SM）具有性质稳定、抗菌谱广、生产工艺简单、疗效好等特点，尤其对结核分枝杆菌有强大抗菌作用，是一种广泛应用于动物疾病治疗、预防的氨基糖苷类抗生素。但链霉素具有严重的耳毒性和肾毒性，它在动物源性食品中的残留已引起国内外的普遍关注。开发快速、准确、经济的检测链霉素类抗生素残留的方法在生产和生活中具有重要意义。本文采取当前普遍应用的免疫检测法——酶联免疫检测法（ELISA）和一种新型的检测方法——基于核酸适配子快速检测法，对食品中链霉素残留检测技术进行研究，本研究获得以下结果：1. SM人工抗原的制备与鉴定：采用碳二亚胺法（EDC）和戊二醛法（GA）将分别与牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）偶联，制得免疫抗原（SM-cBSA）和包被抗原（SM-OVA）。经紫外扫描和SDS-PAGE电泳鉴定，SM成功偶联到蛋白质载体上，偶联比分别为7.6:1和17.7:1。2. SM多克隆抗体和单克隆抗体的制备与鉴定：将SM-cBSA分别免疫新西兰大白兔6只和Balb/C小鼠3只，用间接ELISA和间接竞争ELISA测定抗血清效价和半数抑制浓度，并在小鼠多抗的基础上筛选最佳融合小鼠，制备单克隆抗体。经8次免疫新西兰大白兔，获得了兔多抗（rSM pAb），经鉴定，其效价可达为1:8000，阻断ELISA测定半数抑制浓度（IC50）为3.32ng/mL，与链霉素和双氢链霉素的交叉反应率分别为100%与120.78%，与其它化合物的交叉反应率（CR%）＜0.1%。经5次免疫Balb/C小鼠，获得效价可达1:80000，IC50为3.44ng/mL的鼠多抗（mSM pAb）；根据间接ELISA结果，选择2号小鼠细胞做细胞融合，筛得一株敏感特异的杂交瘤细胞1G1-E3，用体内诱生腹水法制备鼠单抗（mSM mAb）；经间接ELISA鉴定，细胞培养上清和腹水的效价分别为1:1280和1:1×106，阻断ELISA测定其IC50为2.91ng/mL，与其他化合物的CR%均＜0.01%。本实验制备多抗和单抗均可用于SM残留检测的免疫学试验，但mSM mAb的性能更好。3.应用mSM mAb研制SM残留快速检测阻断ELISA试剂盒（SM-Kit）。SM-Kit的标准曲线呈S型，线性检测范围为0.5~40.5ng/mL，IC50为3.60ng/mL；牛奶、蜂蜜样品的平均添加回收率均在80%~120%之间；批内和批间变异系数均小于15%；除与双氢链霉素有交叉反应，与其他化合物的交叉反应率均小于0.01%，不同生物基质对SM-Kit的检测结果影响小；稳定性试验表明SM-Kit在4℃可保存6个月以上。4.建立了基于两种基于适配子的SM残留快速检测方案，两种方案的检测IC50分别为160.83ng/mL和168.16ng/mL，初步证明方案的可行性，并为进一步研究奠定良好基础。
王谦[2]2003年在《抗链霉素单克隆抗体制备与ELISA方法的建立》文中指出为探索一种能快速而有效监测食品中链霉素残留的方法，本研究利用合成的链霉素-肟与牛血清白蛋白偶联，制备成全抗原后免疫Balb／c小鼠，用杂交瘤技术建立了一株能稳定分泌抗链霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3B_1-G_(12)-C_(12)，并对此细胞进行了鉴定和抗体应用的初步研究。 3B_1-G_(12)-C_(12)抗体的鉴定结果为：抗体属IgG_1亚类；与双氢链霉素的交叉反应率为120％，与庆大霉素、卡那霉素、新霉素的交叉反应均小于0.1％。间接酶联免疫吸附试验测定细胞上清抗体效价为1∶10~4以上，腹水抗体效价为1∶10~8以上。秋水仙素阻抑法计算该细胞染色体数平均为96，体外传代培养和冻存复苏后分泌抗体稳定。 以3B_1-G_(12)-C_(12)单抗为基础，建立了间接竞争性抑制ELISA方法，该方法对硫酸链霉素的最低检出量为2ng／ml，尿及牛奶添加回收率为90％～105％。 与其它方法综合对照最低检出量、效率、精确度、费用等参数可得出用ELISA检测链霉素残留是一种高效、快捷、可靠的方法，可大力推广应用。
