长安大学医院 710061
【摘 要】目的 探讨靶向沉默CTGF基因对人胰腺癌细胞Panc-1侵袭的影响及可能机制。方法 通过小干扰RNA转染胰腺癌细胞Panc-1，Transwell小室侵袭试验检测各组Panc-1细胞的侵袭能力，Western blot检测及real-time PCR检测细胞侵袭相关蛋白E-cadherin、vimentin、MMP-9和uPA蛋白和mRNA的表达水平。结果 靶向沉默CTGF基因可明显抑制Panc-1细胞侵袭能力，同时明显上调E-cadherin水平，并显著下调vimentin、MMP-9和uPA蛋白及mRNA水平。结论 靶向沉默CTGF基因可抑制胰腺癌细胞Panc-1的侵袭，可能与其抑制EMT过程及侵袭相关分子MMP-9和uPA有关。
【关键词】胰腺癌；侵袭；CTGF；RNA干扰
在肿瘤细胞中，CTGF（结缔组织生长因子）被认为参与肿瘤的多种生物学过程，包括增殖、血管形成及失巢凋亡过程。最新研究发现CTGF也参与了乳腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤的形成和发展过程[1]。CTGF蛋白参与胰腺癌的增殖，运用CTGF抗体可抑制裸鼠胰腺癌模型的进展[2]，提示CTGF蛋白胰腺癌发生发展中扮演重要角色。本研究旨在通过靶向沉默胰腺癌细胞Panc-1的CTGF基因，探讨CTGF在胰腺癌侵袭中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料 人胰腺癌细胞株Panc-1细胞购来自中国科学院上海生命研究所。DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清均购自美国sigma公司。兔抗人MMP-9多克隆抗体，兔抗人uPA多克隆抗体均购自美国Bioworld公司，鼠抗人β-actin单克隆抗体，HRP标记山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG二抗均购自美国CST公司。CTGF siRNA和对照siRNA Control购自上海吉玛公司。聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），Transwell小室均购自Milliproe公司。转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。PCR引物合成于北京鼎国生物公司。
1.2 细胞培养与转染 人胰腺癌细胞Panc-1于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，37℃，5%CO2培养，2~3天用0.25%胰酶消化传代。取对数生长期的细胞进行试验。细胞分3组：常规培养的未转染正常对照组、转染siRNA Control的阴性对照组、转染siRNA Notch1基因沉默组。转染方法按Lipofectamine 2000的说明书进行。
1.3 Transwell小室侵袭试验 以预冷的DMEM与Matrigel胶1：1稀释后，取100 μl稀释胶加到Transwell上层小室中，于37℃孵育6 h。收集各组细胞，消化成单细胞悬液，用含1%胎牛血清的DMEM培养基重悬，按5×104个细胞/ml的密度100 μl接种于Transwell上层小室。吸取含10%胎牛血清的DMEM培养基500 μl加入Transwell下层小室，置于37℃，5% CO2的培养箱中培养24h。用棉签沾PBS轻轻地擦去小室上层聚碳酸酯膜上贴壁生长但未能穿过膜的细胞。将膜取出放入预先装有10%甲醇的24孔板内固定10 min。吸弃乙醇，加0.1%的结晶紫染色15 min，用PBS小心洗去多余的染料，翻转聚碳酸酯膜，小心撕下，晾干，置载玻片上加中性树胶盖玻片封片。在200倍放大倍数下随机观察并计10个视野内穿过聚碳酸酯膜的细胞数，照相记录。重复3次。
1.5 Western blot检测蛋白表达 选择生长良好的细胞1×107个，蛋白裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳，半干转膜法转至PVDF膜。5％脱脂牛奶室温封闭1 h。加一抗稀释液4℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜后加入二抗稀释液室温孵育1 h。ECL化学发光显影。