唐娜[3]2006年在《牛乳中链霉素残留检测ELISA试剂盒的研制》文中认为氨基糖苷类抗生素是一类应用广泛的广谱抗菌药物,主要包括链霉素(SM)、庆大霉素(GM)、卡那霉素(KM)等,对奶牛乳房炎、子宫内膜炎等有很好的疗效,常用作兽医临床治疗及饲料药物添加剂。然而不规范用药会引起畜禽产品尤其是泌乳动物乳汁中的药物残留,对人类的健康构成潜在危害。国内外已经建立了多种检测牛奶中链霉素残留的理化检测方法,虽然有些方法比较灵敏、精确,但由于方法复杂、耗时长、花费大、技术要求高等原因而不适合大批量样品的筛选。作为一种灵敏、快速、特异性强的方法,酶联免疫吸附测定法正逐渐应用于药物的残留检测。为探索一种能够快速有效的检测牛奶中链霉素残留的方法,本研究采用单克隆抗体技术和酶联免疫吸附测定等技术,合成人工抗原,制备出抗链霉素单克隆抗体,建立了检测牛奶中SM残留的ELISA测定法,组建成链霉素快速检测试剂盒并进行了优化和实际应用。分别采用CMO法、活化酯法、戊二醛法合成了链霉素的5种人工抗原,从免疫原性及稳定性等方面对5种抗原进行比较,最终选择活化酯法合成的BSA-SM/b作为免疫抗原,通过杂交瘤技术获得1株能稳定分泌抗链霉素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株5C10。制备的腹水效价为1: 1280000,蛋白浓度为26.2mg/ml,与其他抗菌药物的交叉反应率均低于0.1%。利用5C10杂交瘤细胞株的小鼠腹水单抗建立了检测SM残留的间接竞争ELISA方法。采用包被抗原稀释度1:3200,腹水抗体的工作浓度1:1.6×10~5,标准曲线线性方程为y=1.0522-0.3276x(10～1000ng/ml),半数抑制浓度为93.22ng/ml,检测限约为5ng/ml。标准曲线的批内变异系数为11.87%,平均批间变异系数为8.017%。初步组装试剂盒并对试剂盒的各组分的稳定性进行了检测和优化,成功建立了能在6个月内维持稳定的试剂盒,并以所组建的试剂盒对牛奶样品中的添加药物进行了测定。通过实验比较了5种样品处理方法,建立ELISA标准曲线的线性方程为y=1.8061-0.4932x(线性范围25～2500ng/ml),其LOD为8.11 ng/ml,低于规定的牛奶中链霉素最低残留限量200ng/ml。对患乳房炎奶牛进行链霉素肌肉注射和乳房给药治疗,采用本试剂盒测定牛奶中的链霉素残留浓度,证实用药后牛奶的废弃期分别为至少2d和4.5d。
杜付彬[4]2007年在《培氟沙星单克隆抗体制备及其在ELISA中的应用》文中提出本实验利用EDC法将培氟沙星与牛血清白蛋白和卵清白蛋白进行偶联,成功制备了人工免疫抗原和包被抗原。采取细胞融合技术,将免疫后血清效价达到1∶4000以上的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,进而筛选克隆,共获得能稳定分泌抗PEF的单克隆抗体杂交瘤细胞株5株,分别为2D7、2E10、2G6、2E5和1D7。对单抗的效价、亲和力、特异性等进行了分析,选择单抗2D7用于建立培氟沙星的间接竞争ELISA检测方法。对间接竞争ELISA检测方法进行优化后,建立了标准曲线,其标准曲线的回归方程是y=-17.873x+71.248,相关系数为R2=0.9984,最低检测限0.38ng/ml,检测范围为0.38ng/ml～2000ng/ml。分别取鸡的肌肉和肝脏添加标准培氟沙星后进行了检测,同时利用高效液相色谱法对所建立的间接竞争ELISA法进行了验证分析和确认。间接竞争ELISA法检测鸡肉和鸡肝脏中的PEF,其平均回收率为分别为80.39%和83.80%,批内变异系数分别为2.53%,6.30%。
范国英[5]2007年在《链霉素残留免疫学快速检测技术研究》文中研究说明链霉素(streptomycin,SM)是一种常用抗生素类药,是动物源性食品中常见的残留药品之一,尤其在牛奶中的残留日益引起人们的关注。免疫学分析技术以其敏感、特异、简便等优点已被广泛应用于药物残留检测领域。本研究对SM的免疫原性,人工抗原的合成、多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb)制备及其特性、试剂盒研制及其性能、免疫金标试纸的研制及其性能、液-质联用(LC-MS)的确证等进行了研究。主要研究结果如下:1.链霉素经氧-羧甲基羟胺肟化处理后引入羧基,采用EDC一步法分别合成免疫原BSA-EDC-SM和包被抗原OVA-EDC-SM;用戊二醛法和1,4-丁二醇缩水甘油醚分别合成BSA-GA-SM和BSA-di-SM;采用SDS-PAGE凝胶电泳和紫外扫描测定BSA-EDC-SM、BSA-GA-SM和BSA-di-SM的BSA与SM的分子结合比分别为1∶23、1∶15和1∶10。用叁种免疫原免疫Balb/C小鼠,获得了高价、敏感和特异的抗血清。BSA-EDC-SM免疫组中1#小鼠的多克隆抗体对SM的IC50为45.8μg/mL,对双氢链霉素(DHSM)的交叉反应为90.6%,与其他氨基糖苷类药物或抗生素药物的交叉反应均小于0.001%。BSA-di-SM和BSA-GA-SM免疫组的多克隆抗体对DHSM、其他氨基糖苷类药物或抗生素类药物的交叉反应均小于0.001%。2.用不同剂量BSA-EDC-SM和不同间隔时间免疫6只新西兰白兔,制备SM多克隆抗体;其中低剂量长间隔组的Ⅱ-1#号兔的抗体灵敏度最好,其标准曲线呈S型,符合4参数Logit曲线拟合,半数抑制浓度(IC50)为5.81μg/L。用BSA-EDC-SM免疫Balb/c小鼠,应用细胞融合技术,筛选出F139-3A9-C4株杂交瘤细胞,用体内诱生腹水法制备腹水SMmAb。间接ELISA法测定杂交瘤细胞培养液上清和腹水的效价分别为1∶320和1∶512000,腹水抗体亲和力常数Ka为7.5×1010 L/mol。杂交瘤细胞染色体数目为96~102条,平均98.6条,同种型为IgG2a/κ;腹水中SM mAb的标准曲线呈S型,符合4参数Logit曲线拟合,IC50为8.99μg/L,与DHSM的交叉反应为93.6%,与其他氨基糖苷类药物或抗生素类药物均无交叉反应。3.用SM mAb研制SM残留检测阻断和竞争ELISA试剂盒(ELISA-kit),其中竞争ELISA-kit的质量性能优于阻断ELISA-kit。竞争ELISA-kit的标准曲线呈S型,IC50为6.22μg/L,线性检测范围为1.0~256.0μg/L,灵敏度为0.52μg/L;奶样和尿样的添加回收率分别为83.2%和86.89%,平均批内和批间变异系数均小于15%;与DHSM的交叉反应为82.71%,与其它氨基糖苷类药物或抗生素类药物的交叉反应均小于0.001%;不同生物基质对该试剂盒的敏感性和检测结果影响不大。4.依据胶体金免疫层析技术研制SM和DHSM的多残留快速检测免疫金标试纸(SM-Strip),胶体金颗粒最佳粒径为25±1.0nm,金标记SM mAb的最佳标记浓度为13.75μg/mL。SM-Strip的标准曲线呈S型,机读灵敏度为0.42μg/L。目测灵敏度为4.14μg/L。