1.6 real-time PCR检测mRNA水平 用Trizol-氯仿-异丙醇法提取各组细胞总RNA。取5 μg按反转录试剂盒说明反转录为cDNA。以cDNA为模板real-time PCR扩增CTGF、E-cadherin、vimentin、MMP-9、uPA，以β-actin为内参照。各目的基因引物序列如下：CTGF：5’-ACCTGTGGGATGGGCATCT-3’，5’-CAGGCGGCTCTGCTTCT CTA-3’；E-cadherin：5’-ATTCTGATTCTGCTGCTCTTG-3’，5’-AGTCCTGGTCCTCTTCTCC-3’；vimentin：5’-AATGACCGCTTCGCCAAC-3’，5’-CCGCATCTCCTCCTCGTAG-3’；MMP-9：5’-GTG CCC AAA GAA AGG TGC TG-3’，5’-AGG AGG GGA GCC ATC CAT AG-3’；uPA：5’-ATC CTT GCT GTT CCC ACC CA -3’；5’-CTT TGA CAC CCA AGG GAG TC-3’；β-actin：5'- TTTCCAGCCTTCCTTGGGTATG -3'，5'-CACTGTGTTGGCATAGAGGTCTTTAC -3'。扩增条件如下：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环。溶解曲线参数：95℃ 60 s，72℃ 30 s，95℃ 30 s，溶解曲线测定全程每隔0.2秒采集SYBR荧光。使用基于内部参照β-actin的定量分析，采用2-△△CT法计算目的基因的相对表达量。每个实验组重复3次。
1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0进行数据处理，计量资料运用均数±标准差（ ）表示，所有实验数据的测定均重复至少3次。采用t检验。P<0.05示差异有统计学意义。
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2.结果
2.1 si RNA靶向沉默对Panc-1细胞CTGF mRNA表达的抑制作用 Western blot与real-time PCR法检测发现（图1）：与Control siRNA组相比，CTGF siRNA组细胞CTGF蛋白（t=25.64，P=0.000）及 mRNA（t=5.79，P=0.004）的表达水平均明显降低（P<0.05）（蛋白水平）；而正常对照组和Control siRNA组之间CTGF 蛋白（t=0.25，P=0.814）及mRNA（t=0.174，P=0.871）的表达水平无明显差异（P>0.05）。
图1 si RNA靶向沉默对Panc-1细胞CTGF mRNA表达的抑制作用
Fig 1 The effect of siRNA targeting for CTGF to inhibit mRNA expression of CTGF in Panc-1 cells.
A.Western blot检测 si RNA靶向沉默对Panc-1细胞CTGF 蛋白表达的抑制作用。
B.real-time PCR检测 si RNA靶向沉默对Panc-1细胞CTGF mRNA表达的抑制作用。* P＜0.05。
2.2 CTGF靶向沉默对Panc-1细胞侵袭的抑制作用 细胞转染48h后，通过Transwel法检测各组细胞的侵袭能力。结果（图2）发现，正常对照组、Control siRNA组和CTGF siRNA组穿膜细胞数分别为154.0±15.1，151.7±17.6，65.3±15.0，与Control siRNA组相比，CTGF siRNA组Panc-1细胞侵袭能力均明显受到抑制（t=6.47，P=0.003），而正常对照组和Control siRNA组之间Panc-1细胞侵袭能力无显著差异（t=0.175，P=0.870）。
图2 CTGF靶向沉默对Panc-1细胞侵袭的抑制作用
Fig.2 The effect of siRNA targeting for CTGF to inhibit invasion of Panc-1 cells.