目测结果与DHSM的交叉反应为4.0μg/L,与其他氨基糖苷类药物或抗生素类药物无交叉反应。5.建立了猪尿液和牛奶中的SM残留检测的LC-MS法,并以该方法确证了竞争ELISA-kit和SM-Strip的敏感性、特异性和稳定性,参比分析法结果表明,SM-Kit和SM-Strip与LC-MS具有较好的相关性,符合率为100%。ELISA-kit和SM-Strip均具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合于SM残留快速检测的推广应用。
倪同浩[6]2009年在《链霉素胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制》文中指出链霉素(SM)是一种氨基糖甙类抗生素,在医学上由于其存在严重的耳及肾毒性,已被其它新药所取代。但在畜禽疾病防治方面,该药对奶牛乳房炎、子宫内膜炎、鸡传染性鼻炎等有很好的疗效,仍是常用药物之一。但由于不规范用药常会引起畜禽产品中的超标残留,对人类的健康构成潜在危害。为探索并建立一种能够快速有效地检测链霉素残留的方法,本研究采用单克隆抗体技术和胶体金免疫层析技术,合成并制备了人工抗原、抗链霉素单克隆抗体和胶体金,采用竞争法建立了检测SM残留的GICA方法,成功研制了链霉素胶体金免疫层析试纸条,试纸条灵敏度、特异性、稳定性等均达到检测要求。本研究将杂交瘤细胞株5C10接种到小鼠体内,采用体内诱生腹水法制备了含抗链霉素单抗的腹水。腹水经辛酸-硫酸铵法纯化后用全抗原对单抗进行质量鉴定,单抗蛋白质浓度为4mg/mL,抗体效价为1?1.6×105, IC50为102.28ng/ml。单抗特异性较好。采用柠檬酸叁钠还原法制备胶体金,胶体金标记抗体经纯化后吸附在玻璃纤维素膜上;将Str-OVA(检测线)和羊抗鼠IgG(质控线)分别包被在硝酸纤维素膜上。分别经过处理干燥后与样品垫、吸水纸组装成试纸条。本实验选用直径18nm左右的胶体金标记的单抗作为检测试剂,单抗加入量15μg/mL,采用进口Ahlstrom8964玻璃纤维膜作为金吸附材料,Millipore135硝酸纤维素膜作为层析材料制成试纸条。本研究对链霉素胶体金免疫层析试纸条的各项指标进行优化,并确定了最佳条件,成功建立胶体金免疫层析检测链霉素残留的方法。使用试纸条对SM标准液检测,检测限为100ng/ml。试纸条对对新霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、恩诺沙星、氨苄青霉素、磺胺喹恶啉无交叉反应。初步建立了牛奶、奶粉、蜂蜜等样本的样品处理方法,并用ELISA方法和试纸条进行验证。结果表明试纸条能够基本满足检测要求。试纸条最大的优点是无需借助检测仪器,检测所需试剂已包被在试纸条上,检测快速、简便,10min内可出检测结果,适用于对链霉素残留进行现场检测。本研究也为其他兽药残留检测试纸条的研制提供了借鉴。
穆国冬[7]2007年在《盐酸沙拉沙星单克隆抗体的制备及其在ELISA中的应用》文中研究表明本实验将沙拉沙星与牛血清白蛋白用EDC法进行偶联,成功地制备了免疫抗原并免疫BALB/c小鼠。同时利用沙拉沙星与卵清蛋白偶联制备的包被抗原进行筛选,采取杂交瘤建株技术,共获得2株能稳定分泌抗沙拉沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株3B8和4H8。在对所获单克隆抗体的效价、亲和力、特异性等进行细致分析的基础上,选择4H8腹水用于建立沙拉沙星的间接竞争ELISA检测方法。利用优化后的实验条件进行间接竞争ELISA检测并建立标准曲线,标准曲线的回归方程为y = -24.566x + 94.216,相关系数R2=0.9979,最低检测限为1.55ng/ml。分别取鸡心、鸡肉和鸡肝组织添加标准沙拉沙星后应用新建立的ELISA方法进行检测,其平均回收率分别为84.52%、83.9%和82.62%。
于海峰[8]2007年在《氧氟沙星单克隆抗体制备及ELISA方法的建立》文中研究指明本实验将氧氟沙星与牛血清白蛋白用EDC法进行偶联,成功地制备了免疫抗原并免疫BalB/c小鼠。同时利用氧氟沙星与卵清蛋白偶联制备的包被抗原进行筛选,采取杂交瘤建株技术,共获得7株能稳定分泌抗氧氟沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E8、2A3、2F10、2H3、3D8、3G7、和4F4。在对所获单克隆抗体的效价、亲和力、特异性等进行了细致分析的基础上,选择了4F4腹水用于建立氧氟沙星的间接竞争ELISA检测方法。利用优化后的实验条件进行间接竞争ELISA检测并建立标准曲线,标准曲线的回归方程为y= -3.1968x + 3.7028,相关系数R2=0.9958,最低检测限1.43ng/mL,线性检测范围1.43~4000ng/mL。分别取鸡的肌肉和肝脏组织添加标准氧氟沙星后进行检测,其平均回收率分别为87.0%和107.87%。
高纪振[9]2009年在《抗CD58蛋白单克隆抗体的制备及鉴定》文中研究表明CD58又名淋巴细胞功能相关抗原-3(LAF-3),在机体免疫中发挥重要作用,对动物妊娠早期子宫局部细胞因子网络的调节也存在着影响。本试验利用酶消化法结合柱层析法制备了绵羊红细胞表面活性蛋白CD58;通过小鼠免疫,细胞融合以及有限稀释法筛选阳性克隆,制备了抗CD58蛋白单克隆抗体,并进行了鉴定;建立了检测山羊血清中CD58的间接竞争抑制性ELISA方法,检测了未发情,发情和怀孕山羊血清中CD58的含量。获得以下结果:1.酶消化法结合柱层析法制备了绵羊红细胞表面活性蛋白CD58,SDS-PAGE结果表明制备了高纯度的CD58蛋白。玫瑰花环抑制试验检测结果抑制率为64.68±3.93%。2.建立了抗CD58蛋白抗体测定的间接ELISA方法。方阵滴定法确定包被原最适工作浓度为10.0μg/mL,最佳的包被温度和时间为37℃1h后4℃过夜,1.0%明胶封闭,辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(酶标二抗)最适稀释倍数为l∶3 2 000,作用时间为30min。3.用45%聚乙二醇(PEG)4000融合骨髓瘤细胞和免疫脾细胞,用间接ELISA法筛选阳性孔,克隆率为81.94%,阳性克隆率45.15%。用有限稀释法筛选得到四株阳性杂交瘤细胞,分别命名为A6,B9,F2,G6。4.四株杂交瘤细胞经冻存和传代培养,证明均具有稳定分泌抗体的能力。玫瑰花环抑制试验和Western-blotting鉴定,所分泌的是针对CD58蛋白的单克隆抗体。单抗的类型为IgG1型,亲和力常数分别为3.050×10-8,4.724×10-9,6.768×10-10和3.801×10-9。5.建立了测定山羊血清中CD58的间接竞争抑制性ELISA方法,此方法的线性范围为10.0～1 000 000.0ng/mL,回归方程y=-0.1543X+1.0695,R2=0.9644,该方法灵敏度为3.087ng/mL。通过对不同生理时期山羊血清中CD58含量检测表明,怀孕山羊血清中CD58含量显着高于未发情和发情山羊(P﹤0.05)。本试验成功制备了抗CD58蛋白单克隆抗体,建立了检测山羊血清中CD58含量的间接竞争ELISA方法,对不同生理时期山羊血清中的CD58含量进行了测定,为进一步研究CD58在山羊不同生理时期的作用提供了理论依据。