* P＜0.05。
2.3 CTGF靶向沉默对Panc-1细胞侵袭相关基因的抑制作用 细胞转染48h后，通过Western blot与real-time PCR法检测各组细胞的E-cadherin、Vimentin、MMP-9和uPA 的蛋白及mRNA表达水平（图3）。结果显示：蛋白水平上，与Control siRNA组相比，CTGF siRNA组的E-cadherin（t=6.90，P=0.002）明显上调、而vimentin（t=29.00，P=0.000）、MMP-9（t=9.99，P=0.001）、uPA（t=7.88，P=0.001）的蛋白的相对表达强度显著下降（P<0.05）。而正常对照组和Control siRNA组比较，E-cadherin（t=0.47，P=0.664）、vimentin（t=0.511，P=0.636）、MMP-9（t=0.45，P=0.679）、uPA（t=0.17，P=0.876）的蛋白表达水平无差异（P>0.05）。
mRNA水平上，与Control siRNA组相比，CTGF siRNA组的E-cadherin（t=8.37，P=0.001）显著升高、而vimentin（t=20.68，P=0.000）、MMP-9（t=15.85，P=0.000）、uPA（t=17.29，P=0.000）mRNA的相对表达强度显著下降（P<0.05）。而正常对照组和Control siRNA组比较，E-cadherin（t=0.27，P=0.803）、vimentin（t=0.25，P=0.817）、MMP-9（t=0.383，P=0.721）、uPA（t=0.127，P=0.905）的mRNA表达水平无差异（P>0.05）。
图3 CTGF靶向沉默对Panc-1细胞侵袭相关基因的作用
Fig 3 The effect of siRNA targeting for CTGF to inhibit invasion related gene expressions in Panc-1 cells.
A.Western blot检测 CTGF靶向沉默对Panc-1细胞E-cadherin、vimentin、MMP-9和uPA蛋白表达的作用。
B.real-time PCR检测 siRNA靶向沉默对Panc-1细胞E-cadherin、vimentin、MMP-9和uPA mRNA表达的作用。* P<0.05。
3 讨论
胰腺癌是恶性程度最高的消化系统恶性肿瘤，其发病率逐年增高，具有恶性度高，早期诊断率低，，疗效欠佳，预后差等特点。目前认为CTGF可以调控多种病理生物学过程，如促进细胞外基质及结缔组织生成，促进肿瘤细胞的增殖、粘附及转移[1]。CTGF在不同肿瘤中对肿瘤存在不同的作用：如在食管癌、恶性胶质瘤、胃癌和成人急性淋巴细胞白血病中，过表达CTGF患者生存期短。而在软骨肉瘤与肺癌中，过表达CTGF患者生存期却延长。因此阐明CTGF在肿瘤中调控机制尚需大量的探索研究。
本研究发现CTGF 蛋白及mRNA在人胰腺癌细胞Panc-1中有明显表达，通过Lipofectamine2000 将CTGF的siRNA转染Panc-1细胞，与正常对照组和阴性对照组比较Panc-1 细胞CTGF蛋白及mRNA表达受到显著抑制。采用Transwell检测CTGF siRNA 瞬时转染对Panc-1细胞侵袭能力的抑制效果，结果发现细胞在靶向CTGF基因沉默后与对照组比较侵袭能力明显减弱。细胞侵袭能力与侵袭相关基因相关，CTGF本身也是一种侵袭相关基因，因此转染siRNA后导致胰腺癌Panc-1细胞侵袭能力减弱的可能机制是CTGF基因沉默后CTGF活性受到抑制，并在此过程中抑制了Panc-1的EMT过程，E-cadhein表达量增高，而vimentin表达量显著下调。
肿瘤细胞侵袭性生长中的关键事件是基质金属蛋白酶（MMPs）通过与细胞黏附分子相互作用降解细胞外基质（ECM）、促进肿瘤细胞向周围组织侵袭。MMP-9是肿瘤细胞侵袭性生长的最佳预测因子之一。本研究利用RNA 干扰技术在胰腺癌Panc-1细胞中下调CTGF的表达，导致胰腺癌细胞侵袭能力下降明显，同时伴随MMP-9和uPA表达下调，说明经靶向CTGF基因沉默后肿瘤的侵袭性降低。
总之，我们应用CTGF siRNA靶向沉默胰腺癌Panc-1细胞的CTGF表达，抑制CTGF表达，从而抑制肿瘤的侵袭能力，由此可见CTGF在胰腺癌分子病理机制中具有重要作用，并为胰腺癌治疗新手段提供理论依据。
论文作者:穆喆
论文发表刊物:《航空军医》2015年9期供稿
论文发表时间:2015/12/22
标签：细胞论文; 靶向论文; 转染论文; 蛋白论文; 沉默论文; 小室论文; 抑制论文; 《航空军医》2015年9期供稿论文;