牛涛[10]2006年在《重金属Pb～（2+）单克隆抗体的制备及Hg～（2+）的DTC螯合ELISA检测方法研究》文中研究表明常用的仪器型重金属检测方法在实际应用中存在诸多不便，不能满足当前重金属污染物快速检测的需要，开发快速、高效和低成本的重金属检测技术是对传统仪器型重金属检测方法的必要补充。 本论文根据我国重金属污染现状，选择环境中残留量较大的重金属Pb~(2+)和Hg~(2+)作为研究对象，试图开发出针对二者的快速检测技术。本论文包括以下两部分内容： 第一部分：重金属Pb~(2+)单克隆抗体的制备。选择CHX-A"-DTPA作为双功能螯合剂，一方面螯合重金属Pb~(2+)，另一方面通过其上的硫氰基团与载体蛋白KLH上的氨基偶联，从而制备出完全抗原Pb-CHX-A"-DTPA-KLH。用ICP-AES对此完全抗原含Pb~(2+)量进行检测，其结果为38.02mg／L；在佐剂的辅助下免疫小鼠，333.33μg／只，免疫5次后，用间接ELISA方法检测免疫小鼠抗血清，其效价为1∶163840以上，并且含Pb~(2+)抗原(Pb-CHX-A"-DTPA-BSA)检测OD值远大于无Pb(2+)抗原(CHX-A"-DTPA-BSA)；此后经过细胞融合、杂交瘤筛选以及克隆化等步骤，建立了分泌重金属Pb~(2+)的单克隆抗体的细胞株1D4；其中细胞融合率(两块板)分别为51.04％和63.54％，杂交瘤细胞阳性率为2.04％；最后用小鼠体内诱生法生产抗Pb~(2+)腹水型单抗，其效价为1∶204800，此腹水经饱和硫酸铵提纯后的蛋白质含量为19mg／ml。 第二部分：Hg~(2+)的DTC螯合ELISA检测方法研究。利用二硫代氨基对Hg~(2+)具有较高亲和力和ELISA信号放大原理，一方面在载体蛋白上构建二硫代氨基团，使之作为检测抗原包被在酶标板内；另一方面构建含Hg~(2+)和酶的竞争抗原，其与待测样品中Hg~(2+)竞争包被在酶标板内的二硫代氨基，运用竞争ELISA方法检测出样品中的Hg~(2+)含量。本实验结果表明：此方法检测限为1ppb；具有较宽的pH检测(pH5.8～7.2)范围；离子强度对检测结果影响不大，只是在较高离子强度下(1M)有少许抑止；其它金属离子对其干扰较少(除Cu~(2+)外)，可应用于环境样品Hg~(2+)的快速检测。
参考文献：
[1]. 食品中链霉素残留快速检测技术研究[D]. 奚茜. 中国计量学院. 2012
[2]. 抗链霉素单克隆抗体制备与ELISA方法的建立[D]. 王谦. 中国农业大学. 2003
[3]. 牛乳中链霉素残留检测ELISA试剂盒的研制[D]. 唐娜. 扬州大学. 2006
[4]. 培氟沙星单克隆抗体制备及其在ELISA中的应用[D]. 杜付彬. 吉林大学. 2007
[5]. 链霉素残留免疫学快速检测技术研究[D]. 范国英. 西北农林科技大学. 2007
[6]. 链霉素胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制[D]. 倪同浩. 扬州大学. 2009
[7]. 盐酸沙拉沙星单克隆抗体的制备及其在ELISA中的应用[D]. 穆国冬. 吉林大学. 2007
[8]. 氧氟沙星单克隆抗体制备及ELISA方法的建立[D]. 于海峰. 吉林大学. 2007
[9]. 抗CD58蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[D]. 高纪振. 西北农林科技大学. 2009
[10]. 重金属Pb～（2+）单克隆抗体的制备及Hg～（2+）的DTC螯合ELISA检测方法研究[D]. 牛涛. 暨南大学. 2006